Summary

न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोस्कोपी लिपिड झिल्ली गतिशीलता और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए एक अद्वितीय जांच के रूप में

Published: May 27, 2021
doi:

Summary

यह पेपर लिपिड झिल्ली के न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई) अध्ययनों में नमूना तैयारी, डेटा में कमी और डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। लिपिड के विवेकपूर्ण ड्यूटेरियम लेबलिंग मेसोस्कोपिक लंबाई और समय तराजू पर विभिन्न झिल्ली गतिशीलता तक पहुंच को सक्षम बनाता है, जिस पर महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं होती हैं।

Abstract

लिपिड बिलेयर कोशिका झिल्ली का मुख्य मैट्रिक्स बनाते हैं और अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के बीच पोषक तत्वों के आदान-प्रदान, प्रोटीन-झिल्ली बातचीत और वायरल नवोदित के लिए प्राथमिक मंच हैं। कुशल जैविक गतिविधि के लिए, कोशिका झिल्ली को कोशिका की अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त कठोर होना चाहिए और इसके डिब्बों को अभी तक पर्याप्त तरल पदार्थ होना चाहिए ताकि झिल्ली घटकों, जैसे प्रोटीन और कार्यात्मक डोमेन को फैलाना और बातचीत करने की अनुमति दी जा सके। लोचदार और द्रव झिल्ली गुणों का यह नाजुक संतुलन, और जैविक कार्य पर उनके प्रभाव, मेसोस्कोपिक लंबाई और प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं के समय तराजू पर सामूहिक झिल्ली गतिशीलता की बेहतर समझ की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, झिल्ली विरूपण और प्रोटीन बाध्यकारी घटनाएं। इस गतिशील रेंज की प्रभावी जांच करने वाली तकनीकों में न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई) स्पेक्ट्रोस्कोपी है। ड्यूटेरियम लेबलिंग के साथ संयुक्त, एनएसई का उपयोग सीधे झुकने और मोटाई में उतार-चढ़ाव के साथ-साथ चुनिंदा झिल्ली सुविधाओं की मेसोस्कोपिक गतिशीलता तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है। यह पत्र एनएसई तकनीक का संक्षिप्त विवरण प्रदान करता है और डेटा संग्रह और कमी के निर्देशों के साथ-साथ नमूना तैयारी और ड्यूटेरेशन योजनाओं के विवरण सहित लिपोसोमल झिल्ली पर एनएसई प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है। कागज में प्रमुख झिल्ली मापदंडों को निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा विश्लेषण विधियों का भी परिचय दिया गया है, जैसे कि झुकने वाली कठोरता मोडुलस, क्षेत्र संपीड़न मोडुलस, और इन-प्लेन चिपचिपाहट। एनएसई अध्ययनों के जैविक महत्व को समझाने के लिए, एनएसई द्वारा जांच की गई झिल्ली घटनाओं के चुनिंदा उदाहरणों पर चर्चा की जाती है, अर्थात् झिल्ली झुकने वाली कठोरता पर एडिटिव्स का प्रभाव, झिल्ली के उतार-चढ़ाव पर डोमेन गठन का प्रभाव, और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन के गतिशील हस्ताक्षर।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में कोशिका झिल्ली और उनके कार्य की समझ उल्लेखनीय रूप से विकसित हुई है। कोशिका झिल्ली के पूर्व दृष्टिकोण को निष्क्रिय लिपिड बिलायर के रूप में जो कोशिका सीमाओं और घर की झिल्ली प्रोटीन को परिभाषित करताहै, धीरे-धीरे एक गतिशील मॉडल में बदल गया है जिसमें लिपिड बिलायर सेलुलर सिग्नलिंग, आणविक विनिमय और प्रोटीन फ़ंक्शन सहित महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कुछ2,3,4,5, 6नाम के लिए। यह बोध है कि कोशिका झिल्ली अत्यधिक गतिशील हैं, लगातार रिमॉडलिंग और आणविक पुनर्वितरण के दौर सेगुजर रहे हैं, झिल्ली7,8,9की संतुलन संरचनाओं से परे वैज्ञानिक अन्वेषणों का आग्रह किया है । तदनुसार, जैविक और बायोइंपरेड लिपिड झिल्ली में विभिन्न गतिशील मोड का अध्ययन करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। आज तक, इनमें से अधिकांश अध्ययनों ने मुख्य रूप से डिफ्यूरिव आणविक गति10, 11,12,13और स्थूल आकार के उतार-चढ़ाव14,15,16पर ध्यान केंद्रित किया है, जिससे मध्यवर्ती झिल्ली गतिशीलता को समझने में एक महत्वपूर्ण अंतर है, यानी लिपिड विधानसभाओं के सामूहिक उतार-चढ़ाव जिनमें लिपिड अणुओं के कुछ 10-100 शामिल हैं । ये गतिशीलता कुछ दसियों से कुछ 100 Å के लंबाई तराजू पर होती है और उप-एनएस के समय के तराजू से कुछ सौ एनएस (चित्रा 1देखें), जिसे यहां मेसोस्कोपिक तराजू के रूप में संदर्भित किया जाता है। वास्तव में इन पैमानों पर ही प्रमुख जैविक गतिविधि झिल्ली स्तर17पर होती है . इसमें वायरल नवोदित18, चैनल गेटिंग19और झिल्ली-प्रोटीन इंटरैक्शन20शामिल हैं । यहां यह बताना भी महत्वपूर्ण है कि झिल्ली प्रोटीन21, 22 के ऊर्जा परिदृश्य से पता चलता है कि प्रोटीन में अनुरूप परिवर्तन -उनकी नियामक भूमिका के लिए आवश्यक एनएस समय तराजू पर होता है सामूहिक झिल्ली उतार-चढ़ाव के23, आगे कोशिका झिल्ली के जैविक कार्य में मेसोस्कोपिक गतिशीलता के महत्व पर जोर देते हैं और उनके बायोइंस्पाइरेड एनालॉग20। यह पेपर लिपिड झिल्ली में दो प्राथमिक मेसोस्कोपिक गतिशील मोड पर केंद्रित है, अर्थात्, उतार-चढ़ाव और मोटाई में उतार-चढ़ाव को झुकाना।

