Summary
Her gives en detaljeret beskrivelse af den protokol, der implementeres i laboratoriet til erhvervelse og analyse af 15N afslapningsspredningsprofiler ved løsning NMR-spektroskopi.
Abstract
Protein kropsbygning dynamik spiller grundlæggende roller i reguleringen af enzymatisk katalyse, ligand bindende, allostery, og signalering, som er vigtige biologiske processer. At forstå, hvordan balancen mellem struktur og dynamik styrer den biologiske funktion, er en ny grænse i moderne strukturbiologi og har antændt flere tekniske og metodologiske udviklinger. Blandt disse giver CPMG afslapningsspredningsopløsning NMR-metoder unikke, atomare opløsningsoplysninger om strukturen, kinetik og termodynamik af proteinformationel ligevægt, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen. Her præsenterer undersøgelsen detaljerede protokoller for erhvervelse og analyse af et 15N afslapningsspredningseksperiment. Som et eksempel vises rørledningen til analyse af μs-ms-dynamikken i bakteriernes C-terminaldomæne Enzyme I.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) afslapningsspredningseksperimenter (RD) anvendes på en rutinemæssig base til at karakterisere kropsbygningsekvilibrering, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen ved opløsning NMR-spektroskopi1,2,3,4,5. Sammenlignet med andre metoder til undersøgelse af kropsbygningsdynamik er CPMG-teknikker relativt lette at implementere på moderne NMR-spektrometre, kræver ikke specialiserede prøveforberedelsestrin (dvs. krystallisering, prøvefrysning eller -justering og / eller kovalent bøjning med en fluorescerende eller paramagnetisk tag) og giver en omfattende karakterisering af kropsbygningsækvivalenter, der returnerer strukturelle, kinetiske og termodynamiske oplysninger om udvekslingsprocesser. For at et CPMG-forsøg kan rapportere om en kropslig ligevægt, skal der gælde to betingelser: (i) de observerede NMR-spins skal have forskellige kemiske skift i de tilstande, der undergår kropsudveksling (mikrostater), og (ii) udvekslingen skal finde sted på en tidsskala fra ~ 50 μs til ~ 10 ms. Under disse omstændigheder er den observerede tværgående afslapningsrate ( 
) summen af den iboende R2 (R2 målt i mangel af μs-ms 
dynamik) og udvekslingsbidraget til den tværgående afslapning (Rex). Rex-bidraget til R2obs kan gradvistslukkes ved at reducere afstanden mellem de 180° impulser, der udgør CPMG-blokken i pulssekvensen, og de resulterende RD-kurver kan modelleres ved hjælp af Bloch-McConnell-teorien for at opnå den kemiske skiftforskel mellem mikrostater, fraktioneret population af hver mikrostat og valutakurserne blandt mikrostater (figur 1)1,2,3.
Flere forskellige pulssekvenser og analyseprotokoller er blevet rapporteret i litteraturen for 15N CPMG eksperimenter. Heri er den protokol, der er implementeret i laboratoriet, beskrevet. Navnlig vil de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-stikprøven, oprettelse og erhvervelse af NMR-eksperimenterne samt behandling og analyse af NMR-dataene blive indført (figur 2). For at lette overførslen af protokollen til andre laboratorier leveres pulsprogrammet, behandlings- og analysescripts og et eksempeldatasæt som supplerende filer og kan downloades på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medfølgende pulssekvens indeholder en fasecyklus i fire trin i CPMG-blokken til undertrykkelse af offsetafhængige artefakter6, og den er kodet til erhvervelse af flere interleaved-eksperimenter. Disse interleaved eksperimenter har en identisk afslapning periode, men forskellige antal refokusering pulser for at opnå forskellige CPMG felter7. Det er også vigtigt at bemærke, at det beskrevne pulsprogram måler 15N R2 i TROSY-komponenten i NMR-signalet8. Samlet set er protokollen med succes blevet anvendt til karakterisering af kropsbygningsudveksling i mellemstore og store proteiner4,5,9,10. For mindre systemer (<20 kDa) er det tilrådeligt at bruge en heteronuklear single quantum sammenhæng (HSQC)-baseret pulssekvens11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af NMR-prøven
- Udtrykke og rense en 2H,15N-labled prøve af protein af interesse.
BEMÆRK: Mens en 15N-mærket proteinprøve kan anvendes til erhvervelse af CPMG RD-eksperimentet, øger perdeuteration (hvor det er muligt) kvaliteten af de opnåede data dramatisk. Protokoller for produktion af perdeutererede proteiner findes i litteraturen13. - Bufferbytter den rensede proteinprøve til en afgasset NMR-buffer.
- NMR-prøven overføres til NMR-røret.
BEMÆRK: Koncentrationen af NMR-prøven skal optimeres omhyggeligt for at maksimere signal-til-støj-forholdet og minimere forekomsten af proteinproteininteraktioner. Generelt er det typiske koncentrationsområde for CPMG-forsøg 0,1-1,0 mM.
2. Førstegangsopfatt af NMR-eksperimentet
- Hent og lyn de supplerende filer ud.
- Kopier filerne bits.vv og trosy_15N_cpmg.vv (placeret i mappen med navnet pulseprogram) til pulse-programmappen (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
BEMÆRK: Kontroller, at stien til bits.vv, der er angivet på den første linje i filen trosy_15N_cpmg.vv, er korrekt. - Åbn anskaffelsessoftware, og kopier et tidligere 1H-15N HSQC-eksperiment til et nyt eksperiment ved hjælp af kommandoen edc.
- Brug kommandoen pulprog, indlæse puls program trosy_15N_cpmg.vv i den nyoprettede eksperiment.
- Konfigurer CPMG-eksperimentet ved hjælp af instruktionerne i slutningen af pulsprogramfilen (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Rutinemæssig opsætning af NMR-eksperimentet
- Indfør prøven i magneten og udfør alle de grundlæggende trin for erhvervelse af ethvert NMR-eksperiment: lås og shim prøven; matche og tune 1H og 15N kanaler.
- Sæt p1 og p7 til varigheden af henholdsvis 1H og 15N hårde 90° impulser.
BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater er det vigtigt at kalibrere 15N 90° pulsen med stor omhu. Kalibrering opnås normalt ved hjælp af en 100 mM prøve af 15N-mærkede urinstof i DMSO som beskrevet i spektrometermanualen. Derudover er det muligt at dobbelttjekke kalibreringen direkte på den arbejdende NMR-prøve ved at erhverve den første forøgelse af et 1H-15N HSQC-spektrum, hvor 15N 90° pulsen i den første INEPT-blok skiftes til en 180° puls. Hvis kalibreringen er korrekt, skal der opnås en null-værdi. - Angiv midter- og spektralbredden for dimensionerne 1H og 15N i anskaffelsesvinduet.
BEMÆRK: Centrer 1 H-spektretved vandsignalets frekvens for optimal vandundertrykkelse. - Indstil afslapningsforsinkelsen (d30) svarende til 0,7 T2, hvor T2 er den forventede 15N tværgående afslapningstid for dit protein.
BEMÆRK: Værdien af d30 kan optimeres empirisk for at opnå de bedste resultater. - Brug kommandovelisten til at oprette en liste over heltalsnumre, der svarer til parameteren n i Figur 1A og Figur 1B. Sørg for, at hver post på listen svarer til et andet CPMG-felt (vcpmg)i henhold til νcpmg = 4 x n / d30. Sørg for, at det første tal på listen er 0 (dette svarer til referenceeksperimentet, som CPMG-blokken springes over og d30 = 0 s) og ikke at bruge tal, der er større end 1.000 x d30 / 4. Tal, der er større end denne tærskel,resulterer i > 1 kHz og kan beskadige sonden.
- 18 til antallet af poster i velist, 13 til antallet af reelle point for den indirekte dimension (normalt er der fastsat et interval på 64-200 for l3) og 1 td svarende til l8 x l3 x 2.
BEMÆRK: Udfør trin 3.7-3.11 for at optimere vanddæmpning. - Indstil modtagerens forstærkning (rg) til 1. Åbn pulsprogramfilen (edcpul), gå til linje 91, fjern semikolonet før goto 999, og gem filen.
- Brug af kommando gs justere parametrene spdb0 (eller spdw0) for at minimere intensiteten af FID-signalet.
- Genindfør semikolonet på linje 91 i pulsprogramfilen, og gem filen.
- Gentag trin 3.7-3.9 for at optimere spdb11 (linje 168 i pulsprogramfilen), spdb2 (linje 179 i pulsprogramfilen) og pldb2 (linje 184 i pulsprogramfilen).
- Kør kommando rga for at optimere modtagerens forstærkning.
- Indstil antallet af scanninger (ns) til et multiplum af 8.
- Kør kommandoen zg for at starte eksperimentet.
4. Behandling og analyse af NMR-data
- Kopier mappen Proces (Supplerende filer) til den mappe, der indeholder ser-filen.
- Brug filerne sep_fid.com og ft2D.com til at behandle NMR-dataene.
BEMÆRK: Der gives instruktioner i, hvordan du redigerer behandlingsscripts, i sep_fid.com- og ft2D.com-filer. - Åbn ucsf-filerne i mappen CPMG_Sparky_files i Sparky.
BEMÆRK: UCSF-filerne oprettes af behandlingsscriptene. Der er en ucsf fil for hver post i vclist. Den første ucsf-fil (test_1.ucsf) indeholder referenceeksperimentet. De efterfølgende ucsf-filer (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) bestilles fra den laveste til den største værdi af νcpmg. - Vælg NMR-krydstoppene på reference-NMR-spektret (test_1.ucsf).
- Marker alle de valgte cross-peaks ved hjælp af Sparky kommando pa.
- Kør Kommandoen Sparky. Denne kommando åbner et dialogboksvindue. Vælg indstillingshøjderne på samme placering i hvert spektrum. Klik på Opsætning, og kontroller alle NMR-spektre. Klik på Opdater, og gem outputfilen i arbejdsmappen. Outputfilen indeholder matrixen for signalintensiteterne over alle åbne NMR-spektre.
BEMÆRK: Mere nøjagtige protokoller, der bruger lineshape montering til at inddrive intensiteter fra interleaved pseudo-3D eksperimenter er blevet beskrevet i litteraturen14. Frit tilgængelig software til lineshape fitting er tilgængelig på https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), og inden for NMRPipe (nLinLS modul) og SPARKY (det modul). - For hvert CPMG-felt konverteres signalintensiteterne til R2-satser ved hjælp af formlen
, hvor I0 og Id30 er intensiteten af referencen (ve = 0) og afslappet (ve > 0) NMR-spektre.
BEMÆRK: I de supplerende filerfindes der en skabelon til regnearksfilen (R2_calc.xls), der bruges til at konvertere signalintensiteterne tilR 2-hastigheder og visualisere RD-profilerne. - Læs støjniveauet i referencespektret ved hjælp af Kommandoen Sparky st, og udform fejlen på R2-satserne.
BEMÆRK: I de supplerende filerfindes en skabelon til regnearksfilen (R2_calc.xls), der bruges til at overføre fejlen på de målte R2-hastigheder.
, hvor I0 og Id30 er intensiteten af referencen (ve = 0) og afslappet (ve > 0) NMR-spektre.5. Montering af RD-kurver
- Kopier mappen RD_fitting (Supplerende filer) til arbejdsmappen.
- For hver tildelt NMR-top, Rex ved beregning af
. 
- Undersøg RD-kurverne visuelt med Rex større end to gange den anslåede fejl, og kassér alle de RD-kurver, der er for støjende til at blive modelleret nøjagtigt.
BEMÆRK: Støj på Rex kan overføres fra fejlene på og . - Forbered en inputfil til tilpasningsscriptet ved hjælp af alle RD-kurver med Rex større end to gange den anslåede fejl.
BEMÆRK: Detaljeret instruktion om forberedelse af inputfilerne findes i tilpasningsscriptene. Eksempel på inputfiler leveres som supplerende filer. Almindeligvis måles RD-data ved to forskellige statiske felter og monteres samtidigt. I denne protokol kræves to forskellige inputfiler (Supplerende filer). - Tilpas RD-dataene ved hjælp af de scripts, der findesi Supplerende filer .
BEMÆRK: Der findes to forskellige scripts til at udføre henholdsvis en restbaseret eller global tilpasning af RD-kurverne. Begge scripts passer til RD kurver ved hjælp af en to-site udveksling model og Carver-Richards ligning. Der findes mere detaljerede instruktioner i tilpasningsscriptene. Yderligere softwarepakker som Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) og CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) er tilgængelige til at udføre datatilpasning ved hjælp af Block-McConnell-ligningerne. - Pålideligheden af de monterede parametre afprøves ved vurdering af den reducerede χ2 som funktion af pb og kex.
BEMÆRK: Den reducerede χ2 findes i outputfilen. pb og kex kan fastholdes til specifikke værdier ved hjælp af nedre og øvre grænser i monteringsprocedurerne. I vores scripts er de nedre og øvre grænser for pb henholdsvis lb(2) og ub(2). De nedre og øvre grænser for kex er henholdsvis lb(3) og ub(3). - Anslå fejlen på de monterede parametre. Dette kan gøres ved at indstille værdien af MC_fac i scriptet til 1 og gentage tilpasningen flere gange (typisk >20 gentagelser). Fejlen på hver parameter forkalkuleret som standardafvigelsen for fordelingen.
BEMÆRK: Hvis du indstiller MC_fac til 1, genereres et syntetisk datasæt, hvor en gaussisk distribueret fejl (beregnet på basis af forsøgsfejlen) føjes til forsøgsdataene.
. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den her beskrevne protokol resulterer i erhvervelse af RD-profiler for hvert højdepunkt i 1H-15N TROSY-spektret (Figur 3A). Ud fra de erhvervede RD-profiler er det muligt at anslå udvekslingsbidraget til den 15N tværgående lempelse af hver rygrad midt i gruppen (Figur 3A,3B). Ved at plotte Rex på 3D-strukturen af det undersøgte protein er det muligt at identificere de strukturelle regioner, der er under kropsbygningsudveksling på μs-ms-tidsskalaen (figur 3C). Modellering af RD-kurverne ved hjælp af Carver-Richards-ligningen returnerer termodynamiske og kinetiske parametre på udvekslingsprocessen, såsom fraktioneret populationer af staterne i ligevægt og valutakursen blandt disse stater (Figur 1, Figur 3D). Temperaturafhængigheden af disse termodynamiske og kinetiske parametre (opnået ved at erhverve RD-eksperimenter ved flere eksperimentelle temperaturer) kan modelleres ved hjælp af henholdsvis van't Hoff- og Eyring-ligningerne for at få detaljerede oplysninger om energiske kropsbygningsudveksling (Figur 3E)9,10.
Figur 1: Oversigt over CPMG RD-eksperimentet( A) Skematisk visning af CPMG-blokken, der anvendes til erhvervelse af RD-data. 180° pulserne vises som sorte rektangler. Operatøren 
angiver den magnetisering, der kommer ind og ud af CPMG-blokken. CPMG-feltet bestemmes af afstanden mellem efterfølgende refokusering af impulser (2τ). (B) Ved en måling på to tidspunkter holdes afslapningsforsinkelsen (hvor CPMG-blokken anvendes) konstant, og CPMG-feltet varieres ved at variere værdierne af n (det antal gange, CPMG-blokken anvendes i afslapningsforsinkelsesperioden) og τ. (C) Skematisk repræsentation af en ligevægt mellem overensstemmelserne A og B. Valutakurskonstanten (kex)er summen af henholdsvis termins- og tilbageførselskonstanterne kab og kba). pa og pb (= 1 - pa) er fraktioneret populationer af henholdsvis art A og B. Δωab er den kemiske skiftforskel mellem konformationer A og B. (D) Simulerede RD-kurver for udvekslingsprocesser, der er i det område, der er tilgængeligt for CPMG (øverst til venstre), for hurtigt til at blive opdaget af CPMG (øverst til højre), for langsom til at blive opdaget af CPMG (nederst til højre) og med en Δωab for lille til at blive opdaget af CPMG (nederst til venstre). Pb-værdien blev angivet til 3 %. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hovedpipeline til erhvervelse og analyse af data om landdistrikter. Skematisk repræsentation af den arbejdsproces, der er beskrevet i denne protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: μs-ms-dynamikken i EIC ved CPMG RD-forsøg. Skønnet over Rex er vist med rødt. (B) Rex-værdierne afbildes i forhold til restindekset og (C) på enzymets røntgenstruktur for at identificere restkoncentrationer under kropsbygningsudveksling. (D) NMR-signaler med Rex større end fejlen er modelleret (ved hjælp af scriptet i supplerende filer) for at opnå kinetik (kab og kba)og termodynamik (pb)af ligevægten. (E) Erhvervelse af RD data ved flere temperaturer returnerer oplysninger om energiske af kropsbygningsændringen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende filer. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver den protokol, der er implementeret i laboratoriet for erhvervelse og analyse af 15N RD-data om proteiner. Navnlig er de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-prøven, måling af NMR-data og analyse af RD-profilerne dækket. Nedenfor diskuteres nogle vigtige aspekter vedrørende erhvervelse og analyse af RD-eksperimenter. Men for en mere dybdegående beskrivelse af eksperimentet og dataanalysen anbefales omhyggelig undersøgelse af den oprindelige litteratur stærkt3,8,11,15,16.
