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脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/62396
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Physics, Virginia Tech, 2Center for Soft Matter and Biological Physics, Virginia Tech

ERRATUM NOTICE

Summary

本論文では、脂質膜の中性子スピンエコー(NSE)研究におけるサンプル調製、データ削減、データ解析のプロトコルについて述べる。脂質の重水素標識は、重要な生物学的プロセスが起こるメソスコピック長および時間スケール上の異なる膜動力学へのアクセスを可能にする。

Abstract

脂質二重層は細胞膜の主なマトリックスを形成し、栄養素交換、タンパク質膜相互作用、およびウイルスの芽出しのための主要なプラットフォームであり、他の重要な細胞プロセスの中で。効率的な生物学的活性のために、細胞膜は細胞とそのコンパートメントの完全性を維持するのに十分な剛性でありながら、タンパク質および機能ドメインなどの膜成分が拡散し相互作用するのに十分な流体であるべきである。弾性と流体膜の特性の微妙なバランス、および生物学的機能への影響は、膜の変形やタンパク結合イベントなどの主要な生物学的プロセスのメソスコピック長さと時間スケールに対する集合的な膜ダイナミクスのより良い理解を必要とします。このダイナミックレンジを効果的に探査できる技術の中には、中性子スピンエコー(NSE)分光法があります。重水素ラベリングと組み合わせることで、NSEは、曲げや厚さの変動だけでなく、選択された膜の特徴のメソスコピックダイナミクスに直接アクセスするために使用することができます。本論文では、NSE技術の簡単な説明を提供し、サンプル調製および重水素化スキームの詳細を含むリポソーム膜に関するNSE実験を行う手順と、データ収集と削減の手順を概説する。また、曲げ剛性率、面積圧縮率、面内粘度などの主要な膜パラメータを抽出するためのデータ解析方法も紹介しています。NSE研究の生物学的重要性を説明するために、NSEによってプローブされた膜現象の選択例、すなわち、膜曲げ剛性に対する添加剤の影響、膜の変動に及ぼすドメイン形成の影響、および膜-タンパク質相互作用の動的シグネチャについて考察する。

Introduction

細胞膜とその機能の理解は、ここ数十年で著しく進化してきました。細胞境界とハウス膜タンパク質1を定義する受動脂質二重層としての細胞膜の以前の見解は、細胞シグナル伝達、分子交換、およびタンパク質機能を含む重要な生物学的プロセスを調節する上で脂質二重層が重要な役割を果たす動的モデルへと変貌し、2、3、4、5、6と称する。細胞膜は非常に動的であり、常に再形成と分子再分配を受けているという認識は、膜7、8、9の平衡構造を超えた科学的探求を促している。したがって、生物学的およびバイオアインスパイアされた脂質膜の様々な動的モードを研究するために、複数のアプローチが開発されてきました。現在までに、これらの研究の大半は、主に拡散性分子運動10、11、12、13および巨視的形状変動14、15、16に焦点を当て、中間膜ダイナミクス、すなわち脂質分子の数10〜100sからなる脂質集合体の集合的変動を理解する上で大きなギャップを残している。これらのダイナミクスは、数十から数100Åの長さのスケールと数百nsに対する時間スケール(図1を参照)で発生します。これらのスケールでは、主要な生物学的活性が膜レベル17で行われます。これには、ウイルスの出芽18、チャネル・ギャティング19、および膜タンパク質相互作用20が含まれる。また、膜タンパク質21,22のエネルギーランドスケープは、タンパク質の立体構造変化(その調節的役割に必要)が集団膜変動のns時間スケール23で起こることを示し、細胞膜の生物学的機能におけるメソスコピックダイナミクスの重要性をさらに強調することを指摘する。本論文では、脂質膜における2つの主要なメソスコピック動的モード、すなわち曲げ変動と厚さ変動に焦点を当てています。

これらの変動モードを直接探査する際の主な課題は、標準分光法を用いて空間的スケールと時間スケールに同時にアクセスすることの難しさです。もう一つの課題は、直接接触技術が16を測定するために意図されているのと同じ変動に影響を与える可能性があるということです。これは、生物学的膜24,25の組成および構造の複雑さによってさらに悪化し、脂質ドメイン形成26、27、28、29、30および膜非対称性31、32、33を含む非均質な膜特徴を生じ、異なる膜特徴のダイナミクスを理解するための選択的プローブを要求する。幸いなことに、これらの課題は、本質的に必要な長さと時間スケールにアクセスする中性子スピンエコー(NSE)のような非侵襲的な中性子分光法法で克服することができ、さらにそれらの物理化学的環境34を変更することなく、選択的膜特徴の研究を可能にする。実際、ここ数年NSE分光法は、集団膜動態35のユニークで強力なプローブに進化しました。脂質膜に関するNSE研究の結果は、機械的36、37、粘弾性38、脂質膜の39の特性に新たな洞察を生み出し、生物学的機能40,41におけるその潜在的役割に新たな光を当てた。

NSE分光法は、メゼイ42が最初に提案した干渉計器の設計に基づいており、一連のスピンフリッパーと磁気コイルを使用して中性子が機器を横断する中性子スピンの歳差を制御します。この設計は、サンプル位置に対する磁界要素の磁気ミラーリングにかかっています(図1A)。これは、中性子と試料の間のエネルギー交換がない場合、中性子は、装置の最初と後半に反対方向に同じ数のスピン歳差を実行することを意味します(2つの歳差コイル間のπフリッパーに注意してください)。その結果、中性子の最終的なスピン状態は、初期状態に対して変化しないままである-スピンエコーと呼ばれる現象(図1Aの透明中性子を参照)。しかし、中性子がサンプルとエネルギー相互作用すると、エネルギー交換によって装置の後半のスピンの間圧数が変わり、最終的なスピン状態が異なる(図1Aを参照)。これは、この論文の後半で示されるように、偏光の損失として実験的に検出される。NSEテクニックの詳細については、専用の技術論文42、43、44、45を参照してください。

ここでは、NSEでアクセス可能な長さと時間スケールの概算を提供する簡単な説明を提示します。長さスケールは、達成可能な波ベクトル伝達の範囲によって決定され、Q = 4π sinθ/λ、2θは散乱角、λは中性子波長である。Qが分光計の第2アームの波長範囲と回転の程度によって設定されていることがわかります(図1Aを参照)。NSE分光計の典型的なQ-範囲は、〜0.02-2 Å-146、47、および最近のアップグレード48、49で0.01-4 Å-1まで、〜1-600 Åの空間スケールに対応しています。一方、アクセス可能な時間スケールは、磁気陽イオンコイル内で中性子が獲得した総歳差角(または位相)から計算され、50: と見なされます Equation 12 。この式では、tは、 Equation 13 Equation 50 中性子ジャイロ磁性比、 Equation 51 コイル長、および Equation 52 コイルの磁場の強さとして定義されるフーリエ時間です。フーリエ時間は、計測器の形状、磁場強度、中性子波長に厳密に依存する量であることを指摘する価値があります。例えば、波長=8Åの中性子 Equation 70 と Equation 51   =1.2mと Equation 52 =0.4Tの計器設定を使用して、フーリエ時間はt~50nsと計算されます。 実験的には、フーリエ時間は、p景気後退コイルの電流(すなわち、磁場強度)を変化させることによって調整されるか、異なる中性子波長を使用して、〜1 ps〜100nsの典型的なNSE時間スケールをもたらす。しかし、NSE分光計の最近のアップグレードにより、より長いフーリエ時間へのアクセスが可能になりました。 オークリッジ国立研究所48のハインツ・マイヤー・ライプニッツ・ツェントルム51とSNS-NSE分光計のJ-NSE-フェニックス分光計では約~400ns、インスティトゥート・ラウ・ランゲビン(ILL)のIN15 NSE分光計では最大1,000nsまで。 

膜動態の長さと時間スケールへの直接アクセスに加えて、NSEは中性子体同位体感度52の固有の能力を有する。具体的には、生物系において最も豊富な元素である水素同位体と異なった相互作用をする中性子の能力は、プロトニウムが重水素によって置換される場合に、異なる中性子散乱長さ密度、34またはNSLD(屈折の光学インデックスに相当する)をもたらす。これにより、特定の膜の特徴を強調したり、他の特徴を隠すために一般的に使用されるコントラストバリエーションと呼ばれるアプローチが可能になります。コントラスト変動/一致の頻繁な適用は、水の置換です (NSLD = -0.56 × -0.56 × 10-6 Å-2)重水またはD2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2)を使用して、プロチアード脂質膜からの中性子信号を増幅します (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2)。このアプローチは、膜のヘッドグループ領域へのD2Oの浸透が膜の厚さ(図2A、左パネルを参照)および異なる脂質サブグループの位置をより高度なモデルが適用される53,54の正確な決定を可能にするので、膜構造の研究において非常に効果的である。本論文では、バイオミメティック膜の集合的ダイナミクスの研究におけるコントラスト変動の使用と、膜の特徴の選択に関する例をいくつか強調する。

ここでは、動的および機能的膜特性に関する独自の洞察を提供するNSEの有効性を、リポソーム懸濁液の形態で自立膜中質動態に重点を置いたモデルおよび生物学的に関連する脂質膜系に関するNSE研究の具体的な例を通して示されている。面内膜ダイナミクスのNSE測定では、読者は放牧発生率中性子スピンエコー分光法(GINSES)55、56および整列した多層膜スタック57、58、59、60の他の研究に関する専用の出版物と呼ばれる。

簡潔にするために、この論文は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)および1,2-distearoyl-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)混合物の十分に研究されたドメイン形成、または相分離の脂質二重層系に示された3つの異なる膜重膜スキームを強調する。2つの脂質は、炭化水素鎖長(DSPCの18炭素/テールの14炭素/テール)とゲル流体転移温度(Tm、DMPC = 23°C対Tm、DSPC=55°C)の不一致が特徴です。この結果、DMPC:DSPC膜における、混合物63の上下遷移温度間の温度における横相分離が生じる。ここで考慮される重曲スキームは、リポソーム膜のNSE測定でアクセス可能なさまざまな動的モード、すなわち、曲げ変動、厚さ変動、および側面ドメインの選択的曲げ/厚さ変動を実証するために選択されます。DMPC:DSPCバイレイヤーは、DMPCとDSPCの商業的に入手可能なプロティエートおよび透過型の変異体を使用して、70:30のモル画分で調製されたDMPC:DSPC二重層について報告されます。すべてのサンプル調製ステップは、4 mLのリポソーム懸濁液に基づいており、D2Oでは、50mg/mLの脂質濃度を有し、全脂質質量のMtot= 200mgの試料に基づいている。

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Protocol

1. 実験に必要な重極化スキーム

  1. 曲げゆらゆら測定のために、D2 O(D 99.9%)またはD2O−バッファ(例えば、H2Oの代わりにD2Oで調製されたリン酸塩緩衝液)で完全にプロチオートリポソームを作る。完全にプロピテられたDMPC(C36H72NO8P)およびDSPC(C44H88NO8P)を Equation 1 133.4 mgで使用し、 ここで、XDMPCとXDSPCは DMPC と DSPC のモル分率であり、ここではそれぞれ 0.7 と 0.3 に設定され、MwDMPCと MwDSPCはそれぞれ 677.9 g/mol と 790.1 g/mol で与えられるモル重量です。同様に、mDSPC = 66.6 mg.この重水素化スキームは、膜(NSLD~0×10-6 Å-2)と重水素化緩衝液(NSLD~6.4×10-6 Å-2)との散乱コントラストを高め、膜起振から信号を増幅する(図2A左パネル参照)。
  2. 選択された横膜の特徴の曲げダイナミクスを測定するために、 例えば、位相分離DMPC:DSPC膜におけるマトリックスダイナミクスは、プロチッドDMPC(C36H72NO8P)および重水素化、DSPC-d83(C44H5NO 8 PD83、Mw873.7 g/mol)を使用し、m DMPC= 128.8 mgおよびmDSPC-d83mg=71mg= この重み付け方式は望ましくないDSPCリッチドメインからの散乱を最小にし、DMPCリッチマトリックスからの曲げ変動の選択的測定を可能にする(図2B中間を参照)。
    注:特定のコントラストマッチングスキームに必要な最適な脂質重定を見つけるために、NIST中性子研究センター64が開発したものなど、利用可能なウェブベースの散乱長密度(SLD)計算機を利用します。これらのウェブベースのインターフェースは、脂質混合物の様々な程度と脂質のSLDの簡単な計算のためのユーザーフレンドリーなツールが装備されています。
  3. NSEの平均膜厚変動(横コントラストなし)の測定では、構成脂質の尾重化変異体を使用し、 すなわち、DMPC-d54(C36H18NO8PD 54、732.3 g/mol)およびDSPC-d70(C44H18NO8PD70、860.1g/mol)35、38、mDM-d54 = 133.0mgおよびm DSPC-d70mg=この造影スキーム(図2A、右パネル)は、脂質ヘッドグループ(NSLD~4.5×10-6Å-2)から、膜厚の変動の検出を可能にする重水素緩衝液(NSLD~6.6×10-6Å-2)とのコントラストマッチングにより、脂質ヘッドグループからの散乱信号を増幅する。
  4. 選択膜コンパートメントの厚さ変動研究の場合、 例えば、DMPCリッチマトリックスは、突起DMPC脂質を尾重数の類似体、すなわちDMPC-d54と置き換えることによってステップ1.2で説明した同じ戦略を使用し、DSPCリッチドメインが重水素化された緩衝液と対比され、一次散乱信号がテール・デレートされたマトリックスのヘッドグループ領域からである。

2. 押出用脂質懸濁液の調製

  1. サンプルの構成に応じて、サンプル内の各構成の質量を計算します。経験則として、複数の分子成分を含むサンプルの場合、成分の質量はモル分率、Xiによって重み付けされ Equation 2 、Mtotが総質量である場合、ここで200mgに設定されるようなすべての成分にわたって正規化されます。異なる重水素化スキームを持つ DMPC-DSPC 脂質二重層については、上記の例を参照してください。
  2. デジタルセミマイクロバランスを使用して、計算された脂質の質量(タンパク質、ナノ粒子など)を計量し、バイアルまたは丸底フラスコに追加します - バイアルまたはフラスコを事前に計量することを忘れないでください。フード内部で手動で混合して重量を量った部品を溶解するために溶媒の1 mLを加えます。純粋な脂質サンプルの場合は、クロロホルムまたはエタノールを使用してください。追加の非脂質成分(例えば、ナノ粒子)を含むサンプルについては、すべての成分を分散させる共通の溶媒を選択してください。
    1. 少量の脂質量(<10mg)の場合は、ストック溶液を調製し、必要な量を混合物にピペットします。
      注:以下に説明する溶剤乾燥工程を著しく遅くするので、過剰な量の溶剤を追加しないでください。
  3. 脂質溶液を、フードの内側に乾燥させ、不活性ガス(例えば、窒素、アルゴン)をバイアル中で緩やかに流し、バイアルをゆっくりと斜め回転させます。バイアルを傾けた位置に保ち、バイアル壁に乾燥した脂質の薄膜を作り、乾燥さえ可能にします。35°Cの水浴にバイアルを断続的に入れ、蒸発媒介冷却を回避し、溶媒の蒸発を遅くします。
  4. バイアルを約35°Cの真空オーブンに一晩入れ、残留溶媒を完全に除去します。不飽和脂質の場合は、不活性ガスで真空をパージして酸化を最小限に抑えます。
  5. 完全な溶媒除去を確実にするために、脂質乾燥後にバイアルを秤量し、測定量を超える材料量を超える余分な質量がないことを確認します。乾燥後に測定された質量からバイアルの質量を差し引いてこれを行います。余分な質量がある場合は、別の6時間真空下でサンプルを乾燥させます。必要に応じてこのプロセスを繰り返します。
  6. 脂質膜を4 mLのD2OまたはD2O-バッファで水和し、50mg/mLの脂質濃度を得た。DMPC-DSPC混合物のような高い転移温度を有する脂質の場合は、バッファーを転移温度(60°C)以上に加熱し、均一に混合を確保します。
    注: NSE 実験では比較的大きなサンプル量(〜4 mL)が必要なため、必要なバッファーの半分、すなわち 2 mL を使用してサンプルの水分補給を行い、サンプルあたりの押出量を最小限に抑えることを検討してください(セクション3参照)。この場合は、バッファーポスト押出の残りの半分を追加します。押し出しに使用されるシリンジの容量は1 mLに制限されています。したがって、4 mLのバッファで水分補給を行うには、4セットの押し出しが必要になります。
  7. 水和した脂質溶液を、脂質膜が完全に溶解し、バイアルの壁に見えなくなるまで、渦液を混合する。この段階では、水和脂質はマルチラメラ小胞を形成し、ミクロンサイズのマルチラメラスタックを形成し、懸濁液は乳白色に見える。
  8. 脂質スタックの破壊を容易にし、多層減少を低減するために、完全に凍結するまで、水和脂質溶液のバイアルをラボグレードの冷凍庫(好ましくは-80°Cフリーザー)に入れ、その後、バイアルを35°Cの水浴に移して、脂質溶液が完全に解凍されるまで、5回の凍結/解凍サイクルを行います。解凍溶液を均質になるまで渦液。さらに 4 回繰り返します。
    注:あるいは、ドライアイス浴はアセトンとドライアイスを組み合わせることで、急速な凍結に備えることができます。

3. 水和脂質溶液の押出

  1. 2つの膜支持体の間にポリカーボネート膜を使用して押出機のセットアップを組み立て、各側に2つの紙フィルターを追加して、サポートを追加します。ターゲットリポソームサイズに一致する孔径のポリカーボネート膜を使用します(NSE実験では一般的な孔径は50nmと100nmで、通常、直径100nmのリポソームは膜の変動を少なくすることができますが、曲率研究には50nmのリポソームが小さい。アセンブリを完成させる前にポリカーボネート膜が十分に伸張していることを確認し、外部押出機ケーシングを締めます。
  2. 気密性ガラス注射器を用いて、D2OまたはD2O-バッファの約0.3 mLを膜集合体を通して、ポリカーボネート膜を水和する。サンプル調製で使用されるのと同じバッファを利用します。少なくとも10分間放置し、サンプルを導入する前にバッファーを完全に吸い出します。
  3. 1 mL 気密シリンジに調製した脂質溶液を充填し、押出機装置の一端に挿入します。次に、反対の端に空のシリンジを挿入します。シリンジが押出機アセンブリに接続されたら、押出機ブロックに配置します。
  4. 押出に対して高温が必要な場合、高転移温度を有する飽和脂質の場合(例えば、DSPC、Tm=55°C)のように、押出機加熱ブロックを脂質転移温度より上(例えば、60°C)上に予熱し、熱いプレートに加熱ブロックを配置するか、または図3Aに示すように循環浴を使用して下さい。
    注:このステップは、脂質の均一な混合を確実にし、押出中に極端な圧力を加えることを避けるために重要であり、ポリカーボネート膜を破裂させる可能性があります。低転移温度(<25°C)の脂質サンプルについては、室温で押出を行います。
  5. 脂質溶液を押し出すために、 図3Aに示すように、プログラム可能なシリンジポンプに設定された押出機をアルミニウム/スチールフレームに取り付けます。温度制御の押出の場合は、流体チャネルを備えたカスタムメイドの押出機ベースを追加し、循環水浴に取り付けます。
  6. メーカーのマニュアルに従って15-20押出サイクルを実行するようにシリンジポンプをプログラムします。押し出すと、脂質溶液の色が乳白色から透明オパールブルー(図3B、C)に変化し、期待通り可視光の波長よりも小さい最終的なリポソームサイズを示す。図3Aに示すシリンジポンプの種類については、以下の手順に従います。
    1. ポンプの設定を調整して開始します。 [Rate] ボタンを押したまま押し出し速度(50.99 mL/h)を入力し、[ 直径] ボタンを押して、シリンジ径(4.606mm)を入力します。画面上の各桁の下にある上向き矢印を使用して、その数字の値を変更します。
    2. サンプルシリンジを持つ押出機セットを右に置きます( 図3Aを参照)。 取り消し 灯が点灯するまで[取り消し]ボタンを押します。 [Start] を押して、サンプルが左(空)のシリンジに分配されるのを待ちます。
    3. サンプル(右)のシリンジが完全に空になる直前に [停止 ]ボタンを押します。分配されたボリュームを記録し、押し出しサイクルをプログラムするためにそれを使用します。フェーズ 1 (PH:01) が画面に表示されるまで 、レート ボタンを押したままにします。 ボリューム ボタンを押して、先ほど録音した分配ボリュームを入力します。このフェーズでは、取り消しライトがオフになっていることを確認します。
    4. もう一度 Rate ボタンを押し、右端の上矢印を使用してフェーズ 2 (PH:02) にアクセスします。 ボリューム を押して、先ほど記録した分配ボリュームと同じ値を入力します。このフェーズでは、取り消しライトが点灯するまで [取り消し] ボタンを押します。
    5. このサイクルを繰り返す場合は 、Rate ボタンをもう一度押し、右端の上矢印を使用してフェーズ 3 (PH:03) にアクセスします。LP:SE が画面に表示されるまで 音量 ボタンを押し、20に設定します。これは、ポンプが実行するループまたは繰り返しの数です。最後に 、Rate ボタンを押し、フェーズ4(PH:04)にアクセスし、 音量 ボタンを押して 停止 機能に到達します。ポンプは自動押し出し用に設定されました。
    6. [開始]を押して押し出しサイクルを開始します。
  7. 押し出された脂質懸濁液を含むシリンジをクリーンバイアルで空にし、保管または測定の準備を行います。高融解温度の脂質サンプルの場合、測定されるまで流体相転移の上にサンプルを保存します。それ以外の場合は、室温でサンプルを保持します。
  8. 凍結すると小胞が破裂するので、押し出されたサンプルを凍結しないでください(サスペンションは再び乳白色になります)。

4. サンプルのNSE測定と収集したデータの削減

  1. NSE実験の前に、適切なサンプル品質を確保するために利用可能な方法を使用してステップ3.7からの押し出しリポソームサンプルを特徴付ける。NSE実験のためのリポソーム懸濁液の品質を評価するために使用できる潜在的な炭化法のリストは、例えば、サイズ分布、多層性、横膜構造、議論のセクションに含まれています。
  2. 実験に必要なQ範囲と対応する計測器の設定を決定します。脂質二重層の曲げ剛性測定には、Q範囲~(0.04 - 0.2) Å-1を使用します。膜の厚さ変動の研究では、膜の厚さ35、66、67に対応する~(0.04 -0.2) Å-1のQ範囲を使用します。
    注: 実験開始前に、実験の設定について計測器の科学者と話し合ってください。前述のように、選択的に重膜のように散乱信号の事前情報が利用できない場合は特に、試料のSANS特性評価が必要である。あるいは、NSE計測器上の限られたQ範囲で静的(回折とも呼ばれる)測定を実行し、SANSと比較してそのような測定にかかる時間が大幅に長くなるという点に注意してください。
  3. 注射器または転写ピペットを使用して、NSEビームラインで入手可能な指定サンプルセルに押し出されたリポソーム懸濁液をロードします。標準的なNSEサンプルセルの厚さは1、2、3、4mmです。不コヒーレントなバックグラウンド信号を妥当な強度に保ちながら散乱信号を最適化する方法で、細胞の厚さを選択します。
    注: 経験則として、重水素化バッファー内のプロトリュート リポソームに 1 mm または 2 mm のパス長を持つサンプル セルを使用してください。重体のレベルが高いリポソーム(例えば、尾コントラストマッチリポソームまたは単一のプロティアードリーフレットを持つアサイムメトリックリポソーム)の場合は、より厚いサンプルセル(例えば、3または4mmのパス長)を使用して、サンプルがより多く利用可能な場合は、コストがかかる場合があります。
  4. バッファーに対して同じサンプル セルを準備します。リポソーム懸濁液と同様の緩衝液を使用する。バッファーの測定は、強度の正規化とバックグラウンド(BKG)補正に必要です。
  5. サンプルセルをNSE分光計のサンプルホルダーに入れ、測定実行をプログラムし、エコーデータを収集します。初めてNSEユーザーが使用する場合は、測定のプログラミングについて計測器の科学者に相談してください。
  6. データ削減に必要な 2 つの追加の測定セットを実行します: 解像度 (R) と伝送 (T) 測定。
    1. 同じ設定で実行する弾性散乱基準(例えば、炭素)で解像度(R)測定を行います。すなわち、サンプルおよびバッファーの測定値と同じ波形とフーリエ倍。
    2. サンプルとバッファで伝送(T)測定を行い、送信された中性子ビームの強度を計算します(下記のステップ4.9を参照)。透過は、開いたビームの中性子数で割ったサンプルまたはバッファーからの中性子数の比率(つまり、空のサンプル位置)として計算されます。
  7. 測定を行うNSE分光計専用のデータ削減ソフトウェアを使用して、収集したデータを削減します。
    注: 分光計が異なると、ソフトウェアやユーザーインターフェイスが異なる場合があります。以下は、データ分析と可視化環境(DAVE)を用いたNSEデータ削減の例です。68 NIST中性子研究センターでNSE分光計用に特別に書かれたソフトウェア。
    1. DAVEソフトウェアを開き、データ削減メニューから [NSEデータ を削減]を選択します。いくつかのポップアップ ウィンドウが表示されます。
    2. ファイルメニューから.echoファイルを開いて、異なるQ値でデータファイルをアップロードします。これらのファイルは、スピンエコー信号を持つ生データファイルに対応し、ファイル名に拡張子.echoを持っています。ファイルのアップロードが完了すると、使用可能なデータセットの下にファイルが表示されます。
    3. 選択したファイルを右クリックし、対応する測定に従ってラベルを付けます。例えば、サンプル、セル(空のセルまたはバッファの場合)、または解像度。
    4. 検出器のピクフルを2 x 2にグループ化し、[ データセット ]タブを使用して信号対雑音比を改善します。すべてのファイルに同じビン分割を適用します。つまり、解像度、セル、およびサンプル。
    5. すべてのピクセルグループのデータを検査し、キーボードのmキーを押して、信号の悪い方(図4Bを参照)をマスクします。ポップアップ ウィンドウにアクセスするには、Enterキーを押して、Fourier 回またはその後のすべてのフーリエ時間に同じマスクを適用します。また、データの削減中の任意の時点で、個々のピクセルに適用することもできます。マスクされたピクセルは緑色に変わります。
    6. 収集されたデータがエコー信号、すなわち位相電流の点でコサイン関数の形を、各検出器ピクセルにわたって確認します( 図4Aを参照)。
      注: 位相電流は中性子スピンの後乗角に比例します。したがって、 図 4Aに示すように、位相電流を位相角度として表すのが一般的です。パルス発生源の測定では、データに追加の飛行時間が適用され、中性子パルス内の入射中性子波長の関数としてエコー信号が得られます。
    7. まず、解像度ファイルを取り付けます。アップロードしたファイルの一覧から解像度のファイルを選択し、ファイルを右クリックします。ポップアップメニューから「 フィット操作:エコー(解像度)を調整」を 選択します。
    8. エコー信号の適合性が、ステップ 4.8 で必要なパラメータ Aを含む多くのフィッティングパラメータを生成することを確認します。適合値は、次の式を使用して自動的に実行されます。
