Questo documento descrive i protocolli per la preparazione dei campioni, la riduzione dei dati e l'analisi dei dati negli studi NSE (Neutron Spin Echo) delle membrane lipidiche. L'etichettatura giudiziosa dei lipidi al deuterio consente l'accesso a diverse dinamiche di membrana su scale di lunghezza e tempo mesoscopiche, su cui si verificano processi biologici vitali.
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Articolo metodologico
Spettroscopia eco-spin neutronica come sonda unica per la dinamica della membrana lipidica e le interazioni membrana-proteina
In questo articolo
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Sommario
Abstract
I doppi strati lipidici formano la matrice principale delle membrane cellulari e sono la piattaforma primaria per lo scambio di nutrienti, le interazioni proteina-membrana e il germogliamento virale, tra gli altri processi cellulari vitali. Per un'attività biologica efficiente, le membrane cellulari dovrebbero essere abbastanza rigide da mantenere l'integrità della cellula e dei suoi compartimenti ma abbastanza fluide da consentire ai componenti della membrana, come proteine e domini funzionali, di diffondersi e interagire. Questo delicato equilibrio delle proprietà elastiche e fluide della membrana, e il loro impatto sulla funzione biologica, richiedono una migliore comprensione delle dinamiche collettive della membrana su scale mesoscopiche di lunghezza e tempo dei principali processi biologici, ad esempio deformazioni della membrana ed eventi di legame proteico. Tra le tecniche che possono sondare efficacemente questa gamma dinamica c'è la spettroscopia neutron spin echo (NSE). In combinazione con l'etichettatura al deuterio, nSE può essere utilizzato per accedere direttamente alle fluttuazioni di flessione e spessore, nonché alla dinamica mesoscopica di caratteristiche selezionate della membrana. Questo documento fornisce una breve descrizione della tecnica NSE e delinea le procedure per l'esecuzione di esperimenti NSE su membrane liposomiali, compresi i dettagli della preparazione del campione e degli schemi di deuterazione, insieme alle istruzioni per la raccolta e la riduzione dei dati. Il documento introduce anche metodi di analisi dei dati utilizzati per estrarre i parametri chiave della membrana, come il modulo di rigidità di flessione, il modulo di comprimibilità dell'area e la viscosità nel piano. Per illustrare l'importanza biologica degli studi NSE, vengono discussi esempi selezionati di fenomeni di membrana sondati da NSE, vale a dire, l'effetto degli additivi sulla rigidità di flessione della membrana, l'impatto della formazione del dominio sulle fluttuazioni della membrana e la firma dinamica delle interazioni membrana-proteina.
Introduzione
La comprensione delle membrane cellulari e della loro funzione si è notevolmente evoluta negli ultimi decenni. La precedente visione delle membrane cellulari come doppi strati lipidici passivi che definiscono i confini cellulari e le proteine di membrana1 si è gradualmente trasformata in un modello dinamico in cui i doppi strati lipidici svolgono un ruolo importante nella regolazione dei processi biologici vitali, tra cui la segnalazione cellulare, lo scambio molecolare e la funzione proteica - per citarne alcuni2,3,4,
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Protocollo
1. Schema di deuterazione richiesto per l'esperimento
- Per le misurazioni delle fluttuazioni di flessione, effettuare liposomi completamente proziati in D2O (D 99,9%) o D2O-buffer (ad esempio, tampone fosfato preparato con D2O invece di H2O). Utilizzare DMPC completamente proziato (C36H72NO8P) e DSPC (C44H88NO8P) con
133,4 mg, dove XDMPC e XDSPC sono le frazioni molari di DMPC e DSPC, qui impostate rispettivamente a 0,7 e ....
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Risultati
Gli studi NSE che accedono alle fluttuazioni di flessione vengono in genere eseguiti su un intervallo Q di ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Questo intervallo Q corrisponde a scale di lunghezza intermedie tra lo spessore della membrana e il raggio liposomiale, dove dominano le dinamiche di flessione. La misurazione su un intervallo Q esteso può dare accesso a modalità dinamiche aggiuntive, tra cui la diffusione liposomiale e la dinamica intramembrana. Per maggiori dettagli sul cross-over nella dinamica delle membrane a cui .......
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Discussione
NSE è una tecnica potente e unica nella misurazione della dinamica mesoscopica delle membrane lipidiche in varie condizioni. L'utilizzo efficace di NSE dipende dalla qualità del campione, dal contrasto neutronico e dalla gamma di dinamiche accessibili che possono essere sonde per un determinato campione. Pertanto, sono necessari diversi passaggi critici per eseguire esperimenti NSE di successo e raccogliere dati di alta qualità. Un passo fondamentale per garantire l'uso efficace del tempo del fascio di neutroni durante u.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse e non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
R. Ashkar ringrazia M. Nagao, L.-R. Stingaciu e P. Zolnierczuk per molte discussioni utili e per la loro frequente assistenza con esperimenti NSE sulle rispettive linee di fascio. Gli autori riconoscono l'uso di spettrometri eco-spin neutronici presso NIST e ORNL. Lo spettrometro NSE del NIST è supportato dal Center for High Resolution Neutron Scattering, una partnership tra il National Institute of Standards and Technology e la National Science Foundation sotto accordo n. DMR-1508249. Lo spettrometro NSE presso la sorgente di neutroni di spallazione dell'ORNL è supportato dalla Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Ene....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloroformio (grado biotech) | Sigma Aldrich | 496189 | grado biotech., ≥ 99,8%, contiene lo 0,5-1,0% di etanolo come stabilizzatore |
| Circolatore d'acqua | Julabo | SE-12 | con pompa intelligente, impostazioni di temperatura programmabili e connessione di sensori esterni per la misurazione e il controllo |
| Ossido di deuterio | Cambridge Isotopes Laboratories | DLM-4 | Acqua deuterata; Acqua pesante (D2O) (D, 99,9%) |
| Bilancia semi-microbilancia digitale | Mettler Toledo | MS105 | Bilancia semi-micro con portata di 120 g, risoluzione di 0,01 mg, cella di pesata ad alta risoluzione, porte ergonomiche e applicazione per il controllo delle pipette |
| Etanolo (grado di biologia molecolare) | Etanolo Sigma Aldrich | E7023 | a 200 prove per applicazioni di biologia molecolare |
| Pipette in vetro | VWR | 36360-536 | Pipette monouso in vetro soda-calcico Pasteur |
| Fiale in vetro | Thermo Scientific | B7990-1 | Fiale in vetro borosilicato con tappi per setto in PTFE/silione Congelatore |
| da laboratorio | Fisher Scientific | IU2886D | Congelatore a bassissima temperatura (da -86 a -50 C) per la conservazione a lungo termine di lipidi e proteine |
| Lipidi (protaiti o perdeuterati) | I lipidi Avanti Polar variano | in base ai lipidi | I lipidi possono essere acquistati da Avanti in polvere o in una soluzione di cloroformio con le quantità e gli schemi di deuterazione richiesti. |
| Depuratore d'acqua Millipore | Sigma | ZRQSVP3US | Direct-Q® 3 sistemi di purificazione dell'acqua UV che erogano acqua pura e ultrapura con una lampada UV incorporata per ridurre i livelli di sostanze organiche per il biologico. applicazioni |
| Mini set di estrusori | Avanti Polar Lipids | 610020 | set di mini-estrusori comprende mini-estrusore, blocco riscaldante, 2 siringhe a tenuta di gas e 2 O-ring, membrane in policarbonato e supporti per filtri |
| Raccordi a connessione rapida | Grainger | 2YDA1 e 2YDA7 | Raccordi per tubi a pulsante per applicazioni di circolazione dell'acqua QuickConnect, ad es. estrusione di vescicole ad alta temperatura |
| Pompa | a siringaSyringePump.com | New Era-1000 | Pompa a siringa completamente programmabile per infusione e prelievo; programma fino a 41 fasi di pompaggio con velocità di pompaggio, volumi erogati e cicli di estrusione regolabili |
| Bagno ad ultrasuoni | Fisher Scientific | CPX2800 | Bagno a ultrasuoni a temperatura controllata con funzionalità programmabile per applicazioni di degasaggio e ultrasuoni |
| Forno a vuoto | Thermo Scientific | 3608 | Il forno sottovuoto da 0,7 piedi cubi con termostato integrato ad alto limite protegge dal surriscaldamento |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | Controllo analogico a velocità variabile che consente l'avvio a basso numero di giri per un'agitazione delicata o una miscelazione ad alta velocità per un vortice vigoroso dei campioni |
Riferimenti
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual ....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: 
, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: , where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.
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Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.
