Summary
Här ges en detaljerad beskrivning av protokollet som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N avslappningsspridningsprofiler genom lösning NMR-spektroskopi.
Abstract
Proteinkonformationsdynamik spelar grundläggande roller vid reglering av enzymatisk katalys, ligandbindning, allostery och signalering, som är viktiga biologiska processer. Att förstå hur balansen mellan struktur och dynamik styr den biologiska funktionen är en ny gräns inom modern strukturbiologi och har antänt flera tekniska och metodologiska utvecklingar. Bland dessa ger CPMG-avslappningsdispersionslösning nmr-metoder unik atomupplösningsinformation om struktur, kinetik och termodynamik av proteinkonform ekvilibrier som förekommer på μs-ms-tidsskalan. Här presenterar studien detaljerade protokoll för förvärv och analys av ett 15 N avslappningsspridningsexperiment. Som ett exempel visas pipelinen för analys av μs-ms-dynamiken i C-terminaldomänen för bakterie enzym I.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) avslappning dispersion (RD) experiment används på en rutinmässig bas för att karakterisera conformational equilibria förekommer på μs-ms tidsskalan genom lösning NMR spektroskopi1,2,3,4,5. Jämfört med andra metoder för undersökning av konformationsdynamik är CPMG-tekniker relativt lätta att genomföra på moderna NMR-spektrometrar, kräver inte specialiserade provberedningssteg (dvs. kristallisering, provfrysning eller justering och/eller kovalent konjugation med fluorescerande eller paramagnetisk tagg) och ger en omfattande karakterisering av konform balansomvandling som returnerar strukturell, kinetisk och termodynamisk information om utbytesprocesser. För att ett CPMG-experiment ska kunna rapportera om en konformationsjämvikt måste två villkor gälla: i) de observerade NMR-spinn måste ha olika kemiska förskjutningar i de stater som genomgår konformationsutbyte (mikrostater) och ii) utbytet måste ske i en tidsskala som sträcker sig från ~50 μs till ~10 ms. Under dessa förhållanden är den observerade tvärgående avslappningshastigheten ( 
) summan av den inneboende R2 (R2 mätt i avsaknad av μs-ms-dynamik) 
och utbytesbidraget till den tvärgående avslappningen (Rex). Rex-bidraget till R2obs kan gradvis släckas genom att minska avståndet mellan de 180° pulserna som utgör CPMG-blocket i pulssekvensen, och de resulterande RD-kurvorna kan modelleras med hjälp av Bloch-McConnell-teorin för att erhålla den kemiska skiftskillnaden mellan mikrostater, den fraktionerade populationen av varje mikrostat och växelkurserna mellan mikrostater (Figur 1)1,2,3.
Flera olika pulssekvenser och analysprotokoll har rapporterats i litteraturen för 15N CPMG experiment. Häri beskrivs det protokoll som implementeras i laboratoriet. I synnerhet kommer de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, som inrättats och insamlar NMR-experimenten, och bearbetning och analys av NMR-data att införas (figur 2). För att underlätta överföringen av protokollet till andra laboratorier tillhandahålls pulsprogrammet, bearbetnings- och analysskripten och ett exempel på datauppsättning som kompletterande filer och finns tillgängliga för nedladdning på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medföljande pulssekvensen innehåller en fyrastegsfascykel i CPMG-blocket för undertryckande av offsetberoendeartefakter 6 och den är kodad för förvärv av flera interfolierade experiment. Dessa interfolierade experiment har en identisk avslappningsperiod men olika antal omfokuseringspulser för att uppnå olika CPMG-fält7. Det är också viktigt att märka att det beskrivna pulsprogrammet mäter 15N R2 av TROSY-komponenten i NMR-signalen8. Sammantaget har protokollet framgångsrikt tillämpats för karakterisering av konformationsutbyte i medelstora och stora proteiner4,5,9,10. För mindre system (<20 kDa) är det lämpligt att använda en Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-baseradpulssekvens 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av NMR-provet
- Uttryck och rena ett 2H,15N-lablat prov av proteinet av intresse.