इन उतार-चढ़ाव मोड की सीधे जांच करने में मुख्य चुनौती मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करके उनके स्थानिक और लौकिक तराजू तक पहुंचने में कठिनाई है। दूसरी चुनौती यह है कि प्रत्यक्ष संपर्क तकनीक16को मापने के लिए किए गए उतार – चढ़ाव को प्रभावित कर सकती है . यह जैविक झिल्ली24, 25की रचनात्मक और संरचनात्मक जटिलता से और अधिक बढ़ा है, जिसके परिणामस्वरूप लिपिड डोमेनगठन 26, 27, 28,29, 30और झिल्ली विषमता31,32,33 विभिन्न झिल्ली सुविधाओं की गतिशीलता को समझने के लिए चयनात्मक जांच की मांग शामिल है। सौभाग्य से, इन चुनौतियों को गैर-इनवेसिव न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों के साथ दूर किया जा सकता है, जैसे न्यूट्रॉन स्पिन इको (एनएसई), जो स्वाभाविक रूप से आवश्यक लंबाई और समय तराजू तक पहुंचते हैं, और अपने भौतिक रसायन वातावरण34को बदले बिना चयनात्मक झिल्ली सुविधाओं के अध्ययन को सक्षम करते हैं। दरअसल, पिछले कुछ वर्षों में एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी सामूहिक झिल्ली गतिशीलता35की एक अनूठी और शक्तिशाली जांच के रूप में विकसित हुई है। लिपिड झिल्ली पर एनएसई अध्ययनों के परिणामों ने यांत्रिक36,37 और चिपचिपा38,लिपिड झिल्ली के39 गुणों में नई अंतर्दृष्टि उत्पन्न की है और जैविक कार्य40,41में अपनी संभावित भूमिका पर नई रोशनी दी है ।

एनएसई स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक एक इंटरफेरोमेट्रिक इंस्ट्रूमेंट डिजाइन पर आधारित है, जो पहले मेज़ी42द्वारा प्रस्तावित है, जो न्यूट्रॉन स्पिन के प्रीसेसियन को नियंत्रित करने के लिए स्पिन-फ्लिपर्स और चुंबकीय कुंडल की एक श्रृंखला का उपयोग करके उपकरण को पार करता है। डिजाइन नमूना स्थिति(चित्रा 1A)के संबंध में चुंबकीय क्षेत्र तत्वों के चुंबकीय मिररिंग पर टिकी हुई है। इसका मतलब यह है कि न्यूट्रॉन और नमूने के बीच ऊर्जा विनिमय के अभाव में, न्यूट्रॉन उपकरण के पहले और दूसरे छमाही में विपरीत दिशाओं में स्पिन प्रीसेशन की एक ही संख्या करता है (दो precession कुंडल के बीच π-फ्लिपर पर ध्यान दें)। नतीजतन, न्यूट्रॉन की अंतिम स्पिन स्थिति प्रारंभिक स्थिति के सापेक्ष अपरिवर्तित बनी हुई है – स्पिन-इको के रूप में संदर्भित एक घटना (चित्रा 1 एमें पारदर्शी न्यूट्रॉन देखें)। हालांकि, जब न्यूट्रॉन ऊर्जावान रूप से नमूने के साथ बातचीत करता है, तो ऊर्जा विनिमय उपकरण की दूसरी छमाही में स्पिन प्रीसेशंस की संख्या को संशोधित करता है, जिससे एक अलग अंतिम स्पिन राज्य होता है (चित्रा 1 एदेखें)। यह प्रयोगात्मक रूप से ध्रुवीकरण में नुकसान के रूप में पाया जाता है, जैसा कि बाद में इस पेपर में दिखाया जाएगा । एनएसई तकनीक के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठक को समर्पित तकनीकी पत्र42, 43,44, 45के लिए संदर्भित कियाजाताहै।

यहां, एनएसई के साथ सुलभ लंबाई और समय तराजू का मोटा अनुमान प्रदान करने के लिए एक सरलीकृत विवरण प्रस्तुत किया जाता है। लंबाई तराजू प्राप्त तरंग क्षेत्रों की सीमा से निर्धारित होते हैं, क्यू = 4 पाप θ/λ,जहां 2θ बिखरने का कोण है और λ न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य है। कोई भी देख सकता है कि क्यू तरंगदैर्ध्य सीमा और स्पेक्ट्रोमीटर की दूसरी भुजा के रोटेशन की सीमा (चित्रा 1Aदेखें) द्वारा निर्धारित किया गया है। एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर पर एक विशिष्ट क्यू-रेंज~ 0.02-2 Å-146,47है,और हाल ही में उन्नयन48,49केसाथ 0.01-4Å-1 तक, ~ 1-600 Å के स्थानिक तराजू के अनुरूप है। दूसरी ओर, सुलभ समय पैमाने की गणना चुंबकीय पूर्वाज कुंडल कुंडल के भीतर न्यूट्रॉन द्वारा अधिग्रहीत कुल प्रीसेशन कोण (या चरण) से की जाती है, औरयह 50पाया जाता है: Equation 12 । इस अभिव्यक्ति में, टी फोरियर समय के रूप में परिभाषित किया गया Equation 13 है, जहां Equation 50 न्यूट्रॉन जायरोमैग्नेटिक अनुपात Equation 51 है, कुंडली की लंबाई है, और Equation 52 कुंडली के चुंबकीय क्षेत्र की ताकत है। यह इंगित करने लायक है कि फोरियर समय एक मात्रा है जो उपकरण ज्यामिति, चुंबकीय क्षेत्र की ताकत और न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य पर सख्ती से निर्भर है। उदाहरण के लिए, तरंगदैर्ध्य के न्यूट्रॉन का उपयोग करना Equation 70 = 8 Å और साधन सेटिंग्स Equation 51   = 1.2 मीटर और Equation 52 = 0.4 टी, फोरियर समय की गणना टी ~ 50 एनएस होने के लिए की जाती है। प्रायोगिक रूप से, फोरियर समय को प्रेग्नेंसी कॉइल (यानी चुंबकीय क्षेत्र की ताकत) में वर्तमान को बदलकर या विभिन्न न्यूट्रॉन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके ट्यून किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ~ 1 पीएस से 100 एनएस के विशिष्ट एनएसई समय तराजू होते हैं। हालांकि, एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर में हाल के उन्नयन ने लंबे समय तक फोरियर समय तक पहुंच को सक्षम किया है, हेंज मायर-लीबंटिट्ज ज़ेंड्रम51 और एसएनएस-एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर पर जे-एनएसई-फीनिक्स स्पेक्ट्रोमीटर पर ~ 400 एनएस तक, ओक रिज नेशनल लैब 48 में, और इंस्टिट्यूट लॉ-लैंगविन (ILL)49में IN15 एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर में ~1,000 एनएसतक। 

