Summary

Nøytronspinn ekkospektroskopi som en unik sonde for lipidmembrandynamikk og membranproteininteraksjoner

Published: May 27, 2021
doi:

Summary

Dette dokumentet beskriver protokollene for prøvepreparering, datareduksjon og dataanalyse i NSE-studier (neutron spin echo) av lipidmembraner. Fornuftig deuteriummerking av lipider gir tilgang til forskjellige membrandynamikker på mesoskopisk lengde og tidsskalaer, over hvilke vitale biologiske prosesser oppstår.

Abstract

Lipid bilayers danner hovedmatrisen av cellemembraner og er den primære plattformen for næringsutveksling, proteinmembraninteraksjoner og viral spirende, blant andre vitale cellulære prosesser. For effektiv biologisk aktivitet bør cellemembraner være stive nok til å opprettholde cellens og dens roms integritet, men likevel flytende nok til at membrankomponenter, som proteiner og funksjonelle domener, kan spre seg og samhandle. Denne delikate balansen mellom elastiske og flytende membranegenskaper, og deres innvirkning på biologisk funksjon, nødvendiggjør en bedre forståelse av kollektiv membrandynamikk over mesoskopisk lengde og tidsskalaer av viktige biologiske prosesser, for eksempel membrandeformasjoner og proteinbindingshendelser. Blant teknikkene som effektivt kan sondere dette dynamiske området er nøytron spinn ekko (NSE) spektroskopi. Kombinert med deuteriummerking kan NSE brukes til å få direkte tilgang til bøying og tykkelsessvingninger samt mesoskopisk dynamikk i utvalgte membranfunksjoner. Dette dokumentet gir en kort beskrivelse av NSE-teknikken og skisserer prosedyrene for å utføre NSE-eksperimenter på liposomale membraner, inkludert detaljer om prøvepreparerings- og deuterasjonsordninger, sammen med instruksjoner for datainnsamling og reduksjon. Artikkelen introduserer også dataanalysemetoder som brukes til å trekke ut viktige membranparametere, for eksempel bøyestivhetsmodulus, områdekompