כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms
במאמר זה
סיכום
תקציר
דינמיקה קונפורמציה של חלבונים ממלאת תפקידי יסוד בוויסות קטליזה אנזימטית, כריכת ליגנד, אלוסטריה ואיתות, שהם תהליכים ביולוגיים חשובים. הבנת האופן שבו האיזון בין מבנה לדינמיקה שולט בתפקוד הביולוגי היא גבול חדש בביולוגיה המבנית המודרנית והציתה מספר התפתחויות טכניות ומתודולוגיות. בין אלה, פתרון פיזור הרפיה CPMG שיטות NMR לספק ייחודי, מידע ברזולוציה אטומית על המבנה, קינטיקה, תרמודינמיקה של שיווי משקל קונפורמי חלבון המתרחשים על ציר הזמן μs-ms. כאן, המחקר מציג פרוטוקולים מפורטים לרכישה וניתוח של ניסוי פיזור הרפיה 15N. כדוגמה, הצינור לניתוח הדינמיקה μs-ms בתחום C-מסוף של אנזים חיידקים אני מוצג.
מבוא
Carr-פרסל Meiboom-Gill (CPMG) הרפיה פיזור (RD) ניסויים משמשים על בסיס שגרתי לאפיון שיווי משקל קונפורמי המתרחשים על ציר הזמן μs-ms על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR1,2,3,4,5. בהשוואה לשיטות אחרות לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית, טכניקות CPMG קלות יחסית ליישום בספקטרומטרים מודרניים של NMR, אינן דורשות שלבי הכנה מיוחדים לדוגמה (כלומר, התגבשות, הקפאה או יישור מדגם, ו/או הטיה קוולנטית עם תג פלואורסצנטי או פרמגנטי), ומספקות אפיון מקיף של שיווי משקל קונפורמי המחזיר מידע מבני, קינטי ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדגם NMR
- לבטא ולטהר 2H,15N-labled מדגם של החלבון של עניין.
הערה: בעוד שמדגם חלבון בעל תווית N 15יכול לשמש לרכישת ניסוי CPMG RD, התייבשות (במידת האפשר) מגדילה באופן דרמטי את איכות הנתונים המתקבלים. פרוטוקולים לייצור חלבונים מיובשים זמינים בספרות13. - חוצץ להחליף את דגימת החלבון המטוהר לתוך מאגר NMR degassed.
- העבר את דגימת NMR לתוך צינור NMR.
הערה: יש למטב בזהירות את הריכוז של דגימת NMR על מנת למקסם את יחס האות לרעש ולמזער את התרחשותן של אינטראקציות חלבון-חלבון. באופן כללי, טווח הריכוז האופייני לניסויי CPMG הוא 0.1-1.0 מ"מ.
2. הגדרה ראשונה ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המתואר כאן מביא לרכישת פרופילי RD עבור כל שיא בספקטרום 1H-15N TROSY (איור 3A). מפרופילי המו"פ הנרכשים ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לרגיעה רוחבית של 15N של כל קבוצת אמידה(איור 3A, 3B). על ידי התוויית Rex על המבנה 3D של החלבון תחת חקירה, ניתן לזהות את האזורים המבניים שעברו חילופי קונפורמציה בסולם הזמן μs-ms (איור 3C). מידול עקומות המו"פ באמצעות משוואת קארבר-ריצ'רדס .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15נתוני N RD על חלבונים. בפרט, השלבים הקריטיים להכנת מדגם NMR, מדידת נתוני NMR וניתוח פרופילי המו"פ מכוסים. להלן כמה היבטים חשובים לגבי רכישה וניתוח של ניסויי מו"פ נדונים. עם זאת, לתיאור מעמיק יותר של הניסוי וניתוח הנתונים, מומלץ מאוד ללמוד את הספרות המקורית3,8,11,15,16.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל הסופרים קראו ואישרו את כתב היד. אנחנו לא מצהירים על ניגודי אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי כספים מ NIGMS R35GM133488 ומ קרן הצדקה רוי ג'יי קרבר לV.V.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Cryoprobe | Bruker | 5 מ"מ TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | שפר את הרגישות |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% טהור, משמש להכנת דגימות NMR ותרביות deuterated |
| צנטריפוגה מונעת ביד | Scientific | אספקה CENTFG1 | משמש להסרת בועות אוויר או נוזל שיורי שנתקעו על דפנות צינור ה-NMR. |
| ספקטרומטר NMR בשדה גבוה | Bruker Bruker | Avance II 600, Bruker Avance 800 | רכישת נתוני NMR |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | מידול נתוני |
| NMR פסטור פיפטה | קורנינג תאגיד | 7095D-NMR | פיפטה פסטור זכוכית פיירקס להעברת דגימת נוזל בצינור NMR |
| NMR | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5 מ"מ דופן דקה 7 אינץ' צינור זכוכית צילינדרי |
| NMRPipe | המכון למחקר ביו-מדעי וביוטכנולוגיה | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | עיבוד נתוני NMR |
| SPARKY | אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | ניתוח נתוני NMR |
| Tospin 3.2 (או חדש יותר) | Bruker | תוכנת רכישת |
מקורות
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
