¹⁵ एन CPMG μs-एमएस Timescale पर प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए छूट फैलाव

Summary

यहां, समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा ¹⁵एन विश्राम प्रसार प्रोफाइल के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है।

Abstract

प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता एंजाइमैतिक उत्प्रेरक, लिगांड बाइंडिंग, एलोस्टरी और सिग्नलिंग के नियमन में मौलिक भूमिकाएं निभाती हैं, जो महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं हैं। संरचना और गतिशीलता के बीच संतुलन जैविक कार्य को नियंत्रित करने के तरीके को समझना आधुनिक संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक नई सीमा है और इसने कई तकनीकी और पद्धतिगत विकास को प्रज्वलित किया है। इनमें से, सीपीएमजी विश्राम फैलाव समाधान एनएमआर विधियां संरचना, काइनेटिक्स और थर्मोडायनामिक्स की संरचना पर अद्वितीय, परमाणु-संकल्प जानकारी प्रदान करती हैं, जो माइक्रोन-एमएस टाइमस्केल पर होने वाली प्रोटीन अनुरूप संतुलन संतुलन की है। यहां, अध्ययन ¹⁵एन विश्राम प्रसार प्रयोग के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एक उदाहरण के रूप में, बैक्टीरिया एंजाइम I के सी-टर्मिनल डोमेन में μs-ms गतिशीलता के विश्लेषण के लिए पाइपलाइन दिखाया गया है।

Introduction

कैर-पुरसेल मेबूम-गिल (सीपीएमजी) विश्राम प्रसार (आरडी) प्रयोगों का उपयोग नियमित आधार पर किया जाता है ताकि समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी^1,2,3,4,5द्वारा माइक्रोन-एमएस टाइमस्केल पर होने वाली अनुरूप संतुलन की विशेषता हो। अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, CPMG तकनीकों को आधुनिक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर लागू करना अपेक्षाकृत आसान है, विशेष नमूना तैयारी चरणों (यानी, क्रिस्टलीकरण, नमूना ठंड या संरेखण, और/या एक फ्लोरोसेंट या पैरामैग्नेटिक टैग के साथ सहसंयोजक संयुग्मण की आवश्यकता नहीं है), और विनिमय प्रक्रियाओं पर अनुरूप संतुलन संतुलन लौटने की एक व्यापक लक्षण प्रदान करते हैं। एक सामंती संतुलन पर रिपोर्ट करने के लिए एक CPMG प्रयोग के लिए, दो शर्तों को लागू करना होगा: (i) मनाया एनएमआर स्पिन अनुरूप विनिमय (माइक्रोस्टेट्स) के दौर से गुजर राज्यों में विभिन्न रासायनिक बदलाव के अधिकारी होना चाहिए और (ii) विनिमय ~50 μs से ~ 10 एमएस तक के समय पैमाने पर होना चाहिए । इन शर्तों के तहत, मनाया गया ट्रांसवर्स छूट दर () आंतरिक आर₂ (आर₂ μs-ms गतिशीलता के अभाव में मापा जाता है) और ट्रांसवर्स विश्राम (आर_{पूर्व)}में विनिमय योगदान का योग है। आर₂^ऑब्स में आर_{पूर्व} योगदान को पल्स सीक्वेंस के सीपीएमजी ब्लॉक का गठन करने वाली 180 डिग्री दालों के बीच की दूरी को कम करके उत्तरोत्तर शमन किया जा सकता है, और परिणामस्वरूप आरडी घटता को ब्लोच-मैककॉनेल सिद्धांत का उपयोग करके मॉडलिंग की जा सकती है ताकि माइक्रोस्टेट्स के बीच रासायनिक बदलाव अंतर प्राप्त किया जा सके, प्रत्येक माइक्रोस्टेट की आंशिक आबादी, और माइक्रोस्टेट्स(चित्रा 1)^1,2,3के बीच विनिमय की दरें।

15 एन सीपीएमजी प्रयोगों के लिए साहित्य में कई ^{अलग-अलग पल्स}सीक्वेंस और एनालिसिस प्रोटोकॉल की सूचना मिली है। इसके साथ ही प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, एनएमआर नमूने को तैयार करने, एनएमआर प्रयोगों की स्थापना और अधिग्रहण और एनएमआर डेटा के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम(चित्र 2)पेश किए जाएंगे। प्रोटोकॉल को अन्य प्रयोगशालाओं में स्थानांतरित करने की सुविधा के लिए, पल्स प्रोग्राम, प्रसंस्करण और विश्लेषण स्क्रिप्ट, और एक उदाहरण डेटासेट पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं और (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html) पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध हैं। प्रदान की गई पल्स अनुक्रम में ऑफसेट-निर्भर कलाकृतियों⁶ के दमन के लिए सीपीएमजी ब्लॉक में चार चरण चरण चक्र शामिल है और यह कई इंटरलीव्ड प्रयोगों के अधिग्रहण के लिए कोडित है। इन अंतरप्रावेदित प्रयोगों में एक समान विश्राम अवधि होती है , लेकिन विभिन्न सीपीएमजी क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए दालों को फिर से केंद्रित करने की विभिन्न^{संख्याएं 7}. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वर्णित पल्स प्रोग्राम एनएमआर सिग्नल 8 के ट्रोसी घटक के ¹⁵एन आर₂ को^{मापता}है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल को मध्यम और बड़े आकार केप्रोटीन^4,5,9,10में अनुरूप विनिमय के लक्षण वर्णन के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। छोटी प्रणालियों (<20 केडीए) के लिए, हेट्रोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम जुटना (एचएसक्यूसी) आधारित पल्स सीक्वेंस^11,12 का उपयोग उचित है।

Protocol

1. एनएमआर नमूने की तैयारी

1. एक्सप्रेस और एक ²एच,¹⁵एन-ब्याज के प्रोटीन का नमूना शुद्ध ।
   नोट: जबकि एक ¹⁵एन लेबल प्रोटीन नमूना CPMG RD प्रयोग के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, perdeuteration (जहां संभव हो) नाटकीय रूप से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता बढ़ जाती है । ¹³साहित्य में व्याप्त प्रोटीन के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं ।
2. बफर शुद्ध प्रोटीन नमूने को एक डिगैस्ड एनएमआर बफर में एक्सचेंज करें।
3. एनएमआर सैंपल को एनएमआर ट्यूब में ट्रांसफर करें।
   नोट: सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की घटना को कम करने के लिए एनएमआर नमूने की एकाग्रता को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करने की आवश्यकता है। सामान्य तौर पर, सीपीएमजी प्रयोगों के लिए विशिष्ट एकाग्रता सीमा 0.1-1.0 mM है।

2. एनएमआर प्रयोग की पहली बार सेट-अप

1. पूरक फ़ाइलोंको डाउनलोड करें और अनज़िप करें।
2. फाइलों bits.vv और trosy_15N_cpmg.vv (पल्सप्रोग्राम नाम के फ़ोल्डर में स्थित) को पल्स प्रोग्राम डायरेक्टरी (<पैथ>/exp/stan/nmr/lists/pp/user) में कॉपी करें ।
   नोट: सुनिश्चित करें कि trosy_15N_cpmg.vv फ़ाइल की पहली पंक्ति पर सूचीबद्ध bits.vv के लिए रास्ता सही है ।
3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और कमांड ^{ईडीसी}का उपयोग करके एक नए प्रयोग में पहले से चलने वाले 1 एच-15एन एचएसक्यूसी प्रयोग की प्रतिलिपि करें।
4. कमांड पल्परोगका उपयोग करके, पल्स प्रोग्राम trosy_15N_cpmg.वीवी को नवनिर्मित प्रयोग में लोड करें।
5. पल्स प्रोग्राम फ़ाइल (trosy_15N_cpmg.vv) के अंत में दिए गए निर्देशों का उपयोग करके CPMG प्रयोग सेट करें।

3. एनएमआर प्रयोग की नियमित स्थापना

1. चुंबक में नमूना पेश करें और किसी भी एनएमआर प्रयोग के अधिग्रहण के लिए सभी बुनियादी चरणों को करें: नमूना को लॉक और शिम करें; मैच और ^{धुन 1}एच और ¹⁵एन चैनलों।
2. क्रमशः 1 एच और ¹⁵एन हार्ड 90 डिग्री दालों की अवधि के लिए p1 और p7 सेट करें।
   नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, ¹⁵एन 90 डिग्री नाड़ी को बड़ी सावधानी से कैलिब्रेट करना महत्वपूर्ण है। स्पेक्ट्रोमीटर मैनुअल में वर्णित डीएमएसओ में 15 एन-लेबल यूरिया के ¹⁰⁰एमएमएम नमूने का उपयोग करके अंशांकन आमतौर पर पूरा किया जाता है। इसके अलावा, ^{1 एच-15}एन एचएसक्यूसी स्पेक्ट्रम की पहली वेतन वृद्धि प्राप्तकरके काम कर रहे एनएमआर नमूने पर सीधे अंशांकन की दोहरी जांच करना संभव है जिसमें पहले INEPT ब्लॉक की ¹⁵एन 90 डिग्री पल्स को 180 डिग्री पल्स में बंद कर दिया जाता है। यदि अंशांकन सही है, तो एक शून्य प्राप्त किया जाना चाहिए।
3. अधिग्रहण खिड़की में, 1 एच और ¹⁵एन आयामों के लिए केंद्र और ^{स्पेक्ट्रल}चौड़ाई सेट करें।
   नोट: इष्टतम पानी दमन के लिए पानी के संकेत की आवृत्ति पर ¹एच स्पेक्ट्रम केंद्र ।
4. छूट देरी (d30) 0.7 टी₂के बराबर सेट करें, जहां टी₂ आपके प्रोटीन का अपेक्षित ¹⁵एन ट्रांसवर्स विश्राम समय है।
   नोट: सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए डी 30 के मूल्य को अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित किया जा सकता है।
5. फिगर 1ए और फिगर 1बी में पैरामीटर एन के अनुरूप पूर्णांक संख्याओं की सूची बनाने के लिए कमांड वीसीलिस्ट काउपयोग करें । सुनिश्चित करें कि सूची में प्रत्येक प्रविष्टि एक अलग_CPMG क्षेत्र (α_cpmg)के अनुसार मेल खाती है = 4 x n/ d30 . सुनिश्चित करें कि सूची में पहला नंबर 0 है (यह संदर्भ प्रयोग से मेल खाता है जिसके लिए सीपीएमजी ब्लॉक को छोड़ दिया जाता है और d30 = 0 s) और 1,000 x d30/ इस दहलीज से बड़ी संख्या 1 kHz >_{में परिणाम} है और जांच को नुकसान हो सकता है ।
6. वीसीलिस्ट में प्रविष्टियों की संख्या के लिए l8 सेट करें, अप्रत्यक्ष आयाम के लिए वास्तविक बिंदुओं की संख्या के लिए l3 (आमतौर पर एल 3 के लिए 64-200 की एक सीमा निर्धारित है), और 1 टीडी l8 x l3 x 2 के बराबर है।
   नोट: पानी के दमन को अनुकूलित करने के लिए चरण 3.7-3.11 का प्रदर्शन करें।
7. रिसीवर लाभ (आरजी) को 1 सेट करें; पल्स प्रोग्राम फ़ाइल (एडकपुल) खोलें, लाइन 91 पर जाएं, गोटो 999से पहले सेमीकॉलन को हटा दें, और फ़ाइल को सहेजें।
8. कमांड जीएस का उपयोग करना एफआईआईडी सिग्नल की तीव्रता को कम करने के लिए पैरामीटर एसपीडीबी0 (या एसपीडीडब्ल्यू0) को समायोजित करें।
9. पल्स प्रोग्राम फाइल के लाइन 91 पर सेमीकॉलन को फिर से पेश करें और फाइल को सेव करें।
10. spdb11 (पल्स प्रोग्राम फ़ाइल की लाइन 168), spdb2 (पल्स प्रोग्राम फ़ाइल की लाइन 179), और pldb2 (पल्स प्रोग्राम फ़ाइल की लाइन 184) को अनुकूलित करने के लिए चरण 3.7-3.9 दोहराएं।
11. रिसीवर लाभ को अनुकूलित करने के लिए कमांड आरजीए चलाएं।
12. स्कैन(एनएस)की संख्या 8 के एक से अधिक करने के लिए सेट करें।
13. प्रयोग शुरू करने के लिए कमांड जेडजी चलाएं।

4. एनएमआर डेटा का प्रसंस्करण और विश्लेषण

1. सेर फ़ाइल युक्त निर्देशिका में प्रक्रिया (पूरक फ़ाइलें)नाम के फ़ोल्डर की प्रतिलिपि।
2. एनएमआर डेटा को प्रोसेस करने के लिए फाइलों sep_fid.com और ft2D.com का इस्तेमाल करें।
   नोट: प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट को संपादित करने के तरीके के बारे में निर्देश sep_fid.com और ft2D.com फ़ाइलों के भीतर प्रदान किया जाता है।
3. स्पार्की में निर्देशिका CPMG_Sparky_files में निहित यूसीएफ फाइलों को खोलें।
   नोट: यूसीएफ फाइलें प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट द्वारा बनाई गई हैं। वीसीलिस्ट में हर एंट्री के लिए यूसीएफ की एक फाइल है। पहली ucsf फ़ाइल (test_1.ucsf) संदर्भ प्रयोग शामिल हैं। इसके बाद यूसीएसएफ फाइलें (test_2.यूसीएसएफ, test_3.यूसीएसएफ,... test_n.ucsf) सबसे कम से सबसे बड़ा_cpmgके लिए आदेश दिया जाता है ।
4. संदर्भ एनएमआर स्पेक्ट्रम (test_1.ucsf) पर एनएमआर क्रॉस-चोटियों उठाओ।
5. स्पार्की कमांड पीएका उपयोग करके सभी उठाया क्रॉस-चोटियों का चयन करें।
6. स्पार्की कमांड आरएच चलाएं। यह कमांड एक संवाद खिड़की खोलता है। प्रत्येक स्पेक्ट्रम में एक ही स्थिति मेंविकल्प ऊंचाइयों का चयन करें । सेटअप पर क्लिक करें और सभी एनएमआर स्पेक्ट्रा की जांच करें। अपडेट पर क्लिक करें और वर्किंग डायरेक्टरी में आउटपुट फाइल को सेव करें । आउटपुट फ़ाइल में सभी खोले गए एनएमआर स्पेक्ट्रा पर सिग्नल तीव्रता का मैट्रिक्स होता है।
   नोट: अधिक सटीक प्रोटोकॉल है कि interleaved छद्म 3 डी प्रयोगों से तीव्रता ठीक करने के लिए लाइनहैप फिटिंग का उपयोग साहित्य¹⁴में वर्णित किया गया है । लाइनहापे फिटिंग के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर https://pint-nmr.github.io/PINT/ (पिंट), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) पर उपलब्ध है, और एनएमआरपाइप (एनलिंक्स मॉड्यूल) और स्पार्की (आईटी मॉड्यूल) के भीतर उपलब्ध है।
7. प्रत्येक सीपीएमजी फ़ील्ड के लिए, सिग्नल तीव्रता को सूत्र का उपयोग करके आर₂ दरों में परिवर्तित करें, जहां मैं₀ और मैं_{डी 30} संदर्भ (कुलपति = 0) और आराम (कुलपति > 0) एनएमआर स्पेक्ट्रा की तीव्रता हैं।
   नोट: पूरक फ़ाइलोंमें, स्प्रेडशीट फ़ाइल (R2_calc.xls) का एक टेम्पलेट जो सिग्नल की तीव्रता को आर 2 दरों में परिवर्तित करने और आरडी प्रोफाइल की कल्पना करने के लिए उपयोग किया_जाता है।
8. स्पार्की कमांड एसटी का उपयोग कर संदर्भ स्पेक्ट्रम में शोर स्तर पढ़ें और आर₂ दरों पर त्रुटि का प्रचार करें।
   नोट: पूरक फ़ाइलोंमें, मापा आर 2 दरों पर त्रुटि का प्रचार करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्प्रेडशीट फ़ाइल (R2_calc.xls) का एक टेम्पलेट प्रदान किया_जाता है।

