Her gives en detaljeret beskrivelse af den protokol, der implementeres i laboratoriet til erhvervelse og analyse af 15N afslapningsspredningsprofiler ved løsning NMR-spektroskopi.
Protein kropsbygning dynamik spiller grundlæggende roller i reguleringen af enzymatisk katalyse, ligand bindende, allostery, og signalering, som er vigtige biologiske processer. At forstå, hvordan balancen mellem struktur og dynamik styrer den biologiske funktion, er en ny grænse i moderne strukturbiologi og har antændt flere tekniske og metodologiske udviklinger. Blandt disse giver CPMG afslapningsspredningsopløsning NMR-metoder unikke, atomare opløsningsoplysninger om strukturen, kinetik og termodynamik af proteinformationel ligevægt, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen. Her præsenterer undersøgelsen detaljerede protokoller for erhvervelse og analyse af et 15N afslapningsspredningseksperiment. Som et eksempel vises rørledningen til analyse af μs-ms-dynamikken i bakteriernes C-terminaldomæne Enzyme I.
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) afslapningsspredningseksperimenter (RD) anvendes på en rutinemæssig base til at karakterisere kropsbygningsekvilibrering, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen ved opløsning NMR-spektroskopi1,2,3,4,5. Sammenlignet med andre metoder til undersøgelse af kropsbygningsdynamik er CPMG-teknikker relativt lette at implementere på moderne NMR-spektrometre, kræver ikke specialiserede prøveforberedelsestrin (dvs. krystallisering, prøvefrysning eller -justering og / eller kovalent bøjning med en fluorescerende eller paramagnetisk tag) og giver en omfattende karakterisering af kropsbygningsækvivalenter, der returnerer strukturelle, kinetiske og termodynamiske oplysninger om udvekslingsprocesser. For at et CPMG-forsøg kan rapportere om en kropslig ligevægt, skal der gælde to betingelser: (i) de observerede NMR-spins skal have forskellige kemiske skift i de tilstande, der undergår kropsudveksling (mikrostater), og (ii) udvekslingen skal finde sted på en tidsskala fra ~ 50 μs til ~ 10 ms. Under disse omstændigheder er den observerede tværgående afslapningsrate ( ) summen af den iboende R2 (R2 målt i mangel af μs-ms dynamik) og udvekslingsbidraget til den tværgående afslapning (Rex). Rex-bidraget til R2obs kan gradvistslukkes ved at reducere afstanden mellem de 180° impulser, der udgør CPMG-blokken i pulssekvensen, og de resulterende RD-kurver kan modelleres ved hjælp af Bloch-McConnell-teorien for at opnå den kemiske skiftforskel mellem mikrostater, fraktioneret population af hver mikrostat og valutakurserne blandt mikrostater (figur 1)1,2,3.
Flere forskellige pulssekvenser og analyseprotokoller er blevet rapporteret i litteraturen for 15N CPMG eksperimenter. Heri er den protokol, der er implementeret i laboratoriet, beskrevet. Navnlig vil de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-stikprøven, oprettelse og erhvervelse af NMR-eksperimenterne samt behandling og analyse af NMR-dataene blive indført (figur 2). For at lette overførslen af protokollen til andre laboratorier leveres pulsprogrammet, behandlings- og analysescripts og et eksempeldatasæt som supplerende filer og kan downloades på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medfølgende pulssekvens indeholder en fasecyklus i fire trin i CPMG-blokken til undertrykkelse af offsetafhængige artefakter6, og den er kodet til erhvervelse af flere interleaved-eksperimenter. Disse interleaved eksperimenter har en identisk afslapning periode, men forskellige antal refokusering pulser for at opnå forskellige CPMG felter7. Det er også vigtigt at bemærke, at det beskrevne pulsprogram måler 15N R2 i TROSY-komponenten i NMR-signalet8. Samlet set er protokollen med succes blevet anvendt til karakterisering af kropsbygningsudveksling i mellemstore og store proteiner4,5,9,10. For mindre systemer (<20 kDa) er det tilrådeligt at bruge en heteronuklear single quantum sammenhæng (HSQC)-baseret pulssekvens11,12.
Dette manuskript beskriver den protokol, der er implementeret i laboratoriet for erhvervelse og analyse af 15N RD-data om proteiner. Navnlig er de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-prøven, måling af NMR-data og analyse af RD-profilerne dækket. Nedenfor diskuteres nogle vigtige aspekter vedrørende erhvervelse og analyse af RD-eksperimenter. Men for en mere dybdegående beskrivelse af eksperimentet og dataanalysen anbefales omhyggelig undersøgelse af den oprindelige litteratur stærkt<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra NIGMS R35GM133488 og fra Roy J. Carver Charitable Trust til V.V.
Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |