Hier wird eine detaillierte Beschreibung des im Labor implementierten Protokolls zur Erfassung und Analyse von 15 NRelaxationsdispersionsprofilen mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie bereitgestellt.
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Methodenartikel
15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Proteinkonformationsdynamik spielt eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der enzymatischen Katalyse, Ligandenbindung, Allostersion und Signalisierung, die wichtige biologische Prozesse sind. Zu verstehen, wie das Gleichgewicht zwischen Struktur und Dynamik die biologische Funktion steuert, ist eine neue Grenze in der modernen Strukturbiologie und hat mehrere technische und methodische Entwicklungen ausgelöst. Unter diesen liefern CPMG-Relaxationsdispersionslösungs-NMR-Methoden einzigartige, atomar aufgelöste Informationen über die Struktur, Kinetik und Thermodynamik von Proteinkonformationsgleichgewichten, die auf der μs-ms-Zeitskala auftreten. Hier präsentiert die Studie detaillierte Protokolle zur Erfassung und Analyse eines 15 NRelaxationsdispersionsexperiments. Als Beispiel wird die Pipeline zur Analyse der μs-ms-Dynamik in der C-terminalen Domäne des Bakteriums Enzym I gezeigt.
Einleitung
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) Relaxation Dispersion (RD) Experimente werden auf einer Routinebasis verwendet, um Konformationsgleichgewichte auf der μs-ms-Zeitskala durch Lösungs-NMR-Spektroskopie1,2,3,4,5zu charakterisieren. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamik sind CPMG-Techniken auf modernen NMR-Spektrometern relativ einfach zu implementieren, erfordern keine speziellen Probenvorbereitungsschritte (z. B. Kristallisation, Prob....
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Protokoll
1. Vorbereitung der NMR-Probe
- Exprimieren und reinigen Sie eine 2H,15N-labierte Probe des interessierenden Proteins.
HINWEIS: Während eine 15N-markierte Proteinprobe für die Erfassung des CPMG RD-Experiments verwendet werden kann, erhöht die Perdeuteration (wo möglich) die Qualität der erhaltenen Daten dramatisch. Protokolle zur Herstellung von perdeuterierten Proteinen sind in der Literatur13verfügbar. - Puffer tauschen die gereinigte Proteinprobe in einen entgasten NMR-Puffer aus.
- Die NMR-Probe wird in das NMR-Röhrchen überführen.
HINWEIS: Die Konzentration der NMR-Probe muss ....
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Ergebnisse
Das hier beschriebene Protokoll führt zur Erfassung von RD-Profilen für jeden Peak im 1H-15N TROSY-Spektrum (Abbildung 3A). Aus den gewonnenen RD-Profilen ist es möglich, den Austauschbeitrag zur 15N Querrelaxation jeder Backbone-Amid-Gruppe abzuschätzen (Abbildung 3A,3B). Durch die Darstellung des Rex auf der 3D-Struktur des untersuchten Proteins ist es möglich, die Strukturregionen, die sich einem Ko.......
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Diskussion
Dieses Manuskript beschreibt das im Labor implementierte Protokoll zur Erfassung und Analyse von 15N RD-Daten über Proteine. Insbesondere werden die entscheidenden Schritte zur Vorbereitung der NMR-Probe, zur Messung der NMR-Daten und zur Analyse der RD-Profile behandelt. Im Folgenden werden einige wichtige Aspekte bezüglich der Erfassung und Analyse von RD-Experimenten diskutiert. Für eine eingehendere Beschreibung des Experiments und die Datenanalyse wird jedoch ein sorgfältiges Studium der Originalliteratur.......
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Offenlegungen
Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt. Wir erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Mittel von NIGMS R35GM133488 und vom Roy J. Carver Charitable Trust an V.V. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kryosonde | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D Kryosonde | Verbessert die Empfindlichkeit |
| Deuteriumoxid | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99,8% rein, wird bei der Vorbereitung von NMR-Proben und deuterierten Kulturen verwendet |
| Handbetriebene Zentrifuge | United Scientific Supply | CENTFG1 | Wird verwendet, um Luftblasen oder Flüssigkeitsreste zu entfernen, die an den Wänden des NMR-Röhrchens haften. |
| Hochfeld-NMR-Spektrometer | Bruker Bruker | Avance II 600, Bruker Avance 800 | Erfassung der NMR-Daten |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modellierung der NMR-Daten |
| NMR-Pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex Glaspastuerpipette zum Transfer der flüssigen Probe in ein NMR-Röhrchen |
| NMR-Röhrchen | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5 mm dünnwandiges 7'' Zylinderglasrohr |
| NMRPipe | Institut für Biowissenschaften und Biotechnologie Forschung | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR-Datenverarbeitung |
| SPARKY | University of California, San Francisco | Analyse der NMR-Daten | |
| Tospin 3.2 (oder neuer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html Erfassungssoftware |
Referenzen
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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Nachdrucke und Genehmigungen
