Nøytronspinn ekkospektroskopi som en unik sonde for lipidmembrandynamikk og membranproteininteraksjoner

Summary

Dette dokumentet beskriver protokollene for prøvepreparering, datareduksjon og dataanalyse i NSE-studier (neutron spin echo) av lipidmembraner. Fornuftig deuteriummerking av lipider gir tilgang til forskjellige membrandynamikker på mesoskopisk lengde og tidsskalaer, over hvilke vitale biologiske prosesser oppstår.

Abstract

Lipid bilayers danner hovedmatrisen av cellemembraner og er den primære plattformen for næringsutveksling, proteinmembraninteraksjoner og viral spirende, blant andre vitale cellulære prosesser. For effektiv biologisk aktivitet bør cellemembraner være stive nok til å opprettholde cellens og dens roms integritet, men likevel flytende nok til at membrankomponenter, som proteiner og funksjonelle domener, kan spre seg og samhandle. Denne delikate balansen mellom elastiske og flytende membranegenskaper, og deres innvirkning på biologisk funksjon, nødvendiggjør en bedre forståelse av kollektiv membrandynamikk over mesoskopisk lengde og tidsskalaer av viktige biologiske prosesser, for eksempel membrandeformasjoner og proteinbindingshendelser. Blant teknikkene som effektivt kan sondere dette dynamiske området er nøytron spinn ekko (NSE) spektroskopi. Kombinert med deuteriummerking kan NSE brukes til å få direkte tilgang til bøying og tykkelsessvingninger samt mesoskopisk dynamikk i utvalgte membranfunksjoner. Dette dokumentet gir en kort beskrivelse av NSE-teknikken og skisserer prosedyrene for å utføre NSE-eksperimenter på liposomale membraner, inkludert detaljer om prøvepreparerings- og deuterasjonsordninger, sammen med instruksjoner for datainnsamling og reduksjon. Artikkelen introduserer også dataanalysemetoder som brukes til å trekke ut viktige membranparametere, for eksempel bøyestivhetsmodulus, områdekompressibility modulus og in-plane viskositet. For å illustrere den biologiske betydningen av NSE-studier diskuteres utvalgte eksempler på membranfenomener undersøkt av NSE, nemlig effekten av tilsetningsstoffer på membranbøyende stivhet, virkningen av domenedannelse på membransvingninger og den dynamiske signaturen av membranproteininteraksjoner.

Introduction

Forståelsen av cellemembraner og deres funksjon har utviklet seg bemerkelsesverdig de siste tiårene. Det tidligere synet på cellemembraner som passive lipid-bilayere som definerer cellegrenser og husmembranproteiner^1, har gradvis forvandlet seg til en dynamisk modell der lipidbilayere spiller en viktig rolle i å regulere vitale biologiske prosesser, inkludert cellulær signalering, molekylær utveksling og proteinfunksjon – for å nevne noen^2,3,4,5,6. Denne erkjennelsen av at cellemembraner er svært dynamiske, som stadig gjennomgår ombygging og molekylær omfordeling, har oppfordret til vitenskapelige undersøkelser utover likevektsstrukturer av membraner^7,8,9. Følgelig er flere tilnærminger utviklet for å studere de ulike dynamiske modusene i biologiske og bioinspirerte lipidmembraner. Til dags dato har de fleste av disse studiene primært fokusert på diffusive molekylære bevegelser^10,11,12,13 og makroskopiske formsvingninger^14,15,16, og etterlater et betydelig gap i å forstå mellomliggende membrandynamikk, det vil si kollektive svingninger i lipidsamlinger som består av få 10-100-tallet lipidmolekyler. Disse dynamikkene forekommer over lengdeskalaer på få tiere til få 100 Å og over tid skalaer av sub-ns til få hundre ns (se figur 1), referert til her som mesoskopiske skalaer. Det er faktisk på disse skalaene at viktig biologisk aktivitet foregår på^{membrannivå 17}. Dette inkluderer viral spirende¹⁸, kanal gating¹⁹, og membran-protein interaksjoner²⁰. Det er også viktig å påpeke at energilandskapet til membranproteiner^21,22 viser at konformasjonsendringer i proteiner – nødvendig for deres regulatoriske rolle – skjer over ns-tidsskalaene²³ av kollektive membransvingninger, og understreker ytterligere betydningen av mesoskopisk dynamikk i cellemembranens biologiske funksjon og deres bioinspirerte analoger²⁰. Dette papiret fokuserer på de to primære mesoskopiske dynamiske modusene i lipidmembraner, nemlig bøyningssvingninger og tykkelsessvingninger.

