Summary
Burada 15 Ngevşeme dispersiyon profillerinin çözelti NMR spektroskopisi ile edinilmesi ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokolün detaylı bir açıklaması sağlanmaktadır.
Abstract
Protein konformasyonsal dinamikleri, önemli biyolojik süreçler olan enzimatik kataliz, ligand bağlama, allosteri ve sinyalizasyonun düzenlenmesinde temel roller oynar. Yapı ve dinamikler arasındaki dengenin biyolojik işlevi nasıl yönettiğini anlamak, modern yapısal biyolojide yeni bir sınırdır ve çeşitli teknik ve metodolojik gelişmelerin fitilini ateşlemiştir. Bunlar arasında, CPMG gevşeme dispersiyon çözümü NMR yöntemleri, μs-ms zaman ölçeğinde meydana gelen protein konformasyonsal dengenin yapısı, kinetiği ve termodinamiği hakkında benzersiz, atomik çözünürlüklü bilgiler sağlar. Burada, çalışma 15 Ngevşeme dispersiyon deneyinin edinilmesi ve analizi için ayrıntılı protokoller sunmaktadır. Örnek olarak, bakteri Enzim I'in C-terminal etki alanındaki μs-ms dinamiklerinin analizi için boru hattı gösterilmiştir.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) gevşeme dispersiyon (RD) deneyleri, μs-ms zaman ölçeğinde meydana gelen konformasyonel dengeyi NMR spektroskopisi1, 2,3,4,5çözeltisi ile karakterize etmek için rutin bir tabanda kullanılır. Konformasyonel dinamiklerin araştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, CPMG tekniklerinin modern NMR spektrometrelerinde uygulanması nispeten kolaydır, özel numune hazırlama adımları (örneğin, kristalizasyon, numune dondurma veya hizalama ve/veya floresan veya paramanyetik etiketli kovalent konjugasyon) gerektirmez ve değişim süreçlerinde yapısal, kinetik ve termodinamik bilgileri döndüren konformasyonel dengenin kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesini sağlar. Bir CPMG deneyinin konformasyonsal bir dengeyi rapor edebilmesi için iki koşul geçerli olmalıdır: (i) gözlemlenen NMR dönüşleri, konformasyonsal değişime uğrayan durumlarda farklı kimyasal kaymalara sahip olmalıdır (mikro durumlar) ve (ii) değişimin ~50 μs ile ~10 ms arasında değişen bir zaman ölçeğinde gerçekleşmesi gerekir. Bu koşullar altında, gözlemlenen enine gevşeme oranı ( 
) iç R 2 'nin(μs-ms dinamiklerinin yokluğunda ölçülen R2) 
ve enine gevşemeye değişim katkısının (Rex)toplamıdır. R2obs'a Rex katkısı, darbe dizisinin CPMG bloğunu oluşturan 180 ° darbeler arasındaki aralığı azaltarak kademeli olarak söndürülebilir, ve ortaya çıkan RD eğrileri, mikro devletler arasındaki kimyasal kayma farkını, her mikro devletteki kesirli popülasyonu ve mikro devletler arasındaki değişim oranlarını elde etmek için Bloch-McConnell teorisi kullanılarak modellenebilir (Şekil 1)1,2,3.
Literatürde 15 NCPMG deneyi için birkaç farklı nabız dizisi ve analiz protokolü bildirilmiştir. Burada laboratuvarda uygulanan protokol açıklanmıştır. Özellikle, NMR örneğinin hazırlanması, NMR deneylerinin kurulması ve alınması ve NMR verilerinin işlenmesi ve analizi için önemli adımlar tanıtılacaktır (Şekil 2). Protokolün diğer laboratuvarlara aktarılmasını kolaylaştırmak için, darbe programı, işleme ve analiz komut dosyaları ve bir örnek veri kümesi Ek Dosyalar olarak sağlanır ve (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html. Sağlanan darbe dizisi, ofset bağımlı yapıtların6'nın bastırılması için CPMG bloğunda dört adımlı bir faz döngüsü içerir ve birkaç aralanmış deneyin alınması için kodlanmıştır. Bu aralanmış deneyler aynı gevşeme süresine sahiptir, ancak farklı CPMG alanları elde etmek için farklı sayıda yeniden odaklama darbeleri7. Açıklanan darbe programının NMR sinyali8'inTROSY bileşeninin 15N R 2'yi ölçtüklerine dikkat etmek de önemlidir. Genel olarak, orta ve büyük boyutlu proteinler 4 ,5,9,10'dakonformasyonsal değişimin karakterizasyonu için protokolbaşarıylauygulanmıştır. Daha küçük sistemler (<20 kDa) için Heteronuclear Tek Kuantum Tutarlılığı (HSQC) tabanlı darbe dizisi11,12 kullanılması önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NMR örneğinin hazırlanması
- İlgi proteininin 2H,15N-labled örneğini eksprese edin ve arındırın.
NOT: CPMG RD deneyinin alınması için 15N etiketli protein örneği kullanılabilirken, perdeuterasyon (mümkünse) elde edilen verilerin kalitesini önemli ölçüde artırır. Perdeuterated proteinlerin üretimine ilişkin protokoller literatürde mevcuttur13. - Tampon, saflaştırılmış protein örneğini gazsız bir NMR tamponuna değiştirir.
- NMR örneğini NMR tüpüne aktarın.
NOT: Sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak ve protein-protein etkileşimlerinin oluşumunu en aza indirmek için NMR örneğinin konsantrasyonunun dikkatlice optimize edilmesi gerekir. Genel olarak, CPMG deneyleri için tipik konsantrasyon aralığı 0.1-1.0 mM'dir.
2. NMR deneyinin ilk kurulumu
- Ek Dosyaları indirin ve fermini çözün.
- Bits.vv ve trosy_15N_cpmg.vv dosyalarını (pulseprogram adlı klasörde bulunur) darbe programı dizinine (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user) kopyalayın.
NOT: trosy_15N_cpmg.vv dosyasının ilk satırında listelenen bits.vv yolunun doğru olduğundan emin olun. - Edinme yazılımını açın ve daha önce çalıştırılan 1H-15 NHSQC denemesini edckomutunu kullanarak yeni bir denemeye kopyalayın.
- Komut pulprogkullanarak, darbe programı trosy_15N_cpmg.vv yeni oluşturulan deney içine yükleyin.
- Nabız programı dosyasının (trosy_15N_cpmg.vv) sonunda sağlanan yönergeleri kullanarak CPMG denemesini ayarlayın.
3. NMR deneyinin rutin kurulumu
- Numuneyi mıknatısa tanıtın ve herhangi bir NMR deneyinin alınması için tüm temel adımları uygulayın: numuneyi kilitleyin ve dolgunlanın; 1H ve 15 Nkanallarını eşleştirin ve ayarlayın.
- p1 ve p7'yi sırasıyla 1H ve 15 Nsert 90° darbe süresine ayarlayın.
NOT: Optimum sonuçlar için 15 N90° darbeyi büyük bir dikkatle kalibre etmek önemlidir. Kalibrasyon genellikle spektrometre kılavuzunda açıklandığı gibi DMSO'daki 15N etiketli ürenin 100 mM'lik bir örneği kullanılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, ilk INEPT bloğunun 15N 90° darbesinin 180 ° darbeye geçirildiği 1 H-15N HSQC spektrumunun ilk artımını alarak kalibrasyonu doğrudan çalışan NMR örneğinde iki kez kontrol etmek mümkündür. Kalibrasyon doğruysa, bir null elde edilmelidir. - Edinme penceresinde, 1 H ve 15 Nboyutları için merkez ve spektral genişliği ayarlayın.
NOT: Optimum su bastırma için 1H spektrumunu su sinyalinin frekansı cinsinden ortalayın. - Gevşeme gecikmesini (d30) 0,7 T2'ye eşit olarak ayarlayın , burada T2 proteininizin beklenen 15N enine gevşeme süresidir.
NOT: D30 değeri, en iyi sonuçları elde etmek için ampirik olarak optimize edilebilir. - Şekil 1A ve Şekil 1B'deki n parametresine karşılık gelen tamsayı numaralarının listesini oluşturmak için komut vclist'inikullanın. Listedeki her girişin νcpmg= 4 x n / d30'a göre farklı bir CPMG alanına (νcpmg) karşılık geldiğine emin olun. Listedeki ilk sayının 0 olduğundan emin olun (bu, CPMG bloğunun atladığı başvuru deneyine karşılık gelir ve d30 = 0 s) ve 1.000 x d30 / 4'ten büyük sayılar kullanmamaya dikkat edin. Bu eşikten daha büyük sayılar νcpmg > 1 kHz ile sonuçlanır ve proba zarar verebilir.
- l8'i vclist'teki girdi sayısına, l3'ü dolaylı boyut için gerçek nokta sayısına (genellikle l3 için 64-200 aralığı ayarlanır) ve l8 x l3 x 2'ye eşit 1 td olarak ayarlayın.
NOT: Su bastırmayı optimize etmek için 3.7-3.11 adımlarını uygulayın. - Alıcı kazancını (rg) 1 olarak ayarlayın; pulse program dosyasını (edcpul) açın, satır 91'e gidin, goto 999'danönceki noktalı virgülü çıkarın ve dosyayı kaydedin.
- Gs komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için spdb0 (veya spdw0) parametrelerini ayarlayın.
- Darbe programı dosyasının 91.
- SPDB11 (pulse program dosyasının satır 168), spdb2 (pulse program dosyasının satır 179) ve pldb2 (pulse program dosyasının satır 184) optimize etmek için 3.7-3.9 adımlarını tekrarlayın.
- Alıcı kazancını en iyi duruma getirmek için rga komutunu çalıştırın.
- Tarama sayısını (ns) 8'in katına ayarlayın.
- Denemeyi başlatmak için zg komutunu çalıştırın.
4. NMR verilerinin işlenmesi ve analizi
- İşlem ( EkDosyalar) adlı klasörü, ser dosyasını içeren dizine kopyalayın.
- NMR verilerini işlemek için sep_fid.com ve ft2D.com dosyaları kullanın.
NOT: İşleme komut dosyalarının nasıl düzenleneceği ile ilgili talimat sep_fid.com ve ft2D.com dosyalarında sağlanır. - Sparky'deki dizin CPMG_Sparky_files bulunan ucsf dosyalarını açın.
NOT: Ucsf dosyaları işleme komut dosyaları tarafından oluşturulur. Vclist her girdi için bir ucsf dosyası vardır. İlk ucsf dosyası (test_1.ucsf) başvuru deneyini içerir. Sonraki ucsf dosyaları (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) en düşükten en büyük νcpmgdeğerine kadar sıralanır. - Referans NMR spektrumunda (test_1.ucsf) NMR çapraz zirvelerini seçin.
- Sparky komut pa'sını kullanarak tüm seçili çapraz tepeleri seçin.
- Sparky komut rh komutunu çalıştırın. Bu komut bir iletişim penceresi açar. Her spektrumda aynı konumdaki seçenek yükseklikleriniseçin. Kur'a tıklayın ve tüm NMR spektrumlarını kontrol edin. Güncelleştir'i tıklatın ve çıktı dosyasını çalışma dizinine kaydedin. Çıkış dosyası, tüm açılan NMR spektrumları üzerindeki sinyal yoğunluklarının matrisini içerir.
NOT: Aralanmış sahte 3D deneylerden kaynaklanan yoğunlukları kurtarmak için çizgi şekli uydurması kullanan daha doğru protokoller literatürde açıklanmıştır14. Hat şekli montajı için serbestçe kullanılabilen yazılım https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) ve NMRPipe (nLinLS modülü) ve SPARKY (it modülü) içinde mevcuttur. - Her CPMG alanı için, I0 ve I
d30 sırasıyla referansın (vc = 0) ve rahat (vc > 0) NMR spektrumunun yoğunluğu olduğu formülü kullanarak sinyal yoğunluklarını R 2 oranlarına dönüştürün.