झिल्ली की गतिशीलता की लंबाई और समय पैमाने तक सीधी पहुंच के अलावा, एनएसई में न्यूट्रॉन आइसोटोप संवेदनशीलता52की अंतर्निहित क्षमताएं हैं। विशेष रूप से, हाइड्रोजन के आइसोटोप के साथ अलग-अलग बातचीत करने के लिए न्यूट्रॉन की क्षमता, जैविक प्रणालियों में सबसे प्रचुर तत्व, एक अलग न्यूट्रॉन बिखरने वाली लंबाई घनत्व,34 या एनएसएलडी (अपवर्तन50के ऑप्टिकल इंडेक्स के बराबर) में परिणाम देता है, जब प्रोटियम को ड्यूटेरियम द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। यह एक दृष्टिकोण को विपरीत भिन्नता के रूप में जाना जाता है, जिसका उपयोग आमतौर पर विशिष्ट झिल्ली सुविधाओं को उजागर करने या दूसरों को छुपाने के लिए किया जाता है उत्तरार्द्ध परिदृश्य को विपरीत मिलान के रूप में संदर्भित किया जाता है। इसके विपरीत भिन्नता/मिलान का एक लगातार आवेदन पानी का प्रतिस्थापन है (NSLD =-0.56 ×10-6 Å-2)भारी पानी या डी2ओ (NSLD = 6. 4 × 10-6 Å-2)प्रोटेटेड लिपिड झिल्ली (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2)से न्यूट्रॉन सिग्नल बढ़ाना। झिल्ली संरचना के अध्ययन में यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रभावी है क्योंकि झिल्ली के हेडग्रुप क्षेत्र में डी2ओ का प्रवेश झिल्ली की मोटाई (चित्रा 2 ए, बाएंपैनल देखें) और विभिन्न लिपिड उपसमूहों के स्थान के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है जब अधिक परिष्कृत मॉडल लागू किए जाते हैं53,54। यह पेपर बायोमिमेटिक झिल्ली और चुनिंदा झिल्ली सुविधाओं में सामूहिक गतिशीलता के अध्ययन के लिए विपरीत भिन्नता के उपयोग पर कुछ उदाहरणों पर प्रकाश डालता है।

यहां, एनएसई की गतिशील और कार्यात्मक झिल्ली गुणों में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करने में एनएसई की प्रभावशीलता को लिपोसोमल निलंबन के रूप में मुक्त-खड़े झिल्ली में मेसोस्केल गतिशीलता पर जोर देने के साथ मॉडल और जैविक रूप से प्रासंगिक लिपिड झिल्ली प्रणालियों पर एनएसई अध्ययनों के ठोस उदाहरणों के माध्यम से सचित्र है। इन-प्लेन झिल्ली गतिशीलता के एनएसई मापों के लिए, पाठक को चराई-घटना न्यूट्रॉन स्पिन-इको स्पेक्ट्रोस्कोपी (जीन्स)55, 56 और गठबंधन मल्टीलैमलर झिल्ली के अन्य अध्ययनों पर समर्पित प्रकाशनों के लिए संदर्भित किया जाता है57,58,59,60।

सादगी के लिए, यह पेपर झिल्ली के तीन अलग-अलग योजनाओं पर प्रकाश डालता है, जो अच्छी तरह से अध्ययन किए गए डोमेन-फॉर्मिंग पर सचित्र है, या चरण अलग, लिपिड बाइलेयर सिस्टम 1,2-डाइमारिस्टोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीएमपीसी) और 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोचोलिन (डीएसपीसी) मिश्रण61,62। दो लिपिड उनके हाइड्रोकार्बन चेन लंबाई में एक बेमेल की विशेषता है (14 कार्बन/डीएमपीसी बनाम 18 कार्बन/डीएसपीसी में पूंछ) और उनके जेल-द्रव संक्रमण तापमान (टीएम, डीएमपीसी = 23 डिग्री सेल्सियस बनाम टीएम, DSPC = ५५ डिग्री सेल्सियस) । इसके परिणामस्वरूप डीएमपीसी में पार्श्व चरण-पृथक्करण: मिश्रण के ऊपरी और निचले संक्रमण तापमान के बीच तापमान पर डीएसपीसी झिल्ली63। यहां विचार की गई ड्यूटेरेशन योजनाओं को लिपोसोमल झिल्ली पर एनएसई मापों में सुलभ विभिन्न गतिशील मोड प्रदर्शित करने के लिए चुना जाता है, अर्थात्, मोड़ उतार-चढ़ाव, मोटाई में उतार-चढ़ाव, और पार्श्व डोमेन के चयनात्मक झुकने/मोटाई में उतार-चढ़ाव । सभी लिपिड रचनाओं डीएमपीसी के लिए सूचित कर रहे हैं: डीएसपीसी bilayers 70:30 के एक तिल अंश पर तैयार, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटेटेड और DMPC और DSPC के छिद्रित वेरिएंट का उपयोग कर । सभी नमूना तैयारी कदम लिपोसोमल निलंबन के 4 एमएल पर आधारित हैं, डी2ओ में, 50 मिलीग्राम/एमएल की लिपिड एकाग्रता के साथ, एममुन्ना = 200 मिलीग्राम प्रति नमूना के कुल लिपिड द्रव्यमान के लिए।

Protocol

1. प्रयोग के लिए ड्यूटेरेशन योजना आवश्यक उतार-चढ़ाव मापन को झुकाने के लिए, डी2ओ (डी 99.9%) या डी 2 ओ-बफर (जैसे, एच2ओ के बजाय डी2ओ के साथ तैयार फॉस्फेट बफर) में पूरीतरहसे प्रोटेटेड लिपोसोम बनाए?…