Hovedutfordringen med å undersøke disse svingningsmodusene direkte er vanskeligheten med samtidig tilgang til deres romlige og tidsmessige skalaer ved hjelp av standard spektroskopimetoder. Den andre utfordringen er at direkte kontaktteknikker kan påvirke de samme svingningene de er ment å måle¹⁶. Dette forverres ytterligere av sammensetningen og strukturell kompleksiteten til biologiske membraner^24,25, noe som resulterer i ikke-homogene membranegenskaper, inkludert lipiddomenedannelse^{26,27,28,29,30} og membran asymmetri^31,32,33– krever selektive sonder for å forstå dynamikken i forskjellige membranegenskaper. Heldigvis kan disse utfordringene overvinnes med ikke-invasive nøytronspektroskopimetoder, for eksempel nøytronspinnekko (NSE), som i seg selv får tilgang til ønsket lengde og tidsskalaer, og ytterligere muliggjør studier av selektive membranfunksjoner uten å endre deres fysisk-kjemiske miljø³⁴. Faktisk har NSE-spektroskopi de siste årene utviklet seg til en unik og kraftig sonde av kollektiv membrandynamikk³⁵. Resultater fra NSE-studier på lipidmembraner har gitt ny innsikt i^{mekaniske 36,37} og viskoelastiske^38,39 egenskaper til lipidmembraner og har kastet nytt lys over deres potensielle rolle i biologisk funksjon^40,41.

NSE spektroskopi teknikken er basert på en interferometrisk instrument design, først foreslått av Mezei⁴², ved hjelp av en rekke spin-flippers og magnetiske spoler for å kontrollere precession av nøytron spinn som nøytroner traversere instrumentet. Designet hviler på magnetisk speiling av magnetfeltelementene med hensyn til prøveposisjonen (Figur 1A). Dette innebærer at i fravær av energiutveksling mellom nøytron og prøven, utfører nøytronet samme antall spinnpresesjoner, i motsatte retninger, i første og andre halvdel av instrumentet (legg merke til π-flipper mellom de to precession spolene). Som et resultat forblir nøytronens endelige spinntilstand uendret i forhold til den opprinnelige tilstanden – et fenomen referert til som spin-ekko (se gjennomsiktig nøytron i figur 1A). Men når nøytronen samhandler energisk med prøven, endrer energiutvekslingen antall spinnpresesjoner i andre halvdel av instrumentet, noe som fører til en annen endelig spinntilstand (se figur 1A). Dette oppdages eksperimentelt som tap i polarisering, som vist senere i dette papiret. Hvis du vil ha mer informasjon om NSE-teknikken, henvises leseren til dedikerte tekniske papirer^42,43,44,45.

Her presenteres en forenklet beskrivelse for å gi et grovt estimat av lengden og tidsskalaene som er tilgjengelige for NSE. Lengdeskalaene bestemmes av rekkevidden av oppnåelige bølgevektoroverføringer, Q = 4π sin θ/λ, hvor 2θ er spredningsvinkelen og λ er nøytronbølgelengden. Man kan se at Q er satt av bølgelengdeområdet og rotasjonsgraden til den andre armen på spektrometeret (se figur 1A). Et typisk Q-område på NSE-spektrometre er ~0,02-2 Å^-146,47og opptil 0,01-4 Å^-1 med nylige oppgraderinger^48,49, tilsvarende romlige vekter på ~ 1-600 Å. På den annen side beregnes den tilgjengelige tidsskalaen fra den totale presesjonsvinkelen (eller fasen) som er oppnådd av nøytronet i de magnetiske precession-spolene, og er funnet å være⁵⁰: . I dette uttrykket er t Fourier-tiden definert som , hvor er nøytron gyromagnetisk forhold, er spolelengden, og er styrken til spolens magnetfelt. Det er verdt å påpeke at Fourier-tiden er en mengde som er strengt avhengig av instrumentgeometrien, magnetfeltstyrken og nøytronbølgelengden. For eksempel, ved hjelp av nøytroner av bølgelengde = 8 Å og instrumentinnstillinger på   = 1,2 m og = 0,4 T, beregnes Fourier-tiden til å være t ~ 50 ns. Eksperimentelt er Fourier-tiden innstilt ved å endre strømmen i precession-spolene (dvs. magnetisk feltstyrke) eller ved hjelp av forskjellige nøytronbølgelengder, noe som resulterer i typiske NSE-tidsskalaer på ~ 1 ps til 100 ns. Nylige oppgraderinger i NSE-spektrometre har imidlertid gitt tilgang til lengre Fourier-ganger, opp til ~ 400 ns på J-NSE-Phoenix spektrometeret på Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ og SNS-NSE-spektrometeret på Oak Ridge National Lab⁴⁸, og opptil ~ 1000 ns på IN15 NSE-spektrometeret ved Institut Laue-Langevin (ILL)⁴⁹. 