5. फिटिंग आरडी घटता

1. कार्य निर्देशिका में RD_fitting(पूरक फ़ाइलें)नाम के फ़ोल्डर की प्रतिलिपि।
2. प्रत्येक सौंपा एनएमआर चोटी के लिए, गणना करके आर_{पूर्व} का अनुमान है . और आर ₂ दरों को वीसीलिस्ट में सबसे कम और उच्चतम_{टीसी सीपीएमजी} पर मापा जाताहै।
3. नेत्रहीन आर_{पूर्व} के साथ आरडी घटता का निरीक्षण दो बार से बड़ा अनुमानित त्रुटि और सभी आरडी घटता है कि बहुत शोर कर रहे है सही मॉडलिंग की त्याग ।
   नोट: आर_{पूर्व} पर शोर पर त्रुटियों से प्रचारित किया जा सकता है और ।
4. अनुमानित त्रुटि से दो गुना बड़े आर_एक्स के साथ सभी आरडी वक्र्स का उपयोग करके फिटिंग स्क्रिप्ट के लिए एक इनपुट फाइल तैयार करें।
   नोट: इनपुट फ़ाइलों की तैयारी पर विस्तृत निर्देश फिटिंग स्क्रिप्ट के भीतर प्रदान किए जाते हैं। उदाहरण इनपुट फ़ाइलें पूरक फ़ाइलोंके रूप में प्रदान की जाती हैं। आमतौर पर, आरडी डेटा को दो अलग-अलग स्थिर क्षेत्रों में मापा जाता है और एक साथ फिट किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, दो अलग-अलग इनपुट फ़ाइलों की आवश्यकता होती है(पूरक फ़ाइलें)।
5. पूरक फ़ाइलोंमें प्रदान की गई लिपियों का उपयोग करके आरडी डेटा को फिट करें।
   नोट: क्रमशः अवशेष आधारित या आरडी वक्र्स के वैश्विक फिट प्रदर्शन करने के लिए दो अलग-अलग स्क्रिप्ट प्रदान की जाती हैं। दोनों लिपियों एक दो साइट विनिमय मॉडल और Carver-रिचर्ड्स समीकरण का उपयोग कर आरडी घटता फिट । फिटिंग स्क्रिप्ट के भीतर अधिक विस्तृत निर्देश प्रदान किए जाते हैं। ब्लॉक-मैककॉनेल समीकरणों का उपयोग करके डेटा फिटिंग करने के लिए चेमेक्स (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) और कैटिया (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) जैसे अतिरिक्त सॉफ्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं।
6. पी_बी और के_एक्सके एक समारोह के रूप में कम χ² का आकलन फिट मापदंडों की विश्वसनीयता का परीक्षण करें ।
   नोट: आउटपुट फ़ाइल में कम χ² प्रदान की जाती है। पी_बी और कश्मीर_{पूर्व} फिटिंग प्रक्रियाओं में कम और ऊपरी सीमा का उपयोग कर विशिष्ट मूल्यों के लिए रोका जा सकता है । हमारी लिपियों में, पी_बी के लिए निचले और ऊपरी सीमा क्रमशः पौंड (2) और यूबी (2) हैं। कश्मीर_{पूर्व} के लिए निचले और ऊपरी सीमा क्रमशः पौंड (3) और यूबी (3) हैं।
7. लगे मापदंडों पर त्रुटि का अनुमान लगाएं। यह स्क्रिप्ट में MC_fac के मूल्य को 1 से सेट करके और फिटिंग को कई बार दोहराकर (आमतौर पर >20 दोहराता है)। प्रत्येक पैरामीटर पर त्रुटि वितरण के मानक विचलन के रूप में अनुमानित है।
   नोट: 1 MC_fac सेट करने से एक सिंथेटिक डेटासेट उत्पन्न होता है जिसमें एक गॉसियन वितरित त्रुटि (प्रायोगिक त्रुटि के आधार पर गणना) को प्रायोगिक डेटा में जोड़ा जाता है।

Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप ^{1 एच-15}एन ट्रोसी स्पेक्ट्रम(चित्रा 3 ए)में प्रत्येक चोटी के लिए आरडी प्रोफाइल का अधिग्रहण होता है। अधिग्रहीत आरडी प्रोफाइल से, प्रत्येक रीढ़ की हड्डी के ¹⁵एन ट्रांसवर्स छूट(चित्रा 3 ए,3बी)में विनिमय योगदान का अनुमान लगाना संभव है। जांच के तहत प्रोटीन की 3 डी संरचना पर आर_{पूर्व} की साजिश रचकर, माइक्रोन-एमएस टाइम स्केल(चित्रा 3सी)पर अनुरूप विनिमय के दौर से गुजर रहे संरचनात्मक क्षेत्रों की पहचान करना संभव है। कार्वर-रिचर्ड्स समीकरण का उपयोग करके आरडी घटता का मॉडलिंग विनिमय प्रक्रिया पर थर्मोडायनामिक और गतिज मापदंडों को देता है, जैसे संतुलन में राज्यों की आंशिक आबादी और इन राज्यों के बीच विनिमय की दर(चित्रा 1, चित्रा 3 डी)। इन थर्मोडायनामिक और गतिज मापदंडों की तापमान निर्भरता (कई प्रयोगात्मक तापमान पर आरडी प्रयोगों को प्राप्त करके प्राप्त) को क्रमशः वैन टी हॉफ और आयरिंग समीकरणों का उपयोग करके मॉडलिंग की जा सकती है, ताकि अनुरूप विनिमय(चित्रा 3E)^9,10के एनर्जेटिक्स के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त की जा सके।

चित्रा 1:सीपीएमजी आरडी प्रयोग का अवलोकन। (A)आरडी डेटा के अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले सीपीएमजी ब्लॉक का योजनाबद्ध दृश्य। 180 ° दालों को काले आयतों के रूप में दिखाया गया है। ऑपरेटर चुंबकीकरण को इंगित करता है जो सीपीएमजी ब्लॉक में प्रवेश करता है और बाहर निकलता है। सीपीएमजी क्षेत्र का निर्धारण बाद में पुनर्केंद्रित दालों (21)के बीच की दूरी से होता है। (ख)दो बार के बिंदु माप में, छूट में देरी (जिसके दौरान सीपीएमजी ब्लॉक लागू किया जाता है) को स्थिर रखा जाता है और सीपीएमजी क्षेत्र एन के मूल्यों को अलग-अलग करके भिन्न होता है (समय की संख्या में सीपीएमजी ब्लॉक छूट देरी अवधि के दौरान लागू किया जाता है) और α. (ग)संरचना ए और बी के बीच दो साइट संतुलन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । विनिमय दर स्थिर (कश्मीर_{पूर्व)}क्रमशः आगे और रिवर्स दर स्थिर कश्मीर_एबी और कश्मीर_बीएका योग है। पी_ए और पी_बी (= 1 - पी_ए)क्रमशः प्रजातियों ए और बी की आंशिक आबादी हैं। इसके बाद_एबी सीपीएमजी(ऊपरबाएं) द्वारा सुलभ रेंज में आने वाली विनिमय प्रक्रियाओं के लिए रासायनिक बदलाव का अंतर है, सीपीएमजी (ऊपर दाएं) द्वारा पता लगाया जाना बहुत तेज है, और एक ω के साथ बहुत छोटा_है सीपीएमजी (नीचे बाएं) द्वारा पता लगाया जाना है। पी_बी वैल्यू 3% तक सेट की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2:आरडी डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए मुख्य पाइपलाइन। वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 3:CPMG RD प्रयोगों द्वारा ईआईसी की μs-ms गतिशीलता । (A)   उदाहरण ¹⁵एन आरडी प्रोफाइल ४० डिग्री सेल्सियस और ईआईसी के लिए ८०० मेगाहर्ट्ज यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर मापा । आर_एक्स का अनुमान लाल रंग में दिखाया गया है। (ख)आर_{पूर्व} मूल्यों को अवशेष सूचकांक बनाम प्लॉट किया जाता है और एंजाइम की एक्स-रे संरचना पर(सी)को अनुरूप विनिमय से गुजर रहे अवशेषों की पहचान करने के लिए । (घ)त्रुटि से बड़े आर_{पूर्व} के साथ एनएमआर संकेतों को मॉडलिंग किया जाता है (पूरक फ़ाइलोंमें प्रदान की गई स्क्रिप्ट का उपयोग करना) संतुलन के काइनेटिक्स (के_एबी और के_बीए)और थर्मोडायनामिक्स (पी_बी)प्राप्त करने के लिए। (ई)कई तापमान पर आरडी डेटा का अधिग्रहण अनुरूप परिवर्तन के एनर्जेस के बारे में जानकारी देता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइलें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह पांडुलिपि प्रोटीन पर ¹⁵एन आरडी डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। विशेष रूप से, एनएमआर नमूना तैयार करने, एनएमआर डेटा की माप और आरडी प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। नीचे आरडी प्रयोगों के अधिग्रहण और विश्लेषण के संबंध में कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं पर चर्चा की जाती है। हालांकि, प्रयोग और डेटा विश्लेषण के अधिक गहन विवरण के लिए, मूल साहित्य का सावधानीपूर्वक अध्ययन करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है^{3,8,11,15,16।}

एनएमआर नमूना तैयार करते समय, यह विचार करना अत्यंत महत्वपूर्ण है कि μs-ms टाइमस्केल पर प्रमुख, एनएमआर दृश्यमान प्रजातियों के बदले में किसी भी मामूली (<1% आबादी वाले) राज्य की उपस्थिति पता लगाने योग्य आरडी प्रोफाइल¹उत्पन्न करेगी। इसलिए, संदूषकों की उपस्थिति से बचने के लिए अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन स्टॉक (>90% शुद्ध) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो जांच के तहत प्रणाली के साथ क्षणिक परिसर बना सकता है। इसके अलावा, यदि प्रोटीन-लिगांड परिसरों में अनुरूप गतिशीलता की जांच की जाती है, तो लिगांड बाइंडिंग के काइनेटिक्स द्वारा उत्पन्न नकली आरडी प्रोफाइल की उपस्थिति से बचने के लिए लिगांड की संतृप्त सांद्रता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

उच्च आणविक वजन प्रणालियों (>20 केडीए) के साथ काम करते समय, यह भी सलाह दी जाती है (हालांकि आवश्यक नहीं) के लिए छिद्रित प्रोटीन नमूनों और TROSY पल्स अनुक्रम वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ प्रस्तुत करने के लिए ट्रांसवर्स विश्राम दर को कम करने और विश्राम अवधि को अधिकतम करने के लिए (हमारे पल्स कार्यक्रम में d30) का उपयोग करें । दरअसल, सबसे कम प्राप्य के रूप में_{बीएमजी}। = 4/d30, एक लंबी छूट अवधि का उपयोग कर छोटे_{10 सीपीएमजी}पर आर₂ डेटा के अधिग्रहण की अनुमति देता है, जहां आर₂ के लिए विनिमय योगदान अपने अधिकतम पर है । इस संबंध में, यह भी उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ प्रदान किए गए एक के समान पल्स अनुक्रम स्पेक्ट्रोमीटर (फाइल नाम: trhncorexf3gp) के मानक पल्स अनुक्रम पोर्टफोलियो में मौजूद है। दो फाइलों के बीच मुख्य अंतर यह है कि मानक अनुक्रम एक TROSY-HNCO प्रयोग पर आधारित है, जबकि हमारा प्रयोग एक TROSY-HSQC प्रयोग पर आधारित है और नमूने के ¹³सी लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है ।

एक और मुद्दा ध्यान से विचार करने के लिए अधिग्रहण तापमान है । दरअसल, चूंकि आरडी डेटा को आमतौर पर कई स्थिर क्षेत्रों में मापा जाता है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि अधिग्रहण का तापमान उपयोग किए जाने वाले सभी स्पेक्ट्रोमीटर के बीच सुसंगत हो। इसलिए, प्रयोग स्थापित करने से पहले तापमान अंशांकन की जांच करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

आरडी घटता के विश्लेषण से संबंधित है, इसके लिए यह तनाव देना महत्वपूर्ण है कि यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं और फिटिंग लिपियों कार्वर-रिचर्ड्स समीकरणों का उपयोग करें। हालांकि यह आरडी डेटा के मात्रात्मक मॉडलिंग के लिए साहित्य में लागू सबसे आम प्रक्रिया है, कार्वर रिचर्ड्स समीकरणों में कई अनुमान शामिल हैं और दो साइट एक्सचेंज केस¹⁷तक सीमित हैं। यदि किसी विशेष डेटासेट को डेटा मॉडलिंग के लिए अधिक कठोर ब्लोच-मैककॉनेल मैट्रिस की आवश्यकता होती है, तो फिटिंग प्रक्रिया को^{तदनुसार 18,19,20}के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए। ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल में, कुछ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज सूचीबद्ध हैं जो ब्लोच-मैककॉनेल सिद्धांत का उपयोग करके डेटा मॉडलिंग करते हैं।

अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, हालांकि हमारी पांडुलिपि प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए पूरी तरह से ¹⁵एन आरडी डेटा के अनुप्रयोग पर केंद्रित है, साहित्य में कई अन्य प्रयोगों का वर्णन किया गया था ताकि विभिन्न नाभिक और अन्य जैविक और गैर-जैविक आणविक प्रणालियों^{18, 19,21,22,23}पर आरडी घटता को मापने^केलिए साहित्य में वर्णित किया गया । विशेष रूप से विभिन्न नाभिक का उपयोग अत्यंत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह प्रोटीन संरचना के अधिक घने नमूने की अनुमति देता है और साइड-चेन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है जोइस प्रोटोकॉल ^{5, 21,23}में प्रस्तुत¹⁵एन-आधारित प्रयोग द्वारा काफी हद तक^{अवहेलना}करते हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe	Improve sensitivity
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	756822-1	>99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge	United Scientific supply	CENTFG1	Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer	Bruker	Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800	Acquisition of the NMR data
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette	Corning Incorporation	7095D-NMR	Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube	Willmad Precision	535-PP-7	5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe	Institute of Biosciences and Biotechnology research	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	NMR data processing
SPARKY	University of California, San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	Acquisition Software