Representative Results

एनएसई अध्ययन झुकने वाले उतार-चढ़ाव तक पहुंचने के लिए आम तौर पर ~ (0.04 – 0.2) Å-1 की क्यू-रेंजपर किया जाता है। यह क्यू-रेंज झिल्ली की मोटाई और लिपोसोमल त्रिज्या के बीच मध्यवर्ती लंबाई तराजू से मेल खाती है, जहा?…

Discussion

एनएसई विभिन्न परिस्थितियों में लिपिड झिल्ली की मेसोस्कोपिक गतिशीलता को मापने में एक शक्तिशाली और अनूठी तकनीक है। एनएसई का प्रभावी उपयोग नमूना गुणवत्ता, न्यूट्रॉन कंट्रास्ट और सुलभ गतिशीलता की सीमा…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

आर अशकर धन्यवाद एम नागाओ, एल-आर कई उपयोगी चर्चाओं के लिए स्टिंगसियू, और पी. जोल्नियरज़ुक और उनके संबंधित बीमलाइंस पर एनएसई प्रयोगों के साथ उनकी लगातार सहायता के लिए। लेखक NIST और ORNL में न्यूट्रॉन स्पिन इको स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग को स्वीकार करते हैं । NIST में एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर उच्च संकल्प न्यूट्रॉन बिखरने, राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान और समझौते के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के बीच एक साझेदारी के लिए केंद्र द्वारा समर्थित है । डीएमआर-1508249। ओआरएनएल के स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत पर एनएसई स्पेक्ट्रोमीटर को वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधाएं प्रभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान कार्यालय, अमेरिकी ऊर्जा विभाग द्वारा समर्थित किया जाता है । ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला यूटी द्वारा प्रबंधित किया जाता है-Batelle, अमेरिका डो अनुबंध नहीं के तहत LLC । DE-AC05-00OR22725।

Materials

Chloroform (biotech grade) Sigma Aldrich 496189 Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath Julabo SE-12 Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide Cambridge Isotopes Laboratories DLM-4 Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance Mettler Toledo MS105 Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade) Sigma Aldrich E7023 200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets VWR 36360-536 Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials Thermo Scientific B7990-1 Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer Fisher Scientific IU2886D Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated) Avanti Polar Lipids varies by lipid Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier Millipore Sigma ZRQSVP3US Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set Avanti Polar Lipids 610020 Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings Grainger 2YDA1 and 2YDA7 Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump SyringePump.com New Era-1000 Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath Fisher Scientific CPX2800 Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven Thermo Scientific 3608 0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-414 Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