      Equation 8
      ここで、ζエコー信号の周期(すなわち、図4Aのコサイン関数)は、入射中性子ビームの平均波長と波長広がりによって決定されるガウスエンベロープの幅σ、Φcは位相電流、及びΦ0は中性子50が経験するフィールドパスに依存するエコーポイントである。サンプルに関する物理情報は、式(1)のコサイン関数の振幅Aに符号化される。
      注: ガウスエンベロープの幅は、計測器の科学者があらかじめ定義した値に基づいて決まるので、変更しないでください。他のパラメータは、各ピクセルに対する特定のエコー信号に適合する変数です。
    9. 各ピクセルをクリックして適合結果を検査し、結果として得られる適合パラメータ、適合の品質、適合度の平均平方偏差を表示します。検出器全体で各継ぎ手パラメータに関連付けられたエラーを検査するには、[ イメージ オプション] を選択し、目的の継ぎ手パラメータを選択します。これにより、各ピクセルに対するフィッティング パラメータの値を持つマップが生成されます。検出器の画像を右クリックします。選択したフィッティングパラメータのエラーバーマップを示すポップアップウィンドウが表示されます。
    10. 特定のピクセルに対する適合が不十分な場合(例えば、大きな誤差範囲を持つパラミーターを適合させる)、その特定のピクセルの上に信号を再フィットします。そのピクセルを選択し、[フィット]タブを押して、[ピクセルの調整]を押します。「フィッティング」タブでフェーズ(Φ0)と期間(ζ)の新しい開始パラメータを入力して、より満足のいくフィット感を得ます。
      注: 適合相をフーリエ時間の関数としてプロットすると便利です。これを行うには、メインプロットウィンドウに移動し、 フィット相対フーリエ時間を選択します。このプロットは、滑らかで連続的である必要があります。このプロットの不連続性を検査し、対応するピクセルを再調整します。
  8. アップロードされたファイルリストとラベル付きファイルリストから対応するファイルを選択して、サンプルファイルまたはセルファイルを削減します。
    1. 手順 4.7.5 で説明したように、すべてのピクセルを検査し、統計情報が正しくないものをマスクします。
    2. ファイルを右クリックし、[ フィット操作: フェーズのインポート (サンプル、セル)]を選択します。これにより、フェーズと適用されたマスクが解像度ファイルからインポートされます。
    3. 解像度ファイル(手順 4.7.8-4.7.10)で前述したのと同じ手順を使用してエコー信号を適合します。サンプルファイルとセルファイルのフィッティングでは、解像度フィットから読み込んだ期間とエコーフェーズポイントの値を変更しないでください。これらのパラメータはインストゥルメンタルの設定に依存し、サンプルによって異なるべきではありません。
    4. データ削減に進む前に、すべてのデータ ファイルに対してビーム中心を入力します。データ ファイルを選択し、[ 一般 ]タブに移動し、X と Y の梁中心の値を入力します。これらの値は、実験中に記録されます。
    5. サンプル、セル、解像度の各ファイルに適合したら、後でデータ分析と解釈に使用する正規化された中間スキャッタリング関数を計算します。これを行うには、適合ファイルのリストから削減するサンプルファイルを右クリックし、ポップアップメニューから 「I(Q)を計算 」を選択します。ウィンドウが表示され、解像度とセル (バッファー) ファイルのエントリオプションと Q アークの数 (ステップ 4.9 を参照) が表示されます。必要な情報をすべて入力したら 、[OK]ボタン を押します。結果は新しいウィンドウに表示されます。
      注:データ削減は、正規化された中間散乱関数69を得るために、次の式に従って行われます。
      Equation 4
      ここで、Tはフーリエ時間、NアップとNダウン はノンスピンフリップおよびスピンフリップ構成(それぞれπ/2フリッパーオフとπフリッパーオフとオンで測定)の中性子数であり、上付き文字BKGとRは、それぞれステップ4.4と4.6で定義されているように、背景と解像度の測定値に対応します。なお、ビーム偏光 Equation 3 は、このように中性子と試料との間のエネルギー交換によるスピン状態の変化が、偏光(一体から)の低下として検出される。
  9. 最後に、図4Bに示すように検出器のピクセルをQ-アークにグループ化し、正規化された中間散乱関数のQ-依存性を求める、S(Q、t)/S(Q,0)。 これは、技術的にはデータビニングと呼ばれ、サンプルからのカウント統計とグループ化されたピクセル上のデータの予想標準偏差を考慮して、慎重に行う必要があります。
  10. サンプルを強く散乱する場合は、結果として得られた中間散乱関数S(Q、t)/S(Q,0)上で合理的な誤差バーを維持しながら、検出器をより多くのQアークに分割します。 これにより、Q データポイントが多くなり、以下で説明するデータ分析手順に重要です。サンプルを弱く散乱させる場合、過度のビン分割は減衰信号の不良、すなわちS(Q、t)/S(Q,0)の大きな誤差範囲で発生し、大きな不確実性を生じる可能性があることに注意してください。

5. データ分析と解釈

  1. 正規化された中間散乱関数に適合する、S(Q、t)/S(Q,0)は、上記のデータ減少から得られた伸縮指数関数に2/3 70の伸縮指数関数を行う。
    Equation 9
    注: これらの適合の例は 、図 5B に示されています。S(Q,t) / S(Q,0) を式 (3) に適合すると、Q依存緩和率Γ(Q) が得られます。
  2. Qの関数としてΓ(Q)をプロットし、適切なモデルに適合して、関連する膜パラメータを抽出します。

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Representative Results

ベンド変動にアクセスするNSE研究は、通常、~(0.04 - 0.2)Å-1のQ範囲で行われます。このQ範囲は、膜の厚さとリポソーム半径の中間長さスケールに対応し、曲げダイナミクスが支配的です。拡張されたQ-範囲を超える測定は、リポソーム拡散および膜内動態を含む追加の動的モードへのアクセスを提供することができる。NSEがアクセスする膜動態のクロスオーバーの詳細については、これらの関連資料25,71を参照してください。NSE信号は、 Equation 5 私と私のincがそれぞれ、サンプルからの一貫性と支離滅裂な散乱強度であるに比例していることを強調することが重要です。したがって、NSEリポソームサンプルを重水素化緩衝液(すなわち、H2Oの代わりにD2Oで調製した緩衝液)を最小化し、主に試料の水素含有量に寄与する。しかし、中間重水素化スキーム(すなわち、D2OとH2Oの混合物を使用する)は、最適なコントラスト条件を得るために必要な場合がある。典型的には、膜曲げ変動のNSE測定は、重水素化緩衝液中の完全に突起リポソームに対して行われ、図5では完全に対照的なリポソームと呼ばれる。この重水素化スキームは、膜コア(約0×10-6 Å-2)とその重水素流体環境(約6.4×10-6 Å-2)との間に大きなNSLD差をもたらし、リポソーム膜からの散乱信号を有意に増強し、曲げダイナミクスの測定統計を改善する。このコントラストスキーム(図2A左パネル)は、単一38、72、複数39、66脂質成分を有する脂質膜の曲げ剛性の研究および生物学的インクルージョン(例えば、コレステロール、薬物分子、ペプチド/タンパク質)36、37、73、74、75、および合成添加剤(g.7)の研究において頻繁に利用される。

曲げ変動の測定は、熱起伏弾性薄シート70のためにジルマンとグラネクによって予測されるように、Q3依存に続く緩和率をもたらす。このQ-依存の洗練された形態は、ザイフェルトとランガー79によって提案された単層間摩擦の影響を考慮に入れたワトソンとブラウン78による理論的な修正から得られる。さらに、親水性ヘッドグループと膜の疎水性尾翼との界面に位置する中性面を定義することにより、曲げ緩和率を次の式38に適合させることができる。

Equation 6

ここでηバフは緩衝粘度であり、kBTは熱エネルギーであり、κとは測定された膜の屈曲剛性(または選択的に重水素化された系における膜の対照部分)である。このタイプの測定は曲げ剛性率の形態の膜弾性特性の直接計算を可能にする。図5Cに示すように、Γ対Q3の線形フィットの傾きからκが抽出されることに注意してください。

一方、膜厚変動のNSE測定では、膜厚に対応するQ値を中心としたq3-依存性Γ(Q)からの偏差を示す(ref.66の図2を参照)。厚さ変動信号を分離するために、図5Dに示すように、Γ Q(Q)をQ3で割ることができます。結果のデータは、厚さの変動による過剰なダイナミクスがQのローレンツィアン関数に従うことを示し、最近、粗粒度の分子動力学(MD)シミュレーション67で裏付けられた。観察された過剰なダイナミクスに合わせて、長尾ら38は、ビンガムら80によって膜変動の理論的枠組みに基づく発現を次のように開発した。

Equation 7

この式において、Q0は膜厚に対応するピークQ−値(SANS測定から独立して得ることができる)、μは、面内膜粘度、ALは、脂質当たりの面積(SANS/SAXSで測定)、およびKAは領域圧縮率である。KAがポリマーブラシモデルを用いてκから算出できると仮定すると、この発現は1つのフィットパラメータ、すなわち膜粘度μに低下し、蛍光標識または粒子テザリング/トラッキング13を必要とせずに膜粘度を測定する新しいアプローチを提示する。前提は、弾性薄いシート81の変形モデルによれば、κとKAは Equation 10 、tmが機械的(または変形可能な)膜の厚さであり、βが相互に連結を記述する定数であるような相互依存していることである。完全   結合リーフレットの場合はβ = 12、完全結合リーフレットの場合β = 48、中間結合リーフレットの場合β = 24 と仮定します。後者は、ポリマーブラシモデル81と呼ばれ、単一成分およびバイナリー液脂質膜39に適用することが示されている。ただし、これは慎重に対処する必要があります。例えば、ドクトロヴァらによる最近のシミュレーション。82は、高分子ブラシモデルがコレステロールを含む不飽和脂質膜に保持するために、機械的膜厚さの修飾された発現を使用しなければならないことを示した。理想的には、KAの独立した測定が可能な場合、例えば、マイクロピペット吸引83を使用して、KAの結果をNSE曲げ剛性測定と組み合わせることで、モデルおよび生物学的膜におけるリーフレット間結合を調査するユニークな機会を提示し、膜物理学および構造生物学における長年の疑問を提示する。KAの値が検証されると、式5で使用してメソスコラク膜粘度を得ることができる。

Figure 1
図1:NSE機器設計とメソスコス膜ダイナミクスの長さ/時間スケールとの相乗的な重複. (A) NSE機器の異なる磁気要素の概略図は、左から右へ楽器を横断する中性子のスピンを操作するために使用されます。強調表示された中性子は、中性子と試料との間のエネルギー交換によるスピン方向(または偏光損失)の変化を示し、透明中性子はスピンエコー、すなわちゼロエネルギー交換による中性子スピンの変化を表さない。灰色の矢印は、分光器の第2アームを回転させ、より大きな散乱角度にアクセスする可能性を示しています。(B) 脂質膜における階層的ダイナミクスの絵画表現,複数の長さと時間スケールにまたがる様々な動的モードを示す。シェーディング領域は、NSE がアクセスする長さと時間スケールを表し、これは、一括膜変動のメソスケール、すなわち曲げと厚さの変動と重なっています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:脂質膜に関するNSE実験における可能な重水素化スキームの例(A)左:完全に対照的な膜、例えば、重水素緩衝液中の突出膜、膜表面に垂直に沿ったNSLDプロファイルを示す。膜の尾部領域(〜0×10-2Å-2)とヘッドグループ領域(〜4.5×10-6Å-2)との間のNSLDの差は、重水素化緩衝液を有するヘッドグループハイドレーションによるものである。 右:膜の炭化水素テール領域が緩衝液と同じNSLDを有するようなテールコントラスト一致膜は、膜正常に沿った対応するNSLDプロファイルに示されるようになる。(B) ドメイン(中央)またはマトリックス(左)がバッファに対比する2つの中性子対比スキームを有するドメイン形成膜は、それぞれマトリックスまたはドメインダイナミクスの選択的研究を可能にする。この図は、ニッケルら、JACS 201541.から修正されています。(C) シクロデキストリン交換によって調製された非対称膜は、プロチレートされた脂質小胞と重水素化された小胞との間で、他方のリーフレットをプロティレートしたまま一方の膜リーフレットの重膜をもたらす。これにより、プロティア化リーフレットの曲げダイナミクスの研究が可能になり、非対称膜内の対向するリーフレット間の機械的結合に関する洞察を提供します。この図は、リッカードら、ナノスケール202040から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:リポソームの自動押出のセットアップの図( A)シリンジポンプ、ミニ押出機セット、および環状押出を可能にするアルミニウム/スチールフレームを使用したカスタム構築自動押出機。(B)および(C)は、(乳白色)および(透明オパールブルー)押出の前に脂質懸濁液の外観の違いを示す。これは、可視光の波長の順または大きいミクロンサイズの脂質スタックまたは巨大な小胞の初期形成によるものです。押出後、懸濁液は、可視光の波長よりも小さいナノスコピック小胞(〜100nm)を含み、透明懸濁液を生じる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:リポソーム懸濁液に関するNSE実験の代表的なデータ(A)1つの検出器ピクセル(パネルBにピクセルをマーク)上のエコー信号の例で、エコーフィットに必要な異なるパラメータの図を用いて、式(1)を用いてエコー信号の適合を示す。エコー信号は、プロトコルのステップ4.7で説明したように、位相電流ではなく位相角の関数としてプロットされることに注意してください。(B)1ピクセル当たりの中性子数の変動を示すNSE検出器画像。画像はまた、エコー信号が悪いために除去された検出器ピクセル(緑色)を示しています。Qアーク(Debye-Scherrerリングとも呼ばれる)の検出器ピクセルのビニングは、NSEデータの分析と解釈に必要な中間散乱関数のQ依存性を生み出します。この図はアシュカー、J.Appl.Phys. 202050.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:異なる重水素化スキームを有するリポソーム懸濁液に関するNSE実験の代表的な結果。(A)リポソームと相互作用する中性子の散乱幾何学は、散乱角度、2θ、および波ベクトル伝達を示す Equation 11 。(B)中間散乱関数、S(Q、t)/S(Q,0)は、フーリエ時間の関数として減衰を示す。 測定された減衰の適合は、式 3 で与えられた伸びた指数関数に、緩和率 Γを生み出します。(C) 重水素化緩衝液中の完全にプロトレートリポソームの場合、Γ(Q)は、曲げダイナミクスの典型的なQ3依存性に従う。取得したデータをジルマングラネクモデルに線形フィットすると、膜の曲げ剛性係数が得られます。(D) 重性リポソームの尾部では、曲げ変動に加えて過剰なダイナミクスが観察され、膜の厚さに対応するQ値で最も顕著である。ローレンツィアン関数(式5)に過剰なダイナミクスを適合させると、膜粘度の抽出が可能になります。データセットは、NISTのNSE分光計で収集されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

NSEは、様々な条件下での脂質膜のメソスコピックダイナミクスを測定する上で強力かつユニークな技術です。NSEの有効利用は、サンプルの品質、中性子のコントラスト、および特定のサンプルに対してプローブ可能なアクセス可能なダイナミクスの範囲に依存します。したがって、NSE実験を成功させ、高品質なデータを収集するには、いくつかの重要なステップが必要です。NSE実験中に中性子ビーム時間を有効に使用するための重要なステップは、NSE実験の前にラボベースの方法でリポソーム懸濁液を特徴付けることだ。エカデミテの場合、押出リポソームのサイズ分布(または拡散定数)は、動的光散乱(DLS)によって決定され、個々のラボまたは共用施設84で容易に入手できる。クライオ電子顕微鏡法は、リポソーム懸濁液のクライオミクロトム化切片上の高解像度顕微鏡画像を有効に使用して、リポソーム単層体65、ドメイン形成85、86、またはナノ粒子76およびタンパク質87などの添加物の組み込みを調べることができるリポソームサンプルで最近検証された別の炭化法である。あるいは、小角X線散乱(SAXS)を用い、膜構造88を特徴付け、リポソーム多層体性65を評価し、または膜構造特性89に対する添加剤の影響を評価することができる。これらのラボベースの技術に加えて、リポソームサンプルのNSE測定は、小角中性子散乱(SANS)54,90を用いた構造研究と組み合わせられるのが非常に推奨される。SANSは、構造膜情報を取得するだけでなく、サンプルからの中性子散乱信号の強度を調べ、造影スキームを確認し、NSE測定を行うべきQ範囲に関する情報に基づいた選択をするNSEを補完する優れたものです。したがって、NSE実験を申請する際には、NSEユーザーがSANSビームタイムを要求することを推奨します。

しかし、NSEは生物学的膜の研究においてサンプルの限界に苦しんでいます。このような実験の主な制限要因の1つは、NSE測定に必要な標準的な量のサンプル(2〜4mL)と、100〜200mgの膜物質(脂質およびタンパク質)に相当する高いサンプル濃度で高品質のデータを得る。多くの場合、そのような量の生物材料の生産は実現不可能であるか、またはコストが高い。このようなシナリオでは、濃度を20〜25mg/mLに減らすことが可能ですが、50mg/mL濃度のサンプルに匹敵する統計を得るためには、取得時間の少なくとも4倍の増加が必要になります。サンプルの容積および集中に対するこれらの厳しい条件は、オークリッジナショナルラボの第2のターゲットステーションや欧州スキャレーションソースなど、より高い磁束中性子源上の次世代のNSE分光計で緩和される可能性がある。選択的重水素化スキームを必要とする脂質膜に対するNSE実験を行う上でのもう一つの重大な制限は、脂質分子の一部の重水素化変異体の商業的有用性の欠如またはそれらの法外な価格が利用可能な場合である。場合によっては、オークリッジ国立研究所のバイオデューティレーションラボ、ANSTOの国家事業所、ISIS中性子とムオン源の重水素施設など、ユーザーの重水素化施設を通じて、これらの制限を回避することができます。これらの施設とその合成機能へのアクセスは、提案された材料合成の科学的メリットと同位体に敏感な研究におけるその意図された使用に基づいて査読される提出されたユーザー提案を通じて利用可能である。

これらの制限にもかかわらず、膜力学の研究におけるNSE分光法の適用は、単一成分の脂質膜35、38から多成分生物模倣膜41、66、91まで、様々な程度の複雑さの膜の曲げ剛性モジュリの決定につながっています。例えば、NSEは、異なる分子単位を有する脂質膜の剛性測定、例えば、異なるアシル鎖長および鎖飽和度の脂質38、72、92、膜力学における分子化学の役割に関する重要な情報を提供してきた。膜厚さや分子パッキング93などの構造情報と組み合わせると、これらの測定は、膜構造とダイナミクスの相互依存性と、それらが膜機能にどのように影響を与えるかについて新たな視点を提供し始めます。NSEのメソスコピックスケールは、分子集合体の長さのスケールに最も関連する構造特性関係の基本的な調査のために、それをユニークに位置づけます。このトピックは、最近、コレステロールが豊富な脂質膜36に関する2つのNSE研究と、2つの脂質成分39間の疎水性不一致を有する二項脂質膜において検討された。両方の研究は、膜力学が脂質当たりの領域と共にスケーリングするという強力な証拠を発見し、ドクトロヴァらによる最近の全原子MDシミュレーションからの結論を裏付ける82。これらの知見は、脂質膜の自己集合性を強調し、膜の動的および機能的特性を定義する上で重要なパラメータとして分子パッキングの統一画像を提供する。

NSEの他の用途は、コレステロール36、37、トレハロース92、およびメリチン73、94、または薬物送達用途用ナノ粒子などの無機添加剤を含む小さい添加剤に対する膜の機械的応答の研究を含む76。NSEは、温度92、pH74、および群集高分子96の存在を含む、膜力学が環境の変化にどのように反応するかを理解するためにも使用されている。このような研究は、脂質膜の軟化または硬化に影響を与える要因、健康および疾患に関連する生物学的条件下、および治療用途のための制御された設定において、より良い理解に寄与している。特に、NSE測定は膜動態73、94、95に対する抗菌ペプチドの効果を調査するためにも使用されてきた。バイオメンブレン上のNSE応用のさらなる例には、シアノバクテリア細胞97,98に光合成機械を収容するチラコイドと呼ばれる扁平化膜構造のダイナミクスの研究が含まれる。

また、NSE研究で選択的脂質重合を利用して、生物学的機能に関連する特定の膜特徴のダイナミクスを調査することができます。例えば、ニッケル等は、膜内の横コントラストを生成するためにドメイン形成脂質膜における選択的脂質重膜を用い、Heberleらら28によって先に示した。この重水素化スキームにより、脂質ドメインと宿主脂質マトリックス41 の曲げ剛性の独立した測定が可能になった( 図2B参照)。この知見により、2つの膜区画は明確な曲げ剛性モジュライを有することが確認され、これは細胞膜におけるドメイン形成の駆動メカニズムとなり得る。より最近の研究では、Rickeardらは、同位体標識されたリーフレット40 を有する非対称リポソームを得るために、プロティエートリポソームと重水素化リポソーム間のシクロデキストリン交換を使用した(図2C)。彼らの末端リポソームは、緩衝液と対照的なプロティアードリーフレットを有し、個々のリーフレットダイナミクスの研究を可能にし、非対称性およびリーフレット結合が膜曲げ変動に及ぼす影響の最初の直接的な実験アカウントを提供した。

選択的膜重膜は膜厚変動のNSE研究においても使用されているが、NSE分光35,100の出現で最近観察された脂質膜99における長い予測動態である。これらの測定は、膜ヘッドグループ領域からの信号を増幅し、厚み変動信号を解決するために、尾重膜を利用します。この種のNSE実験は比較的最近のものであるが、膜弾性と粘性特性38の相互依存性を理解するために有効に使用され、混合脂質膜39における分子パッキングによる屈曲剛性および粘度のスケーリングを探索し、かつ、粘性36に対するコレステロールの局所的な影響を探る。この動的モードが広範囲に及ぶ影響を及ぼす可能性のある生物学的意義のもう一つの領域は、メソスコピック膜-タンパク質相互作用95である。膜タンパク質の機能は、タンパク質と宿主膜との疎水性一致と密接に関連することが知られている。したがって、膜厚の変動は、膜の変化に起因し、膜タンパク質の機能の調節機構として作用する可能性がある。NSEは、タンパク質結合と挿入が膜の厚さゆらぎに及ぼす影響を直接調査できるため、このような研究に非常に適しています。当社グループ(未発表)の最近のNSE測定は、膜貫通タンパク質の挿入が膜の厚さ変動を有意に抑制し、シグナルイベントを調節する潜在的なメカニズムを提示する可能性があることを示唆しています。これは、NSEがタンパク質結合および挿入に対する膜の動的応答を理解する上で、タンパク質と細胞膜との相互作用によって与えられる主要な生物学的機能の長さと時間スケールに大きな影響を与えることができる、まだ未発達の研究分野です。

要約すると、NSEは重要な生物学的機能の空間的および時間的スケールに関する膜ダイナミクスを問い立てるための強力なツールとして、ここ数年で進化してきました。この技術は急速に広く関心を集めており、膜機能の主要な質問に答える可能性が高まっています。NSE内のコントラスト変動機能は、それ以外の場合は得にくいメソスコピック膜特性を測定するためのユニークなアプローチとして位置付けられています。膜動態の研究における従来の分光法に対するNSEのもう一つの大きな利点は、MDシミュレーションでアクセス可能な長さおよび時間スケールとの重複であり、膜を構成する異なる分子成分の分子レベル理解を得るための相乗的な実験/計算研究を可能にする。その約束にもかかわらず、大きなサンプル量の要件、生物学的システムにおける選択的重水素化の困難、NSE分光計の比較的低い中性子フラックスなど、生物学的膜研究におけるNSEの使用にはまだいくつかの制限があり、測定時間が長く、ビームタイムの可用性が限られています。しかし、これらの欠点は、中性子源と計装の絶え間ない発展と、重水素施設の進歩とともに、近い将来に克服される可能性があります。

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Disclosures

著者らは利益相反を宣言せず、開示するものは何もない。

Acknowledgments

R.アシュカーはM.ナガオ、L.-Rに感謝します。スティンタシウ、およびP.ゾルニエツクは、多くの有用な議論とそれぞれのビームライン上のNSE実験で頻繁に支援を行う。著者らは、NISTおよびORNLにおける中性子スピンエコー分光計の使用を認めている。NISTのNSE分光計は、国立標準技術研究所と国立科学財団とのパートナーシップである高解像度中性子散乱センターによって支えられている。DMR-1508249.ORNLのスマレーション中性子源のNSE分光計は、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局の科学ユーザー施設部門によって支えられている。オークリッジ国立研究所は、米国DOE契約No.の下でUT-Battelle,LLCによって管理されています。DE-AC05-00OR22725.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform (biotech grade) Sigma Aldrich 496189 Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath Julabo SE-12 Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide Cambridge Isotopes Laboratories DLM-4 Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance Mettler Toledo MS105 Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade) Sigma Aldrich E7023 200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets VWR 36360-536 Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials Thermo Scientific B7990-1 Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer Fisher Scientific IU2886D Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated) Avanti Polar Lipids varies by lipid Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier Millipore Sigma ZRQSVP3US Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set Avanti Polar Lipids 610020 Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings Grainger 2YDA1 and 2YDA7 Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump SyringePump.com New Era-1000 Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath Fisher Scientific CPX2800 Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven Thermo Scientific 3608 0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-414 Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

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生物学,課題171,集団脂質動態,曲げ弾性,領域圧縮率,厚み変動,膜粘度,選択的重水素,リポソーム製剤

Erratum

Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 08/06/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

In the Introduction, the fith pargraph was updated from:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

to:

Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.

In the Protocol, step 1.1 was updated from:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

to:

For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with Equation 1 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).

In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

to:

NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: Equation 5, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.

In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法
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Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (171), e62396, doi:10.3791/62396 (2021).

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