Summary
Her gis en detaljert beskrivelse av protokollen implementert i laboratoriet for anskaffelse og analyse av 15N avslapningsdispersjonsprofiler etter løsning NMR spektroskopi.
Abstract
Proteinkonformasjonsdynamikk spiller grunnleggende roller i regulering av enzymatisk katalyse, ligandbinding, allosteri og signalering, som er viktige biologiske prosesser. Å forstå hvordan balansen mellom struktur og dynamikk styrer biologisk funksjon er en ny grense i moderne strukturbiologi og har antent flere tekniske og metodologiske utviklinger. Blant disse gir CPMG avslapningsdispersjonsløsning NMR-metoder unik, atomoppløselig informasjon om strukturen, kinetikken og termodynamikken til proteinkonformasjonslikevekter som forekommer på μs-ms-tidsskalaen. Her presenterer studien detaljerte protokoller for oppkjøp og analyse av et 15N avslapningsspredningseksperiment. Som et eksempel vises rørledningen for analyse av μs-ms-dynamikken i C-terminaldomenet til bakterier Enzyme I.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) avslapningsspredning (RD) eksperimenter brukes på en rutinemessig base for å karakterisere konformasjonslikevekter som forekommer på μs-ms-tidsskalaen ved løsning NMR spektroskopi1,2,3,4,5. Sammenlignet med andre metoder for undersøkelse av konformasjonsdynamikk, er CPMG-teknikker relativt enkle å implementere på moderne NMR-spektrometre, krever ikke spesialiserte prøveprepareringstrinn (dvs. krystallisering, prøvefrysing eller justering, og / eller kovalent konjugering med fluorescerende eller paramagnetisk tag), og gir en omfattende karakterisering av konformasjonslikevekt som returnerer strukturell, kinetisk og termodynamisk informasjon om utvekslingsprosesser. For at et CPMG-eksperiment skal kunne rapportere om en konformasjonslikevekt, må to betingelser gjelde: (i) de observerte NMR-spinnene må ha forskjellige kjemiske skift i tilstandene som gjennomgår konformasjonsutveksling (mikrostater) og (ii) utvekslingen må skje på en tidsskala fra ~ 50 μs til ~ 10 ms. Under disse forholdene er den observerte tverrgående avslapningsraten ( 
) summen av den indre R2 (R2 målt i fravær av μs-ms dynamikk, 
) og utvekslingsbidraget til den tverrgående avslapningen (Rex). Rex-bidraget til R2obs kan gradvis slukkes ved å redusere avstanden mellom 180 ° pulser som utgjør CPMG-blokken i pulssekvensen, og de resulterende RD-kurvene kan modelleres ved hjelp av Bloch-McConnell-teorien for å oppnå den kjemiske skiftforskjellen mellom mikrostater, brøkdelspopulasjonen til hver mikrostat og valutakursene blant mikrotilstander (figur 1)1,2,3.
Flere ulike pulssekvenser og analyseprotokoller er rapportert i litteraturen for 15N CPMG-eksperimenter. Her er protokollen implementert i laboratoriet beskrevet. Spesielt vil de avgjørende trinnene for utarbeidelse av NMR-prøven, oppsett og anskaffelse av NMR-eksperimentene, og prosessering og analyse av NMR-dataene bli introdusert (figur 2). For å lette overføringen av protokollen til andre laboratorier, er pulsprogrammet, prosesserings- og analyseskriptene og ett eksempeldatasett gitt som tilleggsfiler og er tilgjengelige for nedlasting på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medfølgende pulssekvensen inneholder en firetrinns fasesyklus i CPMG-blokken for undertrykkelse av offsetavhengige artefakter6, og den er kodet for anskaffelse av flere sammenflettede eksperimenter. Disse sammenflettede eksperimentene har en identisk avslapningsperiode, men forskjellige antall refokuserende pulser for å oppnå forskjellige CPMG-felt7. Det er også viktig å legge merke til at det beskrevne pulsprogrammet måler 15N R2 av TROSY-komponenten i NMR-signalet8. Totalt sett er protokollen brukt for karakterisering av konformasjonsutveksling i mellomstore og store proteiner4,5,9,10. For mindre systemer (<20 kDa) anbefales det å bruke en Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-basert pulssekvens11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av NMR-prøven
- Uttrykk og rens en 2H,15N-labled prøve av proteinet av interesse.
MERK: Mens en 15N-merket proteinprøve kan brukes til anskaffelse av CPMG RD-eksperimentet, øker perdeuteration (der det er mulig) dramatisk kvaliteten på de oppnådde dataene. Protokoller for produksjon av perdeutererte proteiner er tilgjengelige i litteraturen13. - Bufferen utveksler den rensede proteinprøven til en avgasset NMR-buffer.
- Overfør NMR-prøven til NMR-røret.
MERK: Konsentrasjonen av NMR-prøven må optimaliseres nøye for å maksimere signal-til-støy-forholdet og minimere forekomsten av proteinproteininteraksjoner. Generelt er det typiske konsentrasjonsområdet for CPMG-eksperimenter 0,1-1,0 mM.
2. Første gangs oppsett av NMR-eksperimentet
- Last ned og pakk ut tilleggsfilene.
- Kopier filene bits.vv og trosy_15N_cpmg.vv (plassert i mappen kalt pulseprogram) til pulsprogramkatalogen (
/exp/stan/nmr/lists/pp/user).
MERK: Kontroller at banen til bits.vv som er oppført på den første linjen i trosy_15N_cpmg.vv-filen, er riktig. - Åpne anskaffelsesprogramvare og kopier et tidligere kjørt 1H-15N HSQC-eksperiment til et nytt eksperiment ved hjelp av kommandoen edc.
- Bruk kommandoen pulprog, last pulsprogrammet trosy_15N_cpmg.vv inn i det nyopprettede eksperimentet.
- Sett opp CPMG-eksperimentet ved hjelp av instruksjonene på slutten av pulsprogramfilen (trosy_15N_cpmg.vv).
3. Rutinemessig oppsett av NMR-eksperimentet
- Introduser prøven i magneten og utfør alle de grunnleggende trinnene for oppkjøp av ethvert NMR-eksperiment: lås og shim prøven; matche og stille inn 1H- og 15N-kanalene.
- Still p1 og p7 til varigheten av henholdsvis 1H og 15N harde 90° pulser.
MERK: For optimale resultater er det viktig å kalibrere 15N 90°-pulsen med stor forsiktighet. Kalibrering oppnås vanligvis ved hjelp av en 100 mM prøve av 15N-merket urea i DMSO som beskrevet i spektrometerhåndboken. I tillegg er det mulig å dobbeltsjekke kalibreringen direkte på den fungerende NMR-prøven ved å anskaffe den første økningen av et 1H-15N HSQC-spektrum der 15N 90 ° pulsen til den første INEPT-blokken byttes til en 180 ° puls. Hvis kalibreringen er riktig, bør det oppnås en nullverdi. - I anskaffelsesvinduet angir du senter- og spektralbredden for dimensjonene 1H og 15N.
MERK: Sentrer 1 H-spekteretmed frekvensen av vannsignalet for optimal vannundertrykking. - Still inn avslapningsforsinkelsen (d30) lik 0,7 T2, der T2 er forventet 15N tverrgående avslapningstid for proteinet ditt.
MERK: Verdien av d30 kan optimaliseres empirisk for å oppnå de beste resultatene. - Bruk kommandoen vclist til å opprette en liste over heltall som tilsvarer parameteren n i figur 1A og figur 1B. Kontroller at hver oppføring i listen tilsvarer et annet CPMG-felt (νcpmg) i henhold til νcpmg = 4 x n / d30. Kontroller at det første tallet i listen er 0 (dette tilsvarer referanseeksperimentet som CPMG-blokken hoppes over og d30 = 0 s) og ikke bruke tall som er større enn 1000 x d30 / 4. Tall større enn denne terskelen resulterer i νcpmg > 1 kHz og kan skade sonden.
- Sett l8 til antall oppføringer i vclist, l3 til antall reelle poeng for den indirekte dimensjonen (vanligvis er et område på 64-200 satt til l3) og 1 td lik l8 x l3 x 2.
MERK: Utfør trinnene 3.7-3.11 for å optimalisere vannundertrykkingen. - Sett mottakerforsterkningen (rg) til 1; åpne pulsprogramfilen (edcpul), gå til linje 91, fjern semikolonet før goto 999, og lagre filen.
- Bruk kommandoen gs justere parametrene spdb0 (eller spdw0) for å minimere intensiteten til FID-signalet.
- Gjeninnføre semikolonet på linje 91 i pulsprogramfilen og lagre filen.
- Gjenta trinnene 3.7-3.9 for å optimalisere spdb11 (linje 168 i pulsprogramfilen), spdb2 (linje 179 i pulsprogramfilen) og pldb2 (linje 184 i pulsprogramfilen).
- Kjør kommandoen rga for å optimalisere mottakerforsterkningen.
- Sett antall skanninger (ns) til et multiplum av 8.
- Kjør kommandoen zg for å starte eksperimentet.
4. Behandling og analyse av NMR-dataene
- Kopier mappen Process (Supplemental Files) til mappen som inneholder ser-filen.
- Bruk filene sep_fid.com og ft2D.com til å behandle NMR-dataene.
MERK: Instruksjon om hvordan du redigerer behandlingsskriptene er gitt i sep_fid.com og ft2D.com filer. - Åpne ucsf-filene i katalogen CPMG_Sparky_files i Sparky.
MERK: Ucsf-filene opprettes av behandlingsskriptene. Det finnes én ucsf-fil for hver oppføring i vclist. Den første ucsf-filen (test_1.ucsf) inneholder referanseeksperimentet. De påfølgende ucsf-filene (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) bestilles fra laveste til største verdi av νcpmg. - Velg NMR-krysstoppene på referanse-NMR-spekteret (test_1.ucsf).
- Merk alle de valgte krysstoppene ved hjelp av Sparky-kommandopapa .
- Kjør Sparky -kommandoen rh. Denne kommandoen åpner et dialogvindu. Velg alternativhøydene i samme posisjon i hvert spektrum. Klikk på Oppsett og sjekk alle NMR-spektra. Klikk på Oppdater og lagre utdatafilen i arbeidsmappen. Utdatafilen inneholder matrisen til signalintensitetene over alle åpnede NMR-spektra.
MERK: Mer nøyaktige protokoller som bruker lineshape-tilpasning for å gjenopprette intensiteter fra sammenflettede pseudo-3D-eksperimenter, er beskrevet i litteraturen14. Fritt tilgjengelig programvare for lineshape montering er tilgjengelig på https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), og innenfor NMRPipe (nLinLS modul) og SPARKY (den modul). - For hvert CPMG-felt konverterer du signalintensitetene til R2-hastigheter ved hjelp av formelen
, der I0 og Id30 er intensiteten til referansen (vc = 0) og avslappet (vc > 0) NMR-spektra, henholdsvis.
MERK: I Tilleggsfilerer det gitt en mal for regnearkfilen (R2_calc.xls) som brukes til å konvertere signalintensitetene til R2-hastigheter og visualisere RD-profilene. - Les støynivået i referansespekteret ved hjelp av Sparky-kommando m og forplant feilen på R2-ratene.
MERK: I Tilleggsfilerer det gitt en mal for regnearkfilen (R2_calc.xls) som brukes til å overføre feilen på de målte R2-prisene.
, der I0 og Id30 er intensiteten til referansen (vc = 0) og avslappet (vc > 0) NMR-spektra, henholdsvis.5. Montering av RD-kurver
- Kopier mappen med navnet RD_fitting (Tilleggsfiler) til arbeidsmappen.
- For hver tildelte NMR-topp estimerer du Rex ved å beregne
. 
- Undersøk RD-kurvene visuelt med Rex større enn to ganger den estimerte feilen, og forkast alle RD-kurvene som er for støyende til å modelleres nøyaktig.
MERK: Støy på Rex kan forplantes fra feilene på og . - Klargjør en inndatafil for tilpasningsskriptet ved hjelp av alle RD-kurver med Rex større enn to ganger den beregnede feilen.
MERK: Detaljert instruksjon om utarbeidelse av inndatafilene er gitt i tilpasningsskriptene. Eksempler på inndatafiler leveres som Tilleggsfiler. Vanligvis måles RD-data ved to forskjellige statiske felt og monteres samtidig. I denne protokollen kreves to forskjellige inndatafiler (Tilleggsfiler). - Tilpass RD-dataene ved hjelp av skriptene i Tilleggsfiler.
MERK: To forskjellige skript er gitt for å utføre en restbasert eller en global passform av HENHOLDSVIS RD-kurvene. Begge skriptene passer til RD-kurvene ved hjelp av en to-site utvekslingsmodell og Carver-Richards-ligningen. Mer detaljerte instruksjoner finnes i monteringsskriptene. Ytterligere programvarepakker som Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) og CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) er tilgjengelige for å utføre datatilpasning ved hjelp av Block-McConnell-ligningene. - Test påliteligheten til de monterte parametrene som estimerer den reduserte χ2 som en funksjon av pb og kex.