Foruten direkte tilgang til lengden og tidsskalaen til membrandynamikk, har NSE de iboende egenskapene til nøytronisotopfølsomhet⁵². Spesielt resulterer nøytronenes evne til å samhandle annerledes med isotoper av hydrogen, det mest tallrike elementet i biologiske systemer, i en annen nøytronspredningslengdetetthet,³⁴ eller NSLD (tilsvarende den optiske indeksen for brytning⁵⁰), når protium erstattes av deuterium. Dette aktiverer en tilnærming kjent som kontrastvariasjon, som vanligvis brukes til å fremheve bestemte membranfunksjoner eller skjule andre – sistnevnte scenario kalles kontrastsamsvar. En hyppig påføring av kontrastvariasjon/matching er utskifting av vann (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2) med tungtvann eller D₂O (NSLD = 6.. 4 × 10^-6 Å^-2) for å forsterke nøytronsignalet fra protierte lipidmembraner (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Denne tilnærmingen er svært effektiv i studier av membranstruktur fordi penetrasjonen av D₂O i membranens hodegrupperegion tillater nøyaktig bestemmelse av membrantykkelsene (se figur 2A, venstre panel) og av plasseringen av forskjellige lipidundergrupper når mer sofistikerte modeller påføres^53,54. Dette dokumentet fremhever noen eksempler på bruk av kontrastvariasjon for studier av kollektiv dynamikk i biomimetiske membraner og utvalgte membranfunksjoner.

Her illustreres effektiviteten av NSE i å gi unik innsikt i dynamiske og funksjonelle membranegenskaper gjennom konkrete eksempler på NSE-studier på modell og biologisk relevante lipidmembransystemer med vekt på mesoskala dynamikk i frittstående membraner, i form av liposomale suspensjoner. For NSE-målinger av in-plane membrandynamikk henvises leseren til dedikerte publikasjoner om beiteforekomst nøytron spin-echo spektroskopi (GINSES)^55,56 og andre studier av justerte multilamellarmembran stabler^57,58,59,60.

For enkelhets skyld fremhever dette dokumentet tre forskjellige ordninger for membrandeuterasjon illustrert på en godt studert domeneforming, eller fase separering, lipid bilayer system av 1,2-dimyristoyl-sn-glysero-3-fosfocholine (DMPC) og 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfocholine (DSPC) blandinger^61,62. De to lipidene er preget av en uoverensstemmelse i deres hydrokarbonkjedelengde (14 karboner/hale i DMPC vs. 18 karboner/hale i DSPC) og deres overgangstemperatur for gelvæske (T_{m, DMPC} = 23 °C vs. T_{m, DSPC} = 55 °C). Dette resulterer i lateral faseseparasjon i DMPC: DSPC-membraner ved temperaturer mellom øvre og nedre overgangstemperaturer i blandingen⁶³. Deuterasjonsordningene som vurderes her, velges for å demonstrere de forskjellige dynamiske modusene som er tilgjengelige i NSE-målinger på liposomale membraner, nemlig bøyesvingninger, tykkelsessvingninger og selektive bøynings- / tykkelsessvingninger i laterale domener. Alle lipidsammensetninger rapporteres for DMPC:DSPC-bilayers fremstilt ved en molefraksjon på 70:30, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige protierte og perdeutererte varianter av DMPC og DSPC. Alle prøveprepareringstrinn er basert på 4 ml liposomal suspensjon, i D₂O, med en lipidkonsentrasjon på 50 mg / ml, for en total lipidmasse på M_tot = 200 mg per prøve.

Protocol

1. Deuteration ordningen som kreves for eksperimentet For bøyevariasjonsmålinger, lag fullt protierte liposomer i D2O (D 99,9%) eller D2O-buffer (f.eks. fosfatbuffer fremstilt med D2O i stedet forH2O). Bruk fullt protert DMPC (C36H72NO8P) og DSPC (C44H88NO8P) med 133,4 mg, der XDMPC og XDSPC er…

Representative Results

NSE-studier som får tilgang til bøyesvingninger utføres vanligvis over et Q-område på ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Dette Q-området tilsvarer mellomliggende lengdeskalaer mellom membrantykkelsen og liposomal radius, hvor bøyedynamikk dominerer. Måling over et utvidet Q-område kan gi tilgang til flere dynamiske moduser, inkludert liposomal diffusjon og intramembrane dynamikk. Hvis du vil ha mer informasjon om krysset i membrandynamikken som NSE har tilgang til, kan du se disse relevante publikasjonene<sup class…

Discussion

NSE er en kraftig og unik teknikk for å måle mesoskopisk dynamikk i lipidmembraner under ulike forhold. Den effektive utnyttelsen av NSE avhenger av prøvekvalitet, nøytronkontrast og utvalget av tilgjengelig dynamikk som kan undersøkes for en gitt prøve. Dermed kreves det flere kritiske trinn for å utføre vellykkede NSE-eksperimenter og samle inn data av høy kvalitet. Et viktig skritt for å sikre effektiv bruk av nøytronstråletid under et NSE-eksperiment er å karakterisere liposomale suspensjoner med laborat…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples