Summary
Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.
Abstract
Eiwitconforme dynamica speelt een fundamentele rol bij de regulatie van enzymatische katalyse, ligandbinding, allosterie en signalering, die belangrijke biologische processen zijn. Begrijpen hoe de balans tussen structuur en dynamiek de biologische functie regelt, is een nieuwe grens in de moderne structurele biologie en heeft verschillende technische en methodologische ontwikkelingen aangewakkerd. Onder deze, CPMG ontspanning dispersie oplossing NMR methoden bieden unieke, atomaire-resolutie informatie over de structuur, kinetiek, en thermodynamica van eiwit conformationele evenwicht optreden op de μs-ms tijdschaal. Hier presenteert de studie gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen en analyseren van een 15N ontspanningsdispersie-experiment. Als voorbeeld wordt de pijplijn voor de analyse van de μs-ms dynamiek in het C-terminal domein van bacteriën Enzym I getoond.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) ontspanningsdispersie (RD) experimenten worden routinematig gebruikt om conformatieevenwicht te karakteriseren dat optreedt op de μs-ms tijdschaal door oplossing NMR spectroscopie1,2,3,4,5. In vergelijking met andere methoden voor onderzoek van conformatiedynamiek zijn CPMG-technieken relatief eenvoudig te implementeren op moderne NMR-spectrometers, vereisen ze geen gespecialiseerde monstervoorbereidingsstappen (d.w.z. kristallisatie, monstervriezen of uitlijning, en/of covalente vervoeging met een fluorescerende of paramagnetische tag) en bieden ze een uitgebreide karakterisering van conformationeel evenwicht dat structurele, kinetische en thermodynamische informatie over uitwisselingsprocessen retourneert. Om een CPMG-experiment over een conformatieevenwicht te laten rapporteren, moeten twee voorwaarden van toepassing zijn: i) de waargenomen NMR-spins moeten verschillende chemische verschuivingen hebben in de staten die conformationele uitwisseling ondergaan (microstaten) en (ii) de uitwisseling moet plaatsvinden op een tijdschaal variërend van ~50 μs tot ~10 ms. Onder deze omstandigheden is de waargenomen transversale ontspanningssnelheid ( 
) de som van de intrinsieke R2 (de R2 gemeten bij afwezigheid van μs-ms 
dynamiek) en de uitwisselingsbijdrage aan de transversale ontspanning (Rex). De Rex bijdrage aan R2obs kan geleidelijk worden gedoofd door de afstand tussen de 180° pulsen die het CPMG-blok van de pulssequentie vormen, te verkleinen, en de resulterende RD-curven kunnen worden gemodelleerd met behulp van de Bloch-McConnell-theorie om het chemische verschuivingsverschil tussen microstaten, de fractionele populatie van elke microstaat en de wisselkoersen tussen microstaten te verkrijgen (Figuur 1)1,2,3.
Verschillende pulssequenties en analyseprotocollen zijn gerapporteerd in de literatuur voor 15N CPMG-experimenten. Hierin wordt het protocol beschreven dat in het laboratorium is geïmplementeerd. Met name zullen de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de opzet en verwerving van de NMR-experimenten en de verwerking en analyse van de NMR-gegevens worden ingevoerd (figuur 2). Om de overdracht van het protocol naar andere laboratoria te vergemakkelijken, worden het pulsprogramma, de verwerkings- en analysescripts en een voorbeeldgegevensset geleverd als aanvullende bestanden en kunnen ze worden gedownload op (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). De meegeleverde pulssequentie bevat een fasecyclus in vier stappen in het CPMG-blok voor onderdrukking van offset-afhankelijke artefacten6 en is gecodeerd voor het verkrijgen van verschillende interleaved experimenten. Deze interleaved experimenten hebben een identieke ontspanningsperiode maar verschillende aantallen heroriënterende pulsen om verschillende CPMG-velden te bereiken7. Het is ook belangrijk op te merken dat het beschreven pulsprogramma de 15N R2 van de TROSY-component van het NMR-signaalmeet 8. Over het geheel genomen is het protocol met succes toegepast voor de karakterisering van conformationele uitwisseling in middelgrote en grote eiwitten4,5,9,10. Voor kleinere systemen (<20 kDa) is het gebruik van een op Heteronucleaire Single Quantum Coherence (HSQC) gebaseerde pulssequentie11,12 aan te raden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van het NMR-monster
- Druk een 2H,15N-labled monster van het eiwit van belang uit en zuiver het.
OPMERKING: Hoewel een 15N-gelabeld eiwitmonster kan worden gebruikt voor de verwerving van het CPMG RD-experiment, verhoogt perdeuteratie (waar mogelijk) de kwaliteit van de verkregen gegevens aanzienlijk. Protocollen voor de productie van perdeuterated eiwitten zijn beschikbaar in de literatuur13. - Buffer het gezuiverde eiwitmonster omwisselen tot een ontgaste NMR-buffer.
- Breng het NMR-monster over in de NMR-buis.
OPMERKING: De concentratie van het NMR-monster moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren en het optreden van eiwit-eiwitinteracties te minimaliseren. Over het algemeen is het typische concentratiebereik voor CPMG-experimenten 0,1-1,0 mM.
2. Eerste opzet van het NMR-experiment
- Download en pak de aanvullende bestanden uit.
- Kopieer de bestanden bits.vv en trosy_15N_cpmg.vv (in de map met de naam pulseprogram) naar de map pulse program (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
OPMERKING: Zorg ervoor dat het pad naar bits.vv op de eerste regel van het bestand trosy_15N_cpmg.vv correct is. - Open acquisitiesoftware en kopieer een eerder uitgevoerd 1H-15N HSQC-experiment naar een nieuw experiment met behulp van de opdracht edc.
- Laad met behulp van de opdracht pulproghet pulsprogramma trosy_15N_cpmg.vv in het nieuw gemaakte experiment.
- Stel het CPMG-experiment in met behulp van de instructies aan het einde van het pulsprogrammabestand (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Routinematige opzet van het NMR-experiment
- Introduceer het monster in de magneet en voer alle basisstappen uit voor het verkrijgen van een NMR-experiment: vergrendel en shim het monster; de 1 H- en 15N-kanalen matchen en afstemmen.
- Stel p1 en p7 in op de duur van respectievelijk de 1H en 15N harde 90° pulsen.
OPMERKING: Voor een optimaal resultaat is het belangrijk om de 15N 90° puls met grote zorg te kalibreren. Kalibratie wordt meestal uitgevoerd met behulp van een monster van 100 mM met 15N-gelabelde ureum in DMSO zoals beschreven in de spectrometerhandleiding. Bovendien is het mogelijk om de kalibratie rechtstreeks op het werkende NMR-monster te controleren door de eerste stap te nemen van een 1H-15N HSQC-spectrum waarin de 15N 90° puls van het eerste INEPT-blok wordt overgeschakeld op een 180° puls. Als de kalibratie correct is, moet een null worden verkregen. - Stel in het acquisitievenster het midden en de spectrale breedte in voor de afmetingen 1H en 15N.
OPMERKING: Centreer het 1H-spectrum op de frequentie van het watersignaal voor optimale wateronderdrukking. - Stel de ontspanningsvertraging (d30) in op 0,7 T2, waarbij T2 de verwachte 15N transversale ontspanningstijd van uw eiwit is.
OPMERKING: De waarde van d30 kan empirisch worden geoptimaliseerd om de beste resultaten te verkrijgen. - Gebruik de opdracht vclist om een lijst met gehele getallen te maken die overeenkomen met de parameter n in figuur 1A en figuur 1B. Zorg ervoor dat elke vermelding in de lijst overeenkomt met een ander CPMG-veld (νcpmg) volgens νcpmg = 4 x n / d30. Zorg ervoor dat het eerste getal in de lijst 0 is (dit komt overeen met het referentie-experiment waarvoor het CPMG-blok wordt overgeslagen en d30 = 0 s) en gebruik geen getallen groter dan 1.000 x d30 / 4. Getallen die groter zijn dan deze drempel resulteren in νcpmg > 1 kHz en kunnen de sonde beschadigen.
- Stel l8 in op het aantal items in de vclist, l3 op het aantal reële punten voor de indirecte dimensie (meestal is een bereik van 64-200 ingesteld op l3) en 1 td gelijk aan l8 x l3 x 2.
OPMERKING: Voer de stappen 3.7-3.11 uit om de wateronderdrukking te optimaliseren. - Stel de ontvangerwinst (rg) in op 1; open het pulsprogrammabestand (edcpul), ga naar regel 91, verwijder de puntkomma voorafgaand aan goto 999en sla het bestand op.
- Met behulp van de opdracht gs passen de parameters spdb0 (of spdw0) aan om de intensiteit van het FID-signaal te minimaliseren.
- Introduceer de puntkomma op regel 91 van het pulsprogrammabestand opnieuw en sla het bestand op.
- Herhaal de stappen 3.7-3.9 om spdb11 (lijn 168 van het pulsprogrammabestand), spdb2 (lijn 179 van het pulsprogrammabestand) en pldb2 (regel 184 van het pulsprogrammabestand) te optimaliseren.
- Voer de opdracht rga uit om de versterking van de ontvanger te optimaliseren.
- Stel het aantal scans (ns) in op een veelvoud van 8.
- Voer de opdracht zg uit om het experiment te starten.
4. Verwerking en analyse van de NMR-gegevens
- Kopieer de map met de naam Proces (Aanvullende bestanden) naar de map met het ser-bestand.
- Gebruik de bestanden sep_fid.com en ft2D.com om de NMR-gegevens te verwerken.
OPMERKING: Instructies voor het bewerken van de verwerkingsscripts worden gegeven in de sep_fid.com- en ft2D.com bestanden. - Open de ucsf-bestanden in de map CPMG_Sparky_files in Sparky.
OPMERKING: De ucsf-bestanden worden gemaakt door de verwerkingsscripts. Er is één ucsf-bestand voor elk item in de vclist. Het eerste ucsf-bestand (test_1.ucsf) bevat het referentie-experiment. De daaropvolgende ucsf-bestanden (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) worden besteld van de laagste tot de grootste waarde van νcpmg. - Kies de NMR-kruispieken op het referentie-NMR-spectrum (test_1.ucsf).
- Selecteer alle gepickte kruispieken met de sparky-opdracht pa.
- Voer de Sparky-opdracht rhuit. Met deze opdracht wordt een dialoogvenster geopend. Selecteer de optiehoogten op dezelfde positie in elk spectrum. Klik op Setup en bekijk alle NMR spectra. Klik op Bijwerken en sla het uitvoerbestand op in de werkmap. Het uitvoerbestand bevat de matrix van de signaalintensiteiten over alle geopende NMR-spectra.
OPMERKING: Nauwkeurigere protocollen die lineshape fitting gebruiken voor het herstellen van intensiteiten van interleaved pseudo-3D-experimenten zijn beschreven in de literatuur14. Vrij beschikbare software voor lineshape fitting is beschikbaar op https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) en binnen NMRPipe (nLinLS module) en SPARKY (it module). - Zet voor elk CPMG-veld de signaalintensiteiten om in R2-snelheden met behulp van de formule
, waarbij I0 en Id30 respectievelijk de intensiteit van de referentie (vc = 0) en ontspannen (vc > 0) NMR-spectra zijn.
OPMERKING: In de aanvullende bestandenwordt een sjabloon van het spreadsheetbestand (R2_calc.xls) verstrekt om de signaalintensiteiten naar R2-tarieven te converteren en de RD-profielen te visualiseren. - Lees het geluidsniveau in het referentiespectrum met behulp van de Sparky-opdracht st en verspreid de fout op de R2-snelheden.
OPMERKING: In de aanvullende bestandenwordt een sjabloon van het spreadsheetbestand (R2_calc.xls) verstrekt die wordt gebruikt om de fout op de gemeten R2-tarieven door te geven.
, waarbij I0 en Id30 respectievelijk de intensiteit van de referentie (vc = 0) en ontspannen (vc > 0) NMR-spectra zijn.5. Rd-bochten monteren
- Kopieer de map met de naam RD_fitting (Aanvullende bestanden) naar de werkmap.
- Voor elke toegewezen NMR-piek, schatting Rex door het berekenen van de
. en zijn de R 
2 tarieven gemeten op de laagste en hoogste νcpmg in de vclist.
- Inspecteer de RD-curven visueel met Rex groter dan twee keer de geschatte fout en gooi alle RD-curven weg die te luidruchtig zijn om nauwkeurig te worden gemodelleerd.
OPMERKING: Ruis op Rex kan worden doorgegeven door de fouten op en . - Bereid een invoerbestand voor het montagescript voor met behulp van alle RD-curven met Rex groter dan twee keer de geschatte fout.
OPMERKING: Gedetailleerde instructies voor de voorbereiding van de invoerbestanden zijn opgenomen in de passcripts. Voorbeeldinvoerbestanden worden geleverd als aanvullende bestanden. Gewoonlijk worden RD-gegevens gemeten op twee verschillende statische velden en tegelijkertijd gemonteerd. In dit protocol zijn twee verschillende invoerbestanden vereist (Aanvullende bestanden). - Pas de RD-gegevens aan met behulp van de scripts in Aanvullende bestanden.
OPMERKING: Er zijn twee verschillende scripts beschikbaar om respectievelijk een op residu gebaseerde of globale pasvorm van de RD-curven uit te voeren. Beide scripts passen in de RD-curven met behulp van een uitwisselingsmodel met twee plaatsen en de Carver-Richards-vergelijking. Meer gedetailleerde instructies zijn te zien in de montagescripts. Aanvullende softwarepakketten zoals Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) en CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) zijn beschikbaar om gegevensmontage uit te voeren met behulp van de Block-McConnell-vergelijkingen. - Test de betrouwbaarheid van de gemonteerde parameters die de verlaagde χ2 schatten als functie van pb en kex.
OPMERKING: De verlaagde χ2 wordt in het uitvoerbestand opgenomen. pb en kex kunnen worden beperkt tot specifieke waarden met behulp van onder- en bovengrenzen in de montageprocedures. In onze scripts zijn de onder- en bovengrenzen voor pb respectievelijk lb(2) en ub(2). De onder- en bovengrenzen voor kex zijn respectievelijk lb(3) en ub(3). - Schat de fout op de gemonteerde parameters. Dit kan worden gedaan door de waarde van MC_fac in het script in te stellen op 1 en de fitting meerdere keren te herhalen (meestal >20 herhalingen). De fout op elke parameter wordt geschat als de standaardafwijking van de verdeling.
OPMERKING: Als u MC_fac instelt op 1, wordt een synthetische gegevensset gegenereerd waarin een Gaussiaanse gedistribueerde fout (berekend op basis van de experimentele fout) wordt toegevoegd aan de experimentele gegevens.
. en zijn de R 
2 tarieven gemeten op de laagste en hoogste νcpmg in de vclist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol resulteert in de verwerving van RD-profielen voor elke piek in het 1H-15N TROSY-spectrum (figuur 3A). Op basis van de verworven RD-profielen is het mogelijk om de uitwisselingsbijdrage aan de 15N transversale ontspanning van elke backboneamidegroep te schatten (figuur 3A, 3B). Door de Rex op de 3D-structuur van het onderzochte eiwit te plotten, is het mogelijk om de structurele regio's die conformatie-uitwisseling ondergaan op de μs-ms-tijdschaal te identificeren (figuur 3C). Modellering van de RD-curven met behulp van de Carver-Richards-vergelijking retourneert thermodynamische en kinetische parameters op het uitwisselingsproces, zoals de fractionele populaties van de staten in evenwicht en de wisselkoers tussen deze toestanden (Figuur 1, Figuur 3D). De temperatuurafhankelijkheid van deze thermodynamische en kinetische parameters (verkregen door het verwerven van RD-experimenten bij meerdere experimentele temperaturen) kan worden gemodelleerd met behulp van respectievelijk de vergelijkingen van Van't Hoff en Eyring om gedetailleerde informatie te verkrijgen over de energetica van de conformationele uitwisseling (Figuur 3E)9,10.
Figuur 1: Overzicht van het CPMG RD-experiment. (A) Schematische weergave van het CPMG-blok dat wordt gebruikt voor de verwerving van RD-gegevens. De 180° pulsen worden weergegeven als zwarte rechthoeken. De operator 
geeft de magnetisatie aan die het CPMG-blok in- en uitgaat. Het CPMG-veld wordt bepaald door de afstand tussen de daaropvolgende herfocuspulsen (2τ). (B) Bij een meting van twee tijdstippen wordt de ontspanningsvertraging (waarbij het CPMG-blok wordt toegepast) constant gehouden en wordt het CPMG-veld gevarieerd door de waarden van n (het aantal keren dat het CPMG-blok wordt toegepast tijdens de ontspanningsvertragingsperiode) en τ. (C) Schematische weergave van een evenwicht tussen twee plaatsen tussen de conformaties A en B. De wisselkoersconstante (kex) is de som van de termijn- en omgekeerde koersconstanten respectievelijk kab en kba). pa en pb (= 1 - pa) zijn de fractionele populaties van respectievelijk de soorten A en B. Δωab is het chemische verschuivingsverschil tussen conformaties A en B. (D) Gesimuleerde RD-krommen voor uitwisselingsprocessen die zich in het bereik bevinden dat toegankelijk is voor CPMG (linksboven), te snel om te worden gedetecteerd door CPMG (rechtsboven), te traag om te worden gedetecteerd door CPMG (rechtsonder) en met een Δωab te klein om te worden gedetecteerd door CPMG (linksonder). De pb-waarde is ingesteld op 3%. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Hoofdpijplijn voor acquisitie en analyse van RD-gegevens. Schematische weergave van de werkstroom die in dit protocol wordt beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: μs-ms dynamica van EIC door CPMG RD experimenten. (A) Voorbeeld 15N RD profielen gemeten bij 40 °C en 800 MHz voor EIC volgens het hier beschreven protocol. De schatting van Rex wordt rood weergegeven. ( B) Rex-waarden worden uitgezet ten opzichte van de residuindex en (C) op de röntgenstructuur van het enzym om residuen te identificeren die conforme uitwisseling ondergaan. (D) NMR-signalen met Rex groter dan de fout worden gemodelleerd (met behulp van het in aanvullende bestandenverstrekte script ) om de kinetiek (kab en kba) en thermodynamica (pb) van het evenwicht te verkrijgen. (E) Het verkrijgen van RD-gegevens bij meerdere temperaturen retourneert informatie over de energetica van de conformatieverandering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N RD-gegevens over eiwitten. Met name de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de meting van de NMR-gegevens en de analyse van de RD-profielen komen aan bod. Hieronder worden enkele belangrijke aspecten met betrekking tot de verwerving en analyse van RD-experimenten besproken. Voor een meer diepgaande beschrijving van het experiment en de gegevensanalyse wordt echter een zorgvuldige bestudering van de oorspronkelijke literatuur ten zeerste aanbevolen3,8,11,15,16.