Ved udarbejdelsen af NMR-prøven er det yderst vigtigt at tage i betragtning, at tilstedeværelsen af en eventuel mindre (<1% befolket) tilstand til gengæld for de vigtigste, synlige NMR-arter på μs-ms-tidsskalaen vil generere påviselige RD-profiler1. Det anbefales derfor at anvende en stærkt renset proteinbestand (>90 % ren) for at undgå tilstedeværelsen af forurenende stoffer, der kan danne forbigående komplekser med det undersøgte system. Hvis man undersøger kropsbygningsdynamik i protein-ligand-komplekser, er det desuden vigtigt at bruge mætningskoncentrationer af ligand for at undgå tilstedeværelsen af falske RD-profiler, der stammer fra kinetik af ligandbinding.
Når du arbejder med høj molekylvægt systemer (>20 kDa), er det også tilrådeligt (men ikke nødvendigt) at bruge perdeutererede proteinprøver og TROSY puls sekvens præsenteret med den nuværende protokol for at reducere den tværgående afslapning sats og maksimere afslapning periode (d30 i vores puls program). Som den laveste, derkan opnås, er det faktisk ikke muligt at opnå dette. = 4/d30 giver ved hjælp af en lang afslapningsperiode mulighed for at anskaffe R2-data ved små modcpmg, hvor udvekslingsbidraget tilR 2 er på sit højeste. I denne forbindelse er det også vigtigt at nævne, at en pulssekvens svarende til den, der følger med denne protokol, er til stede i spektrometerets standardpulssekvensportefølje (filnavn: trhncorexf3gp). Den væsentligste forskel mellem de to filer er, at standardsekvensen er baseret på et TROSY-HNCO-eksperiment, mens vores eksperiment er baseret på et TROSY-HSQC-eksperiment og ikke kræver 13C mærkning af prøven.
Et andet spørgsmål, der skal overvejes nøje, er erhvervelsestemperaturen. Da RD-dataene normalt måles ved flere statiske felter, er det afgørende, at anskaffelsestemperaturen er konsistent blandt alle anvendte spektrometre. Derfor anbefales det stærkt at kontrollere temperaturkalibreringen, før eksperimentet sættes op.
For hvad angår analysen af RD kurver, er det vigtigt at understrege, at de procedurer og montering scripts præsenteret her gøre brug af Carver-Richards ligninger. Selv om dette er den mest almindelige procedure, der anvendes i litteraturen til kvantitativ modellering af RD-data, indeholder Carver Richards-ligningerne en række tilnærmelser og er begrænset til udvekslingssagen på to lokaliteter17. Hvis et bestemt datasæt kræver strengere Bloch-McConnell-matricer til datamodellering , bør tilpasningsproceduren ændres i overensstemmelse hermed18,19,20. I protokollen ovenfor er et par frit tilgængelige softwarepakker opført, der udfører datamodellering ved hjælp af Bloch-McConnell-teorien.
Endelig skal det bemærkes, at selv om vores manuskript udelukkende fokuserer på anvendelsen af 15N RD-data til undersøgelse af proteinformationsdynamik, blev flere andre eksperimenter beskrevet i litteraturen for at måle RD-kurver på forskellige kerner og andre biologiske og ikke-biologiske molekylære systemer18,19,21,22,23. Især brugen af forskellige kerner er ekstremt vigtig, da det giver mulighed for en mere tæt prøveudtagning af proteinstrukturen og giver oplysninger om sidekædedynamik, der stort set ignoreres af det 15N-baserede eksperiment, der præsenteres i denne protokol5,21,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har læst og godkendt manuskriptet. Vi erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra NIGMS R35GM133488 og fra Roy J. Carver Charitable Trust til V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