References

  1. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
  2. Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 107-130 (2007).
  3. Lundbæk, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. Journal of The Royal Society Interface. 7 (44), 373-395 (2010).
  4. Bradley, R. P., Radhakrishnan, R. Curvature-undulation coupling as a basis for curvature sensing and generation in bilayer membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 117-124 (2016).
  5. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  6. Jensen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., Mouritsen, O. G. Lipids do influence protein function-the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 205-226 (2004).
  7. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  8. Katchalsky, A., Spangler, R. Dynamics of membrane processes. Quarterly Reviews of Biophysics. 1 (2), 127-175 (1968).
  9. Rheinstädter, M. C. Collective molecular dynamics in proteins and membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), 83-90 (2008).
  10. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1082 (2002).
  11. Hac, A. E., Seeger, H. M., Fidorra, M., Heimburg, T. Diffusion in two-component lipid membranes–a fluorescence correlation spectroscopy and monte carlo simulation study. Biophysical Journal. 88 (1), 317-333 (2005).
  12. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  13. Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring lipid membrane viscosity using rotational and translational probe diffusion. Physical Review Letters. 112 (18), 188101 (2014).
  14. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
  15. Bassereau, P., Sorre, B., Lévy, A. Bending lipid membranes: Experiments after W. Helfrich’s model. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 47-57 (2014).
  16. Monzel, C., Sengupta, K. Measuring shape fluctuations in biological membranes. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (24), 243002 (2016).
  17. Deserno, M. Mesoscopic membrane physics: concepts, simulations, and selected applications. Macromolecular Rapid Communications. 30 (9-10), 752-771 (2009).
  18. Reynwar, B. J., et al. Aggregation and vesiculation of membrane proteins by curvature-mediated interactions. Nature. 447 (7143), 461-464 (2007).
  19. Haswell, E. S., Phillips, R., Rees, D. C. Mechanosensitive channels: what can they do and how do they do it. Structure. 19 (10), 1356-1369 (2011).
  20. Phillips, R., Ursell, T., Wiggins, P., Sens, P. Emerging roles for lipids in shaping membrane-protein function. Nature. 459 (7245), 379-385 (2009).
  21. Dill, K. A., Chan, H. S. From Levinthal to pathways to funnels. Nature Structural Biology. 4 (1), 10-19 (1997).
  22. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  23. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  24. Lyman, E., Hsieh, C. -. L., Eggeling, C. From dynamics to membrane organization: experimental breakthroughs occasion a “modeling manifesto”. Biophysical Journal. 115 (4), 595-604 (2018).
  25. Arriaga, L. R., et al. Dissipative curvature fluctuations in bilayer vesicles: Coexistence of pure-bending and hybrid curvature-compression modes. The European Physical Journal. E, Soft Matter. 31 (1), 105-113 (2010).
  26. Honerkamp-Smith, A. R., Veatch, S. L., Keller, S. L. An introduction to critical points for biophysicists; observations of compositional heterogeneity in lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (1), 53-63 (2009).
  27. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  28. Heberle, F. A., et al. Bilayer thickness mismatch controls domain size in model membranes. Journal of the American Chemical Society. 135 (18), 6853-6859 (2013).
  29. Nickels, J. D., et al. The in vivo structure of biological membranes and evidence for lipid domains. PLOS Biology. 15 (5), 2002214 (2017).
  30. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387 (6633), 569-572 (1997).
  31. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  32. Liu, S. -. L., et al. Orthogonal lipid sensors identify transbilayer asymmetry of plasma membrane cholesterol. Nature Chemical Biology. 13, 268 (2016).
  33. Rothman, J., Lenard, J. Membrane asymmetry. Science. 195 (4280), 743-753 (1977).
  34. Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D. 74 (12), 1129-1168 (2018).
  35. Woodka, A. C., Butler, P. D., Porcar, L., Farago, B., Nagao, M. Lipid bilayers and membrane dynamics: insight into thickness fluctuations. Physical Review Letters. 109 (5), 058102 (2012).
  36. Chakraborty, S., et al. How cholesterol stiffens unsaturated lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (36), 21896-21905 (2020).
  37. Arriaga, L. R., et al. Stiffening effect of cholesterol on disordered lipid phases: a combined neutron spin echo + dynamic light scattering analysis of the bending elasticity of large unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 96 (9), 3629-3637 (2009).
  38. Nagao, M., Kelley, E. G., Ashkar, R., Bradbury, R., Butler, P. D. Probing elastic and viscous properties of phospholipid bilayers using neutron spin echo spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (19), 4679-4684 (2017).
  39. Kelley, E. G., Butler, P. D., Ashkar, R., Bradbury, R., Nagao, M. Scaling relationships for the elastic moduli and viscosity of mixed lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (38), 23365-23373 (2020).