Bij het opstellen van het NMR-monster is het uiterst belangrijk om er rekening mee te houden dat de aanwezigheid van een kleine (<1% bevolkte) toestand in ruil voor de belangrijkste, NMR-zichtbare soorten op de μs-ms-tijdschaal detecteerbare RD-profielen zal genereren1. Daarom wordt aanbevolen om een sterk gezuiverde eiwitvoorraad (>90% zuiver) te gebruiken om de aanwezigheid van verontreinigingen te voorkomen die voorbijgaande complexen kunnen vormen met het onderzochte systeem. Bovendien is het bij het onderzoeken van de conformationele dynamiek in eiwit-ligandcomplexen belangrijk om verzadigende concentraties ligand te gebruiken om de aanwezigheid van valse RD-profielen te voorkomen die afkomstig zijn van de kinetiek van ligandbinding.
Bij het werken met systemen met een hoog molecuulgewicht (>20 kDa) is het ook raadzaam (hoewel niet nodig) om perdeuterated eiwitmonsters en de TROSY-pulssequentie te gebruiken die met het huidige protocol wordt gepresenteerd om de transversale ontspanningssnelheid te verminderen en de ontspanningsperiode te maximaliseren (d30 in ons pulsprogramma). Inderdaad, als de laagst verkrijgbare νcpmg. = 4/d30, met behulp van een lange ontspanningsperiode maakt het mogelijk om R2-gegevens te verkrijgen bij kleine νcpmg, waarbij de uitwisselingsbijdrage aan de R2 maximaal is. In dit verband is het ook belangrijk om te vermelden dat een pulssequentie vergelijkbaar met die van het huidige protocol aanwezig is in het standaard pulssequentieportfolio van de spectrometer (bestandsnaam: trhncorexf3gp). Het belangrijkste verschil tussen de twee bestanden is dat de standaardsequentie is gebaseerd op een TROSY-HNCO-experiment, terwijl ons experiment is gebaseerd op een TROSY-HSQC-experiment en geen 13C-etikettering van het monster vereist.
Een ander punt om goed te overwegen is de aanschaftemperatuur. Aangezien de RD-gegevens meestal op meerdere statische velden worden gemeten, is het van cruciaal belang dat de aanschaftemperatuur consistent is tussen alle gebruikte spectrometers. Daarom wordt ten zeerste aanbevolen om de temperatuurkalibratie te controleren voordat u het experiment instelt.
Voor wat betreft de analyse van de RD-curven, is het belangrijk om te benadrukken dat de procedures en passcripts die hier worden gepresenteerd, gebruik maken van de Carver-Richards-vergelijkingen. Hoewel dit de meest voorkomende procedure is die in de literatuur wordt toegepast voor kwantitatieve modellering van de RD-gegevens, bevatten de Carver Richards-vergelijkingen een aantal benaderingen en zijn ze beperkt tot het geval van uitwisseling tussen twee plaatsen17. Indien voor een bepaalde gegevensset strengere Bloch-McConnell-matrices voor gegevensmodellering vereist zijn , dient de montageprocedure dienovereenkomstig te worden gewijzigd18,19,20. In het bovenstaande protocol worden een paar vrij beschikbare softwarepakketten vermeld die gegevensmodellering uitvoeren met behulp van de Bloch-McConnell-theorie.
Ten slotte moet worden opgemerkt dat, hoewel ons manuscript zich uitsluitend richt op de toepassing van 15N RD-gegevens voor het onderzoek naar eiwitconformatiedynamiek, verschillende andere experimenten in de literatuur werden beschreven om RD-curven op verschillende kernen en andere biologische en niet-biologische moleculaire systemen te meten18,19,21,22,23. Met name het gebruik van verschillende kernen is uiterst belangrijk , omdat het een dichtere bemonstering van de eiwitstructuur mogelijk maakt en informatie verschaft over de dynamiek van de zijketen die grotendeels buiten beschouwing wordt gelaten door het 15N-gebaseerde experiment dat in dit protocol5,21,23wordt gepresenteerd .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd. Wij verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen van NIGMS R35GM133488 en van de Roy J. Carver Charitable Trust aan V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
