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Biology

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

Published: May 27, 2021
doi:
10.3791/62396
, ,
1Department of Physics,Virginia Tech, 2Center for Soft Matter and Biological Physics,Virginia Tech

Summary

本論文では、脂質膜の中性子スピンエコー(NSE)研究におけるサンプル調製、データ削減、データ解析のプロトコルについて述べる。脂質の重水素標識は、重要な生物学的プロセスが起こるメソスコピック長および時間スケール上の異なる膜動力学へのアクセスを可能にする。

Abstract

脂質二重層は細胞膜の主なマトリックスを形成し、栄養素交換、タンパク質膜相互作用、およびウイルスの芽出しのための主要なプラットフォームであり、他の重要な細胞プロセスの中で。効率的な生物学的活性のために、細胞膜は細胞とそのコンパートメントの完全性を維持するのに十分な剛性でありながら、タンパク質および機能ドメインなどの膜成分が拡散し相互作用するのに十分な流体であるべきである。弾性と流体膜の特性の微妙なバランス、および生物学的機能への影響は、膜の変形やタンパク結合イベントなどの主要な生物学的プロセスのメソスコピック長さと時間スケールに対する集合的な膜ダイナミクスのより良い理解を必要とします。このダイナミックレンジを効果的に探査できる技術の中には、中性子スピンエコー(NSE)分光法があります。重水素ラベリングと組み合わせることで、NSEは、曲げや厚さの変動だけでなく、選択された膜の特徴のメソスコピックダイナミクスに直接アクセスするために使用することができます。本論文では、NSE技術の簡単な説明を提供し、サンプル調製および重水素化スキームの詳細を含むリポソーム膜に関するNSE実験を行う手順と、データ収集と削減の手順を概説する。また、曲げ剛性率、面積圧縮率、面内粘度などの主要な膜パラメータを抽出するためのデータ解析方法も紹介しています。NSE研究の生物学的重要性を説明するために、NSEによってプローブされた膜現象の選択例、すなわち、膜曲げ剛性に対する添加剤の影響、膜の変動に及ぼすドメイン形成の影響、および膜-タンパク質相互作用の動的シグネチャについて考察する。

Introduction

細胞膜とその機能の理解は、ここ数十年で著しく進化してきました。細胞境界とハウス膜タンパク質1を定義する受動脂質二重層としての細胞膜の以前の見解は、細胞シグナル伝達、分子交換、およびタンパク質機能を含む重要な生物学的プロセスを調節する上で脂質二重層が重要な役割を果たす動的モデルへと変貌し、2、3、4、5、6と称する。細胞膜は非常に動的であり、常に再形成と分子再分配を受けているという認識は、膜7、8、9の平衡構造を超えた科学的探求を促している。したがって、生物学的およびバイオアインスパイアされた脂質膜の様々な動的モードを研究するために、複数のアプローチが開発されてきました。現在までに、これらの研究の大半は、主に拡散性分子運動10、11、12、13および巨視的形状変動14、15、16に焦点を当て、中間膜ダイナミクス、すなわち脂質分子の数10〜100sからなる脂質集合体の集合的変動を理解する上で大きなギャップを残している。これらのダイナミクスは、数十から数100Åの長さのスケールと数百nsに対する時間スケール(図1を参照)で発生します。これらのスケールでは、主要な生物学的活性が膜レベル17で行われます。これには、ウイルスの出芽18、チャネル・ギャティング19、および膜タンパク質相互作用20が含まれる。また、膜タンパク質21,22のエネルギーランドスケープは、タンパク質の立体構造変化(その調節的役割に必要)が集団膜変動のns時間スケール23で起こることを示し、細胞膜の生物学的機能におけるメソスコピックダイナミクスの重要性をさらに強調することを指摘する。本論文では、脂質膜における2つの主要なメソスコピック動的モード、すなわち曲げ変動と厚さ変動に焦点を当てています。

これらの変動モードを直接探査する際の主な課題は、標準分光法を用いて空間的スケールと時間スケールに同時にアクセスすることの難しさです。もう一つの課題は、直接接触技術が16を測定するために意図されているのと同じ変動に影響を与える可能性があるということです。これは、生物学的膜24,25の組成および構造の複雑さによってさらに悪化し、脂質ドメイン形成26、27、28、29、30および膜非対称性31、32、33を含む非均質な膜特徴を生じ、異なる膜特徴のダイナミクスを理解するための選択的プローブを要求する。幸いなことに、これらの課題は、本質的に必要な長さと時間スケールにアクセスする中性子スピンエコー(NSE)のような非侵襲的な中性子分光法法で克服することができ、さらにそれらの物理化学的環境34を変更することなく、選択的膜特徴の研究を可能にする。実際、ここ数年NSE分光法は、集団膜動態35のユニークで強力なプローブに進化しました。脂質膜に関するNSE研究の結果は、機械的36、37、粘弾性38、脂質膜の39の特性に新たな洞察を生み出し、生物学的機能40,41におけるその潜在的役割に新たな光を当てた。

NSE分光法は、メゼイ42が最初に提案した干渉計器の設計に基づいており、一連のスピンフリッパーと磁気コイルを使用して中性子が機器を横断する中性子スピンの歳差を制御します。この設計は、サンプル位置に対する磁界要素の磁気ミラーリングにかかっています(図1A)。これは、中性子と試料の間のエネルギー交換がない場合、中性子は、装置の最初と後半に反対方向に同じ数のスピン歳差を実行することを意味します(2つの歳差コイル間のπフリッパーに注意してください)。その結果、中性子の最終的なスピン状態は、初期状態に対して変化しないままである-スピンエコーと呼ばれる現象(図1Aの透明中性子を参照)。しかし、中性子がサンプルとエネルギー相互作用すると、エネルギー交換によって装置の後半のスピンの間圧数が変わり、最終的なスピン状態が異なる(図1Aを参照)。これは、この論文の後半で示されるように、偏光の損失として実験的に検出される。NSEテクニックの詳細については、専用の技術論文42、43、44、45を参照してください。

ここでは、NSEでアクセス可能な長さと時間スケールの概算を提供する簡単な説明を提示します。長さスケールは、達成可能な波ベクトル伝達の範囲によって決定され、Q = 4π sinθ/λ、2θは散乱角、λは中性子波長である。Qが分光計の第2アームの波長範囲と回転の程度によって設定されていることがわかります(図1Aを参照)。NSE分光計の典型的なQ-範囲は、〜0.02-2 Å-146、47、および最近のアップグレード48、49で0.01-4 Å-1まで、〜1-600 Åの空間スケールに対応しています。一方、アクセス可能な時間スケールは、磁気陽イオンコイル内で中性子が獲得した総歳差角(または位相)から計算され、50: と見なされます Equation 12 。この式では、tは、 Equation 13 Equation 50 中性子ジャイロ磁性比、 Equation 51 コイル長、および Equation 52 コイルの磁場の強さとして定義されるフーリエ時間です。フーリエ時間は、計測器の形状、磁場強度、中性子波長に厳密に依存する量であることを指摘する価値があります。例えば、波長=8Åの中性子 Equation 70 と Equation 51   =1.2mと Equation 52 =0.4Tの計器設定を使用して、フーリエ時間はt~50nsと計算されます。 実験的には、フーリエ時間は、p景気後退コイルの電流(すなわち、磁場強度)を変化させることによって調整されるか、異なる中性子波長を使用して、〜1 ps〜100nsの典型的なNSE時間スケールをもたらす。しかし、NSE分光計の最近のアップグレードにより、より長いフーリエ時間へのアクセスが可能になりました。 オークリッジ国立研究所48のハインツ・マイヤー・ライプニッツ・ツェントルム51とSNS-NSE分光計のJ-NSE-フェニックス分光計では約~400ns、インスティトゥート・ラウ・ランゲビン(ILL)のIN15 NSE分光計では最大1,000nsまで。 

膜動態の長さと時間スケールへの直接アクセスに加えて、NSEは中性子体同位体感度52の固有の能力を有する。具体的には、生物系において最も豊富な元素である水素同位体と異なった相互作用をする中性子の能力は、プロトニウムが重水素によって置換される場合に、異なる中性子散乱長さ密度、34またはNSLD(屈折の光学インデックスに相当する)をもたらす。これにより、特定の膜の特徴を強調したり、他の特徴を隠すために一般的に使用されるコントラストバリエーションと呼ばれるアプローチが可能になります。コントラスト変動/一致の頻繁な適用は、水の置換です (NSLD = -0.56 × -0.56 × 10-6 Å-2)重水またはD2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2)を使用して、プロチアード脂質膜からの中性子信号を増幅します (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2)。このアプローチは、膜のヘッドグループ領域へのD2Oの浸透が膜の厚さ(図2A、左パネルを参照)および異なる脂質サブグループの位置をより高度なモデルが適用される53,54の正確な決定を可能にするので、膜構造の研究において非常に効果的である。本論文では、バイオミメティック膜の集合的ダイナミクスの研究におけるコントラスト変動の使用と、膜の特徴の選択に関する例をいくつか強調する。

ここでは、動的および機能的膜特性に関する独自の洞察を提供するNSEの有効性を、リポソーム懸濁液の形態で自立膜中質動態に重点を置いたモデルおよび生物学的に関連する脂質膜系に関するNSE研究の具体的な例を通して示されている。面内膜ダイナミクスのNSE測定では、読者は放牧発生率中性子スピンエコー分光法(GINSES)55、56および整列した多層膜スタック57、58、59、60の他の研究に関する専用の出版物と呼ばれる。

簡潔にするために、この論文は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)および1,2-distearoyl-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)混合物の十分に研究されたドメイン形成、または相分離の脂質二重層系に示された3つの異なる膜重膜スキームを強調する。2つの脂質は、炭化水素鎖長(DSPCの18炭素/テールの14炭素/テール)とゲル流体転移温度(Tm、DMPC = 23°C対Tm、DSPC=55°C)の不一致が特徴です。この結果、DMPC:DSPC膜における、混合物63の上下遷移温度間の温度における横相分離が生じる。ここで考慮される重曲スキームは、リポソーム膜のNSE測定でアクセス可能なさまざまな動的モード、すなわち、曲げ変動、厚さ変動、および側面ドメインの選択的曲げ/厚さ変動を実証するために選択されます。DMPC:DSPCバイレイヤーは、DMPCとDSPCの商業的に入手可能なプロティエートおよび透過型の変異体を使用して、70:30のモル画分で調製されたDMPC:DSPC二重層について報告されます。すべてのサンプル調製ステップは、4 mLのリポソーム懸濁液に基づいており、D2Oでは、50mg/mLの脂質濃度を有し、全脂質質量のMtot= 200mgの試料に基づいている。

Protocol

1. 実験に必要な重極化スキーム 曲げゆらゆら測定のために、D2 O(D 99.9%)またはD2O−バッファ(例えば、H2Oの代わりにD2Oで調製されたリン酸塩緩衝液)で完全にプロチオートリポソームを作る。完全にプロピテられたDMPC(C36H72NO8P)およびDSPC(C44H88NO8P)を 133.4 mg?…

Representative Results

ベンド変動にアクセスするNSE研究は、通常、~(0.04 – 0.2)Å-1のQ範囲で行われます。このQ範囲は、膜の厚さとリポソーム半径の中間長さスケールに対応し、曲げダイナミクスが支配的です。拡張されたQ-範囲を超える測定は、リポソーム拡散および膜内動態を含む追加の動的モードへのアクセスを提供することができる。NSEがアクセスする膜動態のクロスオーバーの詳細については、こ?…

Discussion

NSEは、様々な条件下での脂質膜のメソスコピックダイナミクスを測定する上で強力かつユニークな技術です。NSEの有効利用は、サンプルの品質、中性子のコントラスト、および特定のサンプルに対してプローブ可能なアクセス可能なダイナミクスの範囲に依存します。したがって、NSE実験を成功させ、高品質なデータを収集するには、いくつかの重要なステップが必要です。NSE実験中に中性?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.アシュカーはM.ナガオ、L.-Rに感謝します。スティンタシウ、およびP.ゾルニエツクは、多くの有用な議論とそれぞれのビームライン上のNSE実験で頻繁に支援を行う。著者らは、NISTおよびORNLにおける中性子スピンエコー分光計の使用を認めている。NISTのNSE分光計は、国立標準技術研究所と国立科学財団とのパートナーシップである高解像度中性子散乱センターによって支えられている。DMR-1508249.ORNLのスマレーション中性子源のNSE分光計は、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局の科学ユーザー施設部門によって支えられている。オークリッジ国立研究所は、米国DOE契約No.の下でUT-Battelle,LLCによって管理されています。DE-AC05-00OR22725.

Materials

Chloroform (biotech grade) Sigma Aldrich 496189 Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath Julabo SE-12 Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide Cambridge Isotopes Laboratories DLM-4 Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance Mettler Toledo MS105 Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade) Sigma Aldrich E7023 200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets VWR 36360-536 Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials Thermo Scientific B7990-1 Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer Fisher Scientific IU2886D Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated) Avanti Polar Lipids varies by lipid Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier Millipore Sigma ZRQSVP3US Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set Avanti Polar Lipids 610020 Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings Grainger 2YDA1 and 2YDA7 Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump SyringePump.com New Era-1000 Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath Fisher Scientific CPX2800 Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven Thermo Scientific 3608 0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-414 Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples
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Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (171), e62396, doi:10.3791/62396 (2021).
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