Aquí, se proporciona una descripción detallada del protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de perfiles de dispersión de relajación de 15N por solución de espectroscopia de RMN.
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Artículo de método
15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms
En este artículo
Resumen
Resumen
La dinámica conformacional de proteínas juega un papel fundamental en la regulación de la catálisis enzimática, la unión de ligandos, el alosterismo y la señalización, que son procesos biológicos importantes. Comprender cómo el equilibrio entre la estructura y la dinámica gobierna la función biológica es una nueva frontera en la biología estructural moderna y ha encendido varios desarrollos técnicos y metodológicos. Entre estos, los métodos de RMN de la solución de dispersión de relajación de CPMG proporcionan información única de resolución atómica sobre la estructura, cinética y termodinámica de los equilibrios conformacionales de proteínas que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms. Aquí, el estudio presenta protocolos detallados para la adquisición y el análisis de un experimento de dispersión de relajación de 15N. Como ejemplo, se muestra la tubería para el análisis de la dinámica μs-ms en el dominio C-terminal de la enzima I.
Introducción
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) experimentos de dispersión de relajación (RD) se utilizan sobre una base de rutina para caracterizar los equilibrios conformacionales que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms por solución espectroscopia de RMN1,2,3,4,5. En comparación con otros métodos para la investigación de la dinámica conformacional, las técnicas de CPMG son relativamente fáciles de implementar en los espectrómetros de RMN modernos, no requieren pasos especializa....
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Protocolo
1. Preparación de la muestra de RMN
- Expresar y purificar una muestra de 2H,15N-labled de la proteína de interés.
NOTA: Mientras que una muestra de proteína 15con etiqueta N se puede utilizar para la adquisición del experimento CPMG RD, la perdeuteración (cuando sea posible) aumenta dramáticamente la calidad de los datos obtenidos. Los protocolos para la producción de proteínas perdeuteradas están disponibles en la literatura13. - Intercambio del almacenador intermediario la muestra purificada de la proteína en un almacenador intermediario desgastado del RMN.
- Transfiera la muestra d....
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Resultados
El protocolo aquí descrito da como resultado la adquisición de perfiles de DR para cada pico en elespectro TROSY de 1H-15N (Figura 3A). A partir de los perfiles de DR adquiridos, es posible estimar la contribución de intercambio a la relajación transversal de 15N de cada grupo amida de la columna vertebral (Figura 3A,3B). Trazando el Rex sobre la estructura 3D de la proteína bajo investigación, es posi.......
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Discusión
Este manuscrito describe el protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de 15N RD de datos sobre proteínas. En particular, se cubren los pasos cruciales para la preparación de la muestra de RMN, la medición de los datos de RMN y el análisis de los perfiles de DR. A continuación se discuten algunos aspectos importantes con respecto a la adquisición y el análisis de experimentos de RD. Sin embargo, para una descripción más profunda del experimento y el análisis de los datos, se recomi.......
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Divulgaciones
Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito. Declaramos que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de NIGMS R35GM133488 y del Roy J. Carver Charitable Trust a V.V.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Criosonda | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D Criosonda | Mejorar la sensibilidad |
| Óxido de deuterio Sigma | Aldrich | 756822-1 | >99.8% puro, utilizado en la preparación de muestras de RMN y cultivos deuterados |
| Centrífuga manual | United Scientific supply | CENTFG1 | Se utiliza para eliminar cualquier burbuja de aire o líquido residual atascado en las paredes del tubo de RMN. |
| espectrómetro de RMN de alto campo | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | Adquisición de los datos de RMN |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Modelado de los datos de | |
| Pipeta de pasteur de RMN | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pipeta de vidrio Pyrex para transferir muestras líquidas en tubo de RMN |
| Tubo de RMN | Willmad Precision | 535-PP-7 | Tubo de vidrio cilíndrico de pared delgada de 5 mm y 7 '' |
| NMRPipe | Instituto de Biociencias y Biotecnología investiga | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | procesamiento de datos de RMN |
| SPARKY | Universidad de California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Análisis de los datos de RMN |
| Tospin 3.2 (o posterior) | Bruker | Software de | adquisición de https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html |
Referencias
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11)....
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Reimpresiones y permisos