OBS: Även om ett 15N-märkt proteinprov kan användas för förvärv av CPMG RD-experimentet, ökar perdeuterationen (om möjligt) dramatiskt kvaliteten på de erhållna uppgifterna. Protokoll för produktion av perdeuterated proteiner finns i litteraturen13. - Buffertväxlar det renade proteinprovet till en avgasad NMR-buffert.
- Överför NMR-provet till NMR-röret.
OBS: Koncentrationen av NMR-provet måste optimeras noggrant för att maximera signal-till-brusförhållandet och minimera förekomsten av proteinproteininteraktioner. I allmänhet är det typiska koncentrationsområdet för CPMG-experiment 0,1-1,0 mM.
2. Första gången NMR-experimentet sätts upp
- Ladda ner och packa upp tilläggsfilerna.
- Kopiera filerna bits.vv och trosy_15N_cpmg.vv (finns i mappen med namnet pulseprogram) till pulsprogramkatalogen (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
Kontrollera att sökvägen till bits.vv som visas på den första raden i filen trosy_15N_cpmg.vv är korrekt. - Öppna förvärvsprogram och kopiera ett tidigare kört 1H-15N HSQC-experiment till ett nytt experiment med kommandot edc.
- Med kommandomassarog laddardu pulsprogrammet trosy_15N_cpmg.vv i det nyskapade experimentet.
- Ställ in CPMG-experimentet med hjälp av instruktionerna i slutet av pulsprogramfilen (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Rutininförande av NMR-experimentet
- Introducera provet i magneten och utför alla grundläggande steg för förvärv av alla NMR-experiment: lås och shim provet; matcha och justera kanalerna 1H och 15N.
- Ställ in p1 och p7 på varaktigheten av 1H respektive 15N hårda 90° pulser.
OBS: För optimala resultat är det viktigt att kalibrera 15N 90° pulsen med stor försiktighet. Kalibrering utförs vanligtvis med hjälp av ett 100 mM prov av 15N-märkt urea i DMSO enligt beskrivningen i spektrometerhandboken. Dessutom är det möjligt att dubbelkolla kalibreringen direkt på det fungerande NMR-provet genom att förvärva den första satsen av ett 1H-15N HSQC-spektrum där 15N 90° pulsen i det första INEPT-blocket är växlad till en 180° puls. Om kalibreringen är korrekt ska en null erhållas. - I anskaffningsfönstret ställer du in mitt- och spektralbredden för dimensionerna 1H och 15N.
OBS: Centrera 1H-spektrumet vid vattensignalens frekvens för optimal vattendämpning. - Ställ in avslappningsfördröjningen (d30) som motsvarar 0,7 T2, där T2 är den förväntade 15N tvärgående avslappningstiden för ditt protein.
OBS: Värdet på d30 kan optimeras empiriskt för att uppnå bästa resultat. - Använd kommandovclisten för att skapa en lista med heltalsnummer som motsvarar parametern n i figur 1A och figur 1B. Se till att varje post i listan motsvarar ett annat CPMG-fält (νcpmg)enligt νcpmg = 4 x n / d30. Se till att det första talet i listan är 0 (detta motsvarar referensexperimentet för vilket CPMG-blocket hoppas över och d30 = 0 s) och inte använda tal som är större än 1 000 x d30 / 4. Tal som är större än detta tröskelvärde resulterar i νcpmg > 1 kHz och kan skada sonden.
- Ange l8 till antalet poster i vclist, l3 till antalet verkliga punkter för den indirekta dimensionen (vanligtvis är intervallet 64-200 inställt för l3) och 1 td lika med l8 x l3 x 2.
OBS: Utför stegen 3.7-3.11 för att optimera vattendämpningen. - Ställ in mottagarens förstärkning (rg) på 1; öppna pulsprogramfilen (edcpul), gå till rad 91, ta bort semikolonet före goto 999och spara filen.
- Justera parametrarna spdb0 (eller spdw0) med hjälp av kommandot gs för att minimera intensiteten hos FID-signalen.
- Återinför semikolonet på rad 91 i pulsprogramfilen och spara filen.
- Upprepa stegen 3.7-3.9 för att optimera spdb11 (rad 168 i pulsprogramfilen), spdb2 (rad 179 i pulsprogramfilen) och pldb2 (rad 184 i pulsprogramfilen).
- Kör kommando rga för att optimera mottagarens förstärkning.
- Ställ in antalet skanningar (ns) till en multipel av 8.
- Kör kommandot zg för att starta experimentet.
4. Behandling och analys av NMR-uppgifter
- Kopiera mappen Process ( Kompletterande filer )tillkatalogen som innehåller ser-filen.
- Använd filerna sep_fid.com och ft2D.com för att bearbeta NMR-data.
Anvisningar om hur bearbetningsskripten ska redigeras finns i de sep_fid.com och ft2D.com filerna. - Öppna ucsf-filerna i katalogen CPMG_Sparky_files i Sparky.
UCSF-filerna skapas av bearbetningsskripten. Det finns en ucsf-fil för varje post i vclist. Den första ucsf-filen (test_1.ucsf) innehåller referensexperimentet. De efterföljande ucsf-filerna (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) beställs från det lägsta till det största värdet av νcpmg. - Välj NMR-korstopparna på referens-NMR-spektrumet (test_1.ucsf).
- Markera alla plockade korstoppar med kommandot Sparky pa.
- Kör kommandot Sparky rh. Det här kommandot öppnar ett dialogfönster. Välj alternativhöjderna på samma position i varje spektrum. Klicka på Installationsprogrammet och kontrollera alla NMR-spektra. Klicka på Uppdatera och spara utdatafilen i arbetskatalogen. Utdatafilen innehåller matrisen för signalintensiteterna över alla öppnade NMR-spektra.
OBS: Mer exakta protokoll som använder lineshape montering för att återställa intensiteter från interfolierade pseudo-3D experiment har beskrivits i litteraturen14. Fritt tillgänglig programvara för lineshape-montering finns på https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) och inom NMRPipe (nLinLS-modul) och SPARKY (IT-modul). - För varje CPMG-fält konverterar du signalintensiteterna till R2-hastigheter
med formeln, där I0 och Id30 är referensens intensitet (vc = 0) respektive avslappnad (vc > 0) NMR-spektra.
OBS: I tilläggsfilernatillhandahålls en mall för kalkylbladsfilen (R2_calc.xls) som används för att konvertera signalintensiteterna till R2-priser och visualisera rd-profilerna. - Läs ljudnivån i referensspektrumet med kommandot Sparky st och sprid felet på R2-satserna.
OBS: I tilläggsfilernatillhandahålls en mall för kalkylbladsfilen (R2_calc.xls) som används för att sprida felet på de uppmätta R 2-satserna.
med formeln, där I0 och Id30 är referensens intensitet (vc = 0) respektive avslappnad (vc > 0) NMR-spektra.5. Montering av RD-kurvor
- Kopiera mappen med namnet RD_fitting (Kompletterande filer) till arbetskatalogen.
- För varje tilldelad NMR-topp, uppskatta Rex genom att beräkna
. och är R 
2-satserna mätta vid den lägsta och högsta νcpmg i vclist.
- Inspektera rd-kurvorna visuellt med Rex större än två gånger det uppskattade felet och ignorera alla RD-kurvor som är för bullriga för att modelleras korrekt.
Obs: Brus påR ex kan spridas från felen på och . - Förbered en indatafil för monteringsskriptet med alla RD-kurvor med Rex större än två gånger det uppskattade felet.
OBS: Detaljerade instruktioner om förberedelsen av indatafilerna finns i monteringsskripten. Exempel på indatafiler tillhandahålls som kompletterande filer. Vanligtvis mäts RD-data vid två olika statiska fält och monteras samtidigt. I det här protokollet krävs två olika indatafiler (Kompletterande filer). - Anpassa rd-data med hjälp av skripten i kompletterande filer.
OBS: Två olika skript tillhandahålls för att utföra en restbaserad eller en global passform av RD-kurvorna. Båda skripten passar RD-kurvorna med hjälp av en utbytesmodell med två plats och Carver-Richards-ekvationen. Mer detaljerade instruktioner finns i monteringsskripten. Ytterligare programvarupaket som Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) och CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) finns tillgängliga för att utföra datamontering med hjälp av Block-McConnell-ekvationerna. - Testa tillförlitligheten hos de monterade parametrarna som uppskattar den reducerade χ2 som en funktion av pb och kex.
OBS: Den reducerade χ2 finns i utdatafilen. pb och kex kan begränsas till specifika värden med hjälp av nedre och övre gränser i monteringsförfarandena. I våra skript är de nedre respektive övre gränserna för pb lb(2) respektive ub(2). De nedre och övre gränserna för kex är lb(3) respektive ub(3). - Uppskatta felet på de monterade parametrarna. Detta kan göras genom att ställa in värdet MC_fac i skriptet till 1 och upprepa monteringen flera gånger (vanligtvis >20 upprepningar). Felet på varje parameter uppskattas som standardavvikelsen för fördelningen.
OBS: Om MC_fac till 1 genereras en syntetisk datauppsättning där ett gaussiskt distribuerat fel (beräknat baserat på experimentfelet) läggs till i experimentella data.
. och är R 
2-satserna mätta vid den lägsta och högsta νcpmg i vclist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som beskrivs här resulterar i förvärv av RD-profiler för varje topp i 1H-15N TROSY-spektrumet (Figur 3A). Av de förvärvade rd-profilerna är det möjligt att uppskatta utbytesbidraget till den tvärgående avslappningen på 15N av varje ryggrad mitt i gruppen(figur 3A,3B). Genom att rita Rex på 3D-strukturen hos det protein som under utredning är det möjligt att identifiera de strukturella regioner som genomgår konformationsutbyte på μs-ms-tidsskalan (figur 3C). Modellering av RD-kurvorna med carver-Richards-ekvationen returnerar termodynamiska och kinetiska parametrar på utbytesprocessen, såsom de fraktionerade populationerna i tillstånden i jämvikt och växelkursen mellan dessa tillstånd (figur 1, figur 3D). Temperaturberoendet av dessa termodynamiska och kinetiska parametrar (som erhålls genom att förvärva RD-experiment vid flera experimentella temperaturer) kan modelleras med hjälp av ekvationerna van't Hoff respektive Eyring för att få detaljerad information om energierna i konformationsutbytet(figur 3E)9,10.
Figur 1: Översikt över CPMG RD-experimentet. (A) Schematisk vy över CPMG-blocket som används för förvärv av RD-data. 180° pulserna visas som svarta rektanglar. Operatorn 
anger magnetiseringen som går in i och lämnar CPMG-blocket. CPMG-fältet bestäms av avståndet mellan efterföljande omfokuseringspulser (2τ). B)Vid en tvåpunktsmätning hålls avslappningsfördröjningen (under vilken CPMG-blocket appliceras) konstant och CPMG-fältet varieras genom att man varierar värdena för n (antalet gånger CPMG-blocket appliceras under avslappningsperioden) och τ. C)Schematisk representation av en balans på två plats mellan konformationerna A och B. Växelkurskonstanten (kex)är summan av termins- och reverse rate-konstanterna kab respektive kba). pa och pb (= 1 -p a)är de fraktionerade populationerna av arter A respektive B. Δωab är den kemiska skiftskillnaden mellan konformationerna A och B. (D) Simulerade RD-kurvor för utbytesprocesser som ligger inom det område som är tillgängligt för CPMG (uppe till vänster), för snabbt för att detekteras av CPMG (uppe till höger), för långsamt för att detekteras av CPMG (längst ner till höger), och med en Δωab för liten för att detekteras av CPMG (längst ner till vänster). Pb-värdet fastställdes till 3 %. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Huvudpipeline för förvärv och analys av rd-data. Schematisk representation av arbetsflödet som beskrivs i det aktuella protokollet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:EIC:s dynamik genom CPMG RD-experiment. (A) Exempel 15N RD-profiler uppmätta vid 40 °C och 800 MHz för EIC enligt det protokoll som beskrivs här. Uppskattningen av Rex visas i rött. B)Rex-värden ritas jämfört med resthaltsindexet ochCpå enzymets röntgenstruktur för att identifiera resthalter som genomgår konformationsutbyte. (D) NMR-signaler med Rex större än felet modelleras (med hjälp av skriptet i kompletterande filer)för att erhålla jämviktens kinetik (kab och kba)och termodynamik (pb). (E) Förvärv av RD-data vid flera temperaturer returnerar information om energierna i konformationsförändringen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver det protokoll som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N RD-data om proteiner. I synnerhet omfattas de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, mätning av NMR-data och analys av fjärrskrivbordsprofilerna. Nedan diskuteras några viktiga aspekter kring förvärv och analys av RD-experiment. Men för en mer djupgående beskrivning av experimentet och dataanalysen rekommenderas noggrant studier av den ursprungliga litteraturenstarkt 3,8,11,15,16.
Vid utarbetandet av NMR-provet är det oerhört viktigt att tänka på att förekomsten av ett mindre (<1% befolkat) tillstånd i utbyte med de större, NMR synliga arterna på μs-ms-tidsskalan kommer att generera detekterbaraRD-profiler 1. Därför rekommenderas att använda ett mycket renat proteinlager (>90% rent) för att undvika förekomst av föroreningar som kan bilda övergående komplex med det undersökta systemet. Dessutom, om man undersöker konformationsdynamik i protein-ligand komplex, är det viktigt att använda mättande koncentrationer av ligand för att undvika förekomsten av falska RD profiler som härrör från kinetik av ligand bindande.
När du arbetar med system med hög molekylvikt (>20 kDa) är det också tillrådligt (men inte nödvändigt) att använda perdeuterated proteinprover och TROSY-pulssekvensen som presenteras med det nuvarande protokollet för att minska den tvärgående avslappningshastigheten och maximera avslappningsperioden (d30 i vårt pulsprogram). I själva tiden, som den lägsta erhållna νcpmg. = 4/d30, med en lång avslappningsperiod gör det möjligt att förvärva R2-data vid små νcpmg, där utbytesbidraget till R2 är som mest. I detta avseende är det också viktigt att nämna att en pulssekvens som liknar den som medföljer det nuvarande protokollet finns i spektrometerns standardportfölj för pulssekvenser (filnamn: trhncorexf3gp). Den största skillnaden mellan de två filerna är att standardsekvensen baseras på ett TROSY-HNCO-experiment, medan vårt experiment bygger på ett TROSY-HSQC-experiment och inte kräver 13C märkning av provet.
En annan fråga att tänka noga på är förvärvstemperaturen. Eftersom rd-data vanligtvis mäts vid flera statiska fält är det faktiskt viktigt att anskaffningstemperaturen är konsekvent mellan alla spektrometrar som används. Därför rekommenderas det starkt att kontrollera temperaturkalibreringen innan du ställer in experimentet.
För vad som rör analysen av RD-kurvorna är det viktigt att betona att de procedurer och passande skript som presenteras här använder Carver-Richards ekvationer. Även om detta är det vanligaste förfarandet som tillämpas i litteraturen för kvantitativ modellering av RD-data, innehåller Carver Richards ekvationer ett antal approximationer och är begränsade till två-plats utbytesfall17. Om en viss datauppsättning kräver de strängare Priserna bloch-McConnell för datamodellering, bör monteringsförfarandet ändras i enlighetdärmed 18,19,20. I protokollet ovan listas några fritt tillgängliga programvarupaket som utför datamodellering med Bloch-McConnell-teorin.
Slutligen bör det noteras att även om vårt manuskript fokuserar enbart på tillämpningen av 15N RD-data för undersökning av proteinkonformationsdynamik, beskrevs flera andra experiment i litteraturen för att mäta RD-kurvor på olika kärnor och andra biologiska och icke-biologiska molekylära system18,19,21,22,23. I synnerhet är användningen av olika kärnor extremt viktig, eftersom det möjliggör en tätare provtagning av proteinstrukturen och ger information om sidokedjedynamik som till stor del ignoreras av det 15N-baserade experimentet som presenteras i detta protokoll5,21,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har läst och godkänt manuskriptet. Vi förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från NIGMS R35GM133488 och från Roy J. Carver Charitable Trust till V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