MERK: Den reduserte χ2 er angitt i utdatafilen. pb og kex kan begrenses til bestemte verdier ved hjelp av nedre og øvre grenser i monteringsprosedyrene. I våre skript er nedre og øvre grenser for henholdsvis pb lb(2) og ub(2). Nedre og øvre grense for kex er henholdsvis lb(3) og ub(3). - Beregn feilen på de monterte parametrene. Dette kan gjøres ved å sette verdien av MC_fac i skriptet til 1 og gjenta tilpasningen flere ganger (vanligvis >20 repetisjoner). Feilen på hver parameter estimeres som standardavviket for fordelingen.
MERK: Hvis du setter MC_fac til 1, genereres et syntetisk datasett der en gaussisk distribuert feil (beregnet basert på eksperimentell feil) legges til de eksperimentelle dataene.
. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er beskrevet her resulterer i oppkjøp av RD-profiler for hver topp i 1H-15N TROSY-spekteret (Figur 3A). Fra de oppkjøpte RD-profilene er det mulig å estimere utvekslingsbidraget til 15N tverrgående avslapning av hver ryggrad midt i gruppen (Figur 3A,3B). Ved å plotte Rex på 3D-strukturen til proteinet som undersøkes, er det mulig å identifisere strukturområdene som gjennomgår konformasjonsutveksling på μs-ms-tidsskalaen (Figur 3C). Modellering av RD-kurvene ved hjelp av Carver-Richards-ligningen returnerer termodynamiske og kinetiske parametere på utvekslingsprosessen, for eksempel fraksjonspopulasjonene til statene i likevekt og valutakursen blant disse statene (Figur 1, Figur 3D). Temperaturavhengigheten til disse termodynamiske og kinetiske parametrene (oppnådd ved å anskaffe RD-eksperimenter ved flere eksperimentelle temperaturer) kan modelleres ved hjelp av henholdsvis van't Hoff- og Eyring-ligningene for å få detaljert informasjon om energiske konformasjonsutvekslingen (figur 3E)9,10.
Figur 1: Oversikt over CPMG RD-eksperimentet. (A) Skjematisk visning av CPMG-blokken som brukes til innsamling av RD-data. Pulsene på 180° vises som svarte rektangler. Operatøren 
indikerer magnetiseringen som kommer inn og ut av CPMG-blokken. CPMG-feltet bestemmes av avstanden mellom etterfølgende refokuserende pulser (2τ). (B) I en to-punkts måling holdes avslapningsforsinkelsen (der CPMG-blokken påføres) konstant og CPMG-feltet varieres ved å variere verdiene til n (antall ganger CPMG-blokken påføres i avslapningsforsinkelsesperioden) og τ. (C) Skjematisk representasjon av en to-steds likevekt mellom samsvar A og B. Valutakurskonstanten (keks)er summen av henholdsvis termin- og reverseringskurskonstantene kab og kba). pa og pb (= 1 - pa) er fraksjonspopulasjonene til henholdsvis art A og B. Δωab er den kjemiske skiftforskjellen mellom konformasjoner A og B. (D) Simulerte RD-kurver for utvekslingsprosesser som er i området tilgjengelig for CPMG (øverst til venstre), for raskt til å bli oppdaget av CPMG (øverst til høyre), for treg til å bli oppdaget av CPMG (nederst til høyre), og med en Δωab for liten til å bli oppdaget av CPMG (nederst til venstre). pb-verdien ble satt til 3 %. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hovedrørledning for anskaffelse og analyse av RD-data. Skjematisk representasjon av arbeidsflyten som er beskrevet i gjeldende protokoll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: μs-ms dynamikk av EIC ved CPMG RD eksperimenter. (A) Eksempel 15N RD profiler målt ved 40 °C og 800 MHz for EIC ved hjelp av protokollen som er beskrevet her. Estimeringen av Rex vises i rødt. (B) Rex-verdier plottes i forhold til restindeksen og (C) på enzymets røntgenstruktur for å identifisere rester som gjennomgår konformasjonsutveksling. (D) NMR-signaler med Rex større enn feilen er modellert (ved hjelp av skriptet som leveres i Tilleggsfiler) for å oppnå kinetikk (kab og kba) og termodynamikk (pb) av likevekten. (E) Innsamling av RD-data ved flere temperaturer returnerer informasjon om energiske endringer i samsvar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver protokollen implementert i laboratoriet for innsamling og analyse av 15N RD-data om proteiner. Spesielt dekkes de avgjørende trinnene for utarbeidelse av NMR-prøven, måling av NMR-dataene og analyse av RD-profilene. Nedenfor diskuteres noen viktige aspekter ved anskaffelse og analyse av RD-eksperimenter. For en mer detaljert beskrivelse av eksperimentet og dataanalysen anbefales imidlertid nøye studier av den opprinnelige litteraturen sterkt3,8,11,15,16.
Når du forbereder NMR-prøven, er det ekstremt viktig å vurdere at tilstedeværelsen av en mindre (<1% befolket) tilstand i bytte med de store, NMR-synlige artene på μs-ms-tidsskalaen vil generere påvisbare RD-profiler1. Derfor anbefales det å bruke en svært renset proteinbestand (>90% ren) for å unngå tilstedeværelse av forurensninger som kan danne forbigående komplekser med systemet under undersøkelse. I tillegg, hvis du undersøker konformasjonsdynamikk i protein-ligandkomplekser, er det viktig å bruke mettende konsentrasjoner av ligand for å unngå tilstedeværelsen av falske RD-profiler som stammer fra kinetikken til ligandbinding.
Når du arbeider med høymolekylære systemer (>20 kDa), er det også tilrådelig (men ikke nødvendig) å bruke perdeutererte proteinprøver og TROSY-pulssekvensen presentert med den nåværende protokollen for å redusere den tverrgående avslapningshastigheten og maksimere avslapningsperioden (d30 i pulsprogrammet vårt). Faktisk, som den laveste oppnåelige νcpmg. = 4/d30, ved hjelp av en lang avslapningsperiode tillater oppkjøp av R2-data ved liten νcpmg, hvor utvekslingsbidraget til R2 er på sitt maksimale. I denne forbindelse er det også viktig å nevne at en pulssekvens som ligner den som følger med den nåværende protokollen, er til stede i spektrometerets standard pulssekvensportefølje (filnavn: trhncorexf3gp). Hovedforskjellen mellom de to filene er at standardsekvensen er basert på et TROSY-HNCO-eksperiment, mens eksperimentet vårt er basert på et TROSY-HSQC-eksperiment og ikke krever 13C-merking av prøven.
Et annet problem å vurdere nøye er oppkjøpstemperaturen. Siden RD-dataene vanligvis måles på flere statiske felt, er det faktisk avgjørende at anskaffelsestemperaturen er konsistent blant alle spektrometre som brukes. Derfor anbefales det på det sterkeste å kontrollere temperaturkalibreringen før du setter opp eksperimentet.
For det som angår analysen av RD-kurvene, er det viktig å understreke at prosedyrene og tilpasningsskriptene som presenteres her, benytter seg av Carver-Richards-ligningene. Selv om dette er den vanligste prosedyren som brukes i litteraturen for kvantitativ modellering av RD-dataene, inneholder Carver Richards-ligningene en rekke tilnærminger og er begrenset til to-site exchange case17. Hvis et bestemt datasett krever de strengere Bloch-McConnell-matrisene for datamodellering, bør tilpasningsprosedyren endres tilsvarende18,19,20. I protokollen ovenfor er det listet opp noen fritt tilgjengelige programvarepakker som utfører datamodellering ved hjelp av Bloch-McConnell-teorien.
Til slutt bør det bemerkes at selv om manuskriptet vårt utelukkende fokuserer på anvendelsen av 15N RD-data for undersøkelse av proteinkonformasjonsdynamikk, ble flere andre eksperimenter beskrevet i litteraturen for å måle RD-kurver på forskjellige kjerner og andre biologiske og ikke-biologiske molekylære systemer18,19,21,22,23. Spesielt bruk av forskjellige kjerner er ekstremt viktig, da det tillater en tettere prøvetaking av proteinstrukturen og gir informasjon om sidekjededynamikk som i stor grad ignoreres av det 15N-baserte eksperimentet som presenteres i denne protokollen5,21,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har lest og godkjent manuskriptet. Vi erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra NIGMS R35GM133488 og fra Roy J. Carver Charitable Trust til V.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | Acquisition Software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