NOT: Ek Dosyalar'da, sinyal yoğunluklarını R2 oranlarına dönüştürmek ve RD profillerini görselleştirmek için kullanılan elektronik tablo dosyasının (R2_calc.xls) bir şablonu sağlanır. - Sparky komutunu kullanarak referans spektrumundaki gürültü düzeyini okuyun ve hatayı R2 hızlarında yayın.
NOT: Ek Dosyalar'da, ölçülen R2 oranlarında hatayı yaymak için kullanılan elektronik tablo dosyasının (R2_calc.xls) bir şablonu sağlanır.
d30 sırasıyla referansın (vc = 0) ve rahat (vc > 0) NMR spektrumunun yoğunluğu olduğu formülü kullanarak sinyal yoğunluklarını R 2 oranlarına dönüştürün.5. RD eğrilerini sığdırma
- RD_fitting (Ek Dosyalar) adlı klasörü çalışma dizinine kopyalayın.
- Atanan her NMR zirvesi için, Rex'i hesaplayarak tahmin
edin ve 
vclist'teki en düşük ve en yüksek νcpmg'de ölçülen R2 oranlarıdır.
- Rd eğrilerini tahmini hatanın iki katından daha büyük Rex ile görsel olarak inceleyin ve doğru şekilde modellenemeyecek kadar gürültülü olan tüm RD eğrilerini atın.
NOT: Rex üzerindeki gürültü, üzerindeki ve üzerindeki hatalardan yayılabilir. - Rex tahmini hatanın iki katından daha büyük olan tüm RD eğrilerini kullanarak uydurma komut dosyası için bir giriş dosyası hazırlayın.
NOT: Giriş dosyalarının hazırlanmasına ilişkin ayrıntılı talimat, uygun komut dosyaları içinde sağlanır. Örnek giriş dosyaları Ek Dosyalarolarak sağlanır. Genellikle, RD verileri iki farklı statik alanda ölçülür ve aynı anda takılır. Bu protokolde, iki farklı giriş dosyası gereklidir (Ek Dosyalar). - Ek Dosyalar 'da sağlanan komut dosyalarını kullanarak RD verilerini sığdırın.
NOT: RD eğrilerinin artık tabanlı veya genel bir sığdırmasını gerçekleştirmek için sırasıyla iki farklı komut dosyası sağlanır. Her iki komut dosyası da iki siteli değişim modeli ve Carver-Richards denklemi kullanarak RD eğrilerine uyar. Uygun komut dosyaları içinde daha ayrıntılı talimatlar sağlanır. Block-McConnell denklemlerini kullanarak veri uydurmayı gerçekleştirmek için Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) ve CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) gibi ek yazılım paketleri mevcuttur. - Azaltılmış χ 2'yi pb ve k ex işlevi olarak tahmin eden takılı parametrelerin güvenilirliğini testedin.
NOT: Azaltılmış χ2 çıktı dosyasında sağlanır. pb ve kex, montaj prosedürlerinde alt ve üst sınırlar kullanılarak belirli değerlere göre kısıtlanabilir. Komut dosyalarımızda, pb için alt ve üst sınırlar sırasıyla lb(2) ve ub(2'dir. kex için alt ve üst sınırlar sırasıyla lb(3) ve ub(3)'dir. - Takılan parametrelerdeki hatayı tahmin edin. Bu, komut dosyasındaki MC_fac değerini 1 olarak ayarlayarak ve sığdırma işlemi birden çok kez yinelenerek yapılabilir (genellikle >20 yineler). Her parametredeki hata, dağılımın standart sapması olarak tahmin edilir.
NOT: MC_fac 1 olarak ayarlamak, gauss dağıtılmış hatasının (deneysel hataya göre hesaplanır) deneysel verilere eklenmediği sentetik bir veri kümesi oluşturur.
edin ve 
vclist'teki en düşük ve en yüksek νcpmg'de ölçülen R2 oranlarıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol, 1 H- 15 NTROSY spektrumundaki her tepe için RD profillerinin alınmasıyla sonuçlanır (Şekil 3A). Edinilen RD profillerinden, her omurga amid grubunun 15 Nenine gevşemesine değişim katkısını tahmin etmek mümkündür (Şekil 3A,3B). Rex'i incelenen proteinin 3D yapısı üzerine çizerek, μs-ms zaman ölçeğinde konformasyonsal değişime uğrayan yapısal bölgeleri tanımlamak mümkündür (Şekil 3C). Carver-Richards denklemi kullanılarak RD eğrilerinin modellenerek, dengedeki durumların kesirli popülasyonları ve bu durumlar arasındaki değişim oranı gibi değişim sürecinde termodinamik ve kinetik parametreler döndürülür (Şekil 1, Şekil 3D). Bu termodinamik ve kinetik parametrelerin sıcaklık bağımlılığı (birden fazla deneysel sıcaklıkta RD deneyleri alınarak elde edilir), konformasyonsal değişimin enerjileri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için sırasıyla van't Hoff ve Eyring denklemleri kullanılarak modellenebilir (Şekil 3E)9,10.
Şekil 1: CPMG RD deneyine genel bakış. (A) RD verilerinin alınması için kullanılan CPMG bloğunun şematik görünümü. 180° darbeler siyah dikdörtgenler olarak gösterilir. Operatör, 
CPMG bloğuna giren ve çıkan mıknatıslamayı gösterir. CPMG alanı, sonraki yeniden odaklama darbeleri arasındaki aralıkla belirlenir (2φ). (B) İki zamanlı bir nokta ölçümünde, gevşeme gecikmesi (CPMG bloğunun uygulandığı) sabit tutulur ve CPMG alanı n değerlerini değiştirerek değişir (gevşeme gecikmesi süresi boyunca CPMG bloğunun uygulanma sayısı) ve δ. (C) A ve B konfekasyonları arasındaki iki siteli dengenin şematik gösterimi. Döviz kuru sabiti (kex),sırasıyla kab ve kbaileri ve ters oran sabitlerinin toplamıdır. pa ve pb (= 1 - pa)sırasıyla A ve B türlerinin kesirli popülasyonlarıdır. Δωab, A ve B konformasyonlarıarasındaki kimyasal kayma farkıdır. pb değeri %3 olarak ayarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: RD verilerinin alınması ve analizi için ana işlem hattı. Mevcut iletişim kuralında açıklanan iş akışının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CPMG RD deneyleri ile EIC'nin μs-ms dinamikleri. (A) Örnek 15N RD profilleri burada açıklanan protokol kullanılarak EIC için 40 °C ve 800 MHz olarak ölçtü. Rex tahmini kırmızı ile gösterilir. (B) Rex değerleri kalıntı indeksine ve (C) konfiformasyonsal değişime uğrayan kalıntıları tanımlamak için enzimin X-ışını yapısına göre çizilir. (D) Hatadan daha büyük Rex ile NMR sinyalleri, dengenin kinetiğini (kab ve kba)ve termodinamiği (pb)elde etmek için modellenir (Ek Dosyalar'dasağlanan komut dosyası kullanılarak). (E) RD verilerinin birden fazla sıcaklıkta alınması, konformasyonsal değişimin enerjileri hakkında bilgi verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosyalar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, proteinler üzerinde 15 NRD verinin eldei ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokol açıklanmaktadır. Özellikle, NMR örneğinin hazırlanması, NMR verilerinin ölçümü ve RD profillerinin analizi için önemli adımlar ele alınmıştır. Aşağıda RD deneylerinin edinimi ve analizi ile ilgili bazı önemli hususlar tartışılmıştır. Bununla birlikte, deney ve veri analizinin daha derinlemesine tanımlanması için, orijinal literatürün dikkatli bir şekilde incelenmesi şiddetle tavsiye edilir3,8,11,15,16.
NMR örneğini hazırlarken, μs-ms zaman ölçeğindeki büyük, NMR görünür türleri ile karşılığında herhangi bir küçük (% <1 nüfuslu) devletin varlığının tespit edilebilir RD profilleri oluşturacağını göz önünde bulundurmak son derece önemlidir1. Bu nedenle, incelenen sistemle geçici kompleksler oluşturabilecek kirleticilerin varlığını önlemek için yüksek oranda saflaştırılmış bir protein stoğunun (% >90 saf) kullanılması önerilir. Ek olarak, protein-ligand komplekslerindeki konformasyonsal dinamikleri araştırıyorsanız, ligand bağlama kinetiğinden kaynaklanan sahte RD profillerinin varlığını önlemek için doygunluk konsantrasyonlarında ligand kullanmak önemlidir.
Yüksek moleküler ağırlık sistemleriyle (>20 kDa) çalışırken, enine gevşeme oranını azaltmak ve gevşeme süresini en üst düzeye çıkarmak için perdeuterated protein örneklerinin ve mevcut protokolle sunulan TROSY darbe dizisinin (nabız programımızda d30) kullanılması da tavsiye edilir (gerekli olmasa da). Gerçekten de, elde edilebilir en düşük νcpmgolarak . = 4/d30, uzun bir gevşeme süresi kullanarak R2 verilerinin küçük νcpmg'de eldeilmesine izin verir , burada R2'ye değişim katkısı maksimumdadır. Bu bakımdan spektrometrenin standart darbe sırası portföyünde (dosya adı: trhncorexf3gp) mevcut protokolle sağlanana benzer bir darbe dizisinin mevcut olduğunu da belirtmek önemlidir. İki dosya arasındaki temel fark, standart sıranın bir TROSY-HNCO deneyine dayanması, denememizin ise trosy-HSQC deneyine dayanması ve örneğin 13C etiketlenilmesini gerektirmemiş olmasıdır.
Dikkatle ele alınması gereken bir diğer konu da alım sıcaklığıdır. Aslında, RD verileri genellikle birden fazla statik alanda ölçüldüğü için, alım sıcaklığının kullanılan tüm spektrometreler arasında tutarlı olması çok önemlidir. Bu nedenle, denemeyi kurmadan önce sıcaklık kalibrasyonunu kontrol etmeniz şiddetle tavsiye edilir.
RD eğrilerinin analiziyle ilgili olarak, burada sunulan prosedürlerin ve uydurma komut dosyalarının Carver-Richards denklemlerinden yararlandığını vurgulamak önemlidir. Bu, RD verilerinin nicel modellemesi için literatürde uygulanan en yaygın prosedür olsa da, Carver Richards denklemleri bir dizi yaklaşım içerir ve iki siteli değişim durumu17ile sınırlıdır. Belirli bir veri kümesi, veri modellemesi için daha titiz Bloch-McConnell matrisleri gerektiriyorsa, montaj prosedürü buna göredeğiştirilmelidir 18,19,20. Yukarıdaki protokolde, Bloch-McConnell teorisini kullanarak veri modellemesi yapan serbestçe kullanılabilen birkaç yazılım paketi listelenmiştir.
Son olarak, makalemiz sadece protein konformasyonsal dinamiklerinin araştırılması için 15 NRD verisinin uygulanmasına odaklansa da, literatürde farklı çekirdekler ve diğer biyolojik ve biyolojik olmayan moleküler sistemler üzerindeki RD eğrilerini ölçmek için birkaç başka deney açıklanmıştır18,19,21,22,23. Özellikle farklı çekirdeklerin kullanımı son derece önemlidir, çünkü protein yapısının daha yoğun bir örneklemesine izin verir ve bu protokolde sunulan 15 Ntabanlı deney tarafından büyük ölçüde göz ardı edilen yan zincir dinamikleri hakkında bilgi sağlar5,21,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar makaleyi okudu ve onayladı. Çıkar çatışması ilan ediyoruz.
Acknowledgments
Bu çalışma NIGMS R35GM133488 ve Roy J. Carver Charitable Trust'tan V.V.'ye fonlarla desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