  40. Rickeard, B. W., et al. Transverse lipid organization dictates bending fluctuations in model plasma membranes. Nanoscale. 12 (3), 1438-1447 (2020).
  41. Nickels, J. D., et al. Mechanical properties of nanoscopic lipid domains. Journal of the American Chemical Society. 137 (50), 15772-15780 (2015).
  42. Mezei, F. Neutron spin echo: A new concept in polarized thermal neutron techniques. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 255 (2), 146-160 (1972).
  43. Hayter, J. B., Penfold, J. Neutron spin-echo integral transform spectroscopy. Zeitschrift für Physik B Condensed Matter. 35 (2), 199-205 (1979).
  44. Monkenbusch, M., Richter, D., Imae, T., Kanaya, T., Furusaka, M., Torikai, N. . Neutrons in Soft Matter. , 147-182 (2011).
  45. Pynn, R., Mezei, F., Pappas, C., Gutberlet, T. . Neutron Spin Echo. , 159-177 (2003).
  46. Holderer, O., et al. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 19 (3), 034022 (2008).
  47. Schleger, P., et al. The long-wavelength neutron spin-echo spectrometer IN15 at the Institut Laue-Langevin. Physica B: Condensed Matter. 241-243, 164-165 (1997).
  48. Holderer, O., Zolnierczuk, P., Pasini, S., Stingaciu, L., Monkenbusch, M. A better view through new glasses: Developments at the Jülich neutron spin echo spectrometers. Physica B: Condensed Matter. 562, 9-12 (2019).
  49. Farago, B., et al. The IN15 upgrade. Neutron News. 26 (3), 15-17 (2015).
  50. Ashkar, R. Selective dynamics in polymeric materials: Insights from quasi-elastic neutron scattering spectroscopy. Journal of Applied Physics. 127 (15), 151101 (2020).
  51. Pasini, S., Holderer, O., Kozielewski, T., Richter, D., Phoenix Monkenbusch, M. J-NSE- Phoenix, a neutron spin-echo spectrometer with optimized superconducting precession coils at the MLZ in Garching. Review of Scientific Instruments. 90 (4), 043107 (2019).
  52. Svergun, D. I., Koch, M. H. J., Timmins, P. A., May, R. P. . Small Angle X-Ray and Neutron Scattering from Solutions of Biological Macromolecules. , (2013).
  53. Eicher, B., et al. Joint small-angle X-ray and neutron scattering data analysis of asymmetric lipid vesicles. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 419-429 (2017).
  54. Heberle, F. A., et al. Model-based approaches for the determination of lipid bilayer structure from small-angle neutron and X-ray scattering data. European Biophysics Journal. 41 (10), 875-890 (2012).
  55. Jaksch, S., Koutsioubas, A., Mattauch, S., Holderer, O., Frielinghaus, H. Long-range excitations in phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 225, 104788 (2019).
  56. Jaksch, S., et al. Influence of ibuprofen on phospholipid membranes. Physical Review E. 91 (2), 022716 (2015).
  57. Armstrong, C. L., et al. Effect of cholesterol on the lateral nanoscale dynamics of fluid membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 901-913 (2012).
  58. Rheinstädter, M. C., Häußler, W., Salditt, T. Dispersion relation of lipid membrane shape fluctuations by neutron spin-echo spectrometry. Physical Review Letters. 97 (4), 048103 (2006).
  59. Armstrong, C. L., Häußler, W., Seydel, T., Katsaras, J., Rheinstädter, M. C. Nanosecond lipid dynamics in membranes containing cholesterol. Soft Matter. 10 (15), 2600-2611 (2014).
  60. Nickels, J. D., et al. Lipid rafts: buffers of cell membrane physical properties. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (9), 2050-2056 (2019).
  61. Michonova-Alexova, E. I., Sugár, I. P. Component and state separation in DMPC/DSPC lipid bilayers: a Monte Carlo simulation study. Biophysical Journal. 83 (4), 1820-1833 (2002).
  62. Sugár, I. P., Thompson, T. E., Biltonen, R. L. Monte Carlo simulation of two-component bilayers: DMPC/DSPC mixtures. Biophysical Journal. 76 (4), 2099-2110 (1999).
  63. Mabrey, S., Sturtevant, J. M. Investigation of phase transitions of lipids and lipid mixtures by sensitivity differential scanning calorimetry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 73 (11), 3862-3866 (1976).
  64. . Neutron activation and scattering calculator Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2021)
  65. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  66. Ashkar, R., et al. Tuning membrane thickness fluctuations in model lipid bilayers. Biophysical Journal. 109 (1), 106-112 (2015).
  67. Carrillo, J. -. M. Y., Katsaras, J., Sumpter, B. G., Ashkar, R. A computational approach for modeling neutron scattering data from lipid bilayers. Journal of Chemical Theory and Computation. 13 (2), 916-925 (2017).
  68. Azuah, R. T. DAVE: a comprehensive software suite for the reduction, visualization, and analysis of low energy neutron spectroscopic data. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 114 (6), 341-358 (2009).
  69. Van Hove, L. Correlations in space and time and born approximation scattering in systems of interacting particles. Physical Review. 95 (1), 249-262 (1954).
  70. Zilman, A. G., Granek, R. Undulations and dynamic structure factor of membranes. Physical Review Letters. 77 (23), 4788-4791 (1996).
  71. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. . Collective dynamics in model biological membranes measured by neutron spin echo spectroscopy. , 131-176 (2019).
  72. Zheng, Y., Michihiro, N., Dobrin, P. B. Bending elasticity of saturated and monounsaturated phospholipid membranes studied by the neutron spin echo technique. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (15), 155104 (2009).
  73. Sharma, V. K., Qian, S. Effect of an antimicrobial peptide on lateral segregation of lipids: a structure and dynamics study by neutron scattering. Langmuir. 35 (11), 4152-4160 (2019).
  74. Boggara, M. B., Faraone, A., Krishnamoorti, R. Effect of pH and Ibuprofen on the Phospholipid Bilayer Bending Modulus. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (24), 8061-8066 (2010).
  75. Lee, J. -. H., et al. Thermal fluctuation and elasticity of lipid vesicles interacting with pore-forming peptides. Physical Review Letters. 105 (3), 038101 (2010).
  76. Chakraborty, S., Abbasi, A., Bothun, G. D., Nagao, M., Kitchens, C. L. Phospholipid bilayer softening due to hydrophobic gold nanoparticle inclusions. Langmuir. 34 (44), 13416-13425 (2018).
  77. Hoffmann, I., et al. Softening of phospholipid membranes by the adhesion of silica nanoparticles – as seen by neutron spin-echo (NSE). Nanoscale. 6 (12), 6945-6952 (2014).
  78. Watson, M. C., Brown, F. L. H. Interpreting membrane scattering experiments at the mesoscale: the contribution of dissipation within the bilayer. Biophysical Journal. 98 (6), 9-11 (2010).
  79. Seifert, U., Langer, S. A. Viscous modes of fluid bilayer membranes. Europhysics Letters (EPL). 23 (1), 71-76 (1993).
  80. Bingham, R. J., Smye, S. W., Olmsted, P. D. Dynamics of an asymmetric bilayer lipid membrane in a viscous solvent. EPL (Europhysics Letters). 111 (1), 18004 (2015).
  81. Rawicz, W., Olbrich, K. C., McIntosh, T., Needham, D., Evans, E. Effect of chain length and unsaturation on elasticity of lipid bilayers. Biophysical Journal. 79 (1), 328-339 (2000).
  82. Doktorova, M., LeVine, M. V., Khelashvili, G., Weinstein, H. A new computational method for membrane compressibility: bilayer mechanical thickness revisited. Biophysical Journal. 116 (3), 487-502 (2019).
  83. Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. The Journal of Physical Chemistry. 91 (16), 4219-4228 (1987).
  84. Lesieur, S., Grabielle-Madelmont, C., Paternostre, M. T., Ollivon, M. Size analysis and stability study of lipid vesicles by high-performance gel exclusion chromatography, turbidity, and dynamic light scattering. Analytical Biochemistry. 192 (2), 334-343 (1991).
  85. Heberle, F. A., et al. Direct label-free imaging of nanodomains in biomimetic and biological membranes by cryogenic electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 19943-19952 (2020).
  86. Cornell, C. E., Mileant, A., Thakkar, N., Lee, K. K., Keller, S. L. Direct imaging of liquid domains in membranes by cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 19713-19719 (2020).
  87. Yao, X., Fan, X., Yan, N. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18497-18503 (2020).
  88. Kučerka, N., Nieh, M. -. P., Katsaras, J. Fluid phase lipid areas and bilayer thicknesses of commonly used phosphatidylcholines as a function of temperature. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1808 (11), 2761-2771 (2011).
  89. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Lund, R. Resolving the structural interactions between antimicrobial peptides and lipid membranes using small-angle scattering methods: the case of indolicidin. Soft Matter. 14 (43), 8750-8763 (2018).
  90. Kučerka, N., et al. Lipid bilayer structure determined by the simultaneous analysis of neutron and X-ray scattering data. Biophysical Journal. 95 (5), 2356-2367 (2008).
  91. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Scaling of lipid membrane rigidity with domain area fraction. Soft Matter. 15 (13), 2762-2767 (2019).
  92. Brüning, B. -. A., et al. Bilayer undulation dynamics in unilamellar phospholipid vesicles: Effect of temperature, cholesterol and trehalose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1838 (10), 2412-2419 (2014).
  93. Kučerka, N., et al. Areas of monounsaturated diacylphosphatidylcholines. Biophysical Journal. 97 (7), 1926-1932 (2009).
  94. Sharma, V. K., Mamontov, E., Anunciado, D. B., O’Neill, H., Urban, V. S. Effect of antimicrobial peptide on the dynamics of phosphocholine membrane: role of cholesterol and physical state of bilayer. Soft Matter. 11 (34), 6755-6767 (2015).
  95. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Collective dynamics in lipid membranes containing transmembrane peptides. Soft Matter. , (2021).
  96. Yu, J., et al. Structure and dynamics of lipid membranes interacting with antivirulence end-phosphorylated polyethylene glycol block copolymers. Soft Matter. 16 (4), 983-989 (2020).
  97. Stingaciu, L. -. R., et al. Revealing the dynamics of thylakoid membranes in living cyanobacterial cells. Scientific Reports. 6 (1), 19627 (2016).
  98. Stingaciu, L. -. R., O’Neill, H. M., Liberton, M., Pakrasi, H. B., Urban, V. S. Influence of chemically disrupted photosynthesis on cyanobacterial thylakoid dynamics in synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 9 (1), 5711 (2019).
  99. Miller, I. R. Energetics of fluctuation in lipid bilayer thickness. Biophysical Journal. 45 (3), 643-644 (1984).
  100. Nagao, M. Observation of local thickness fluctuations in surfactant membranes using neutron spin echo. Physical Review E. 80 (3), 031606 (2009).

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Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (171), e62396, doi:10.3791/62396 (2021).

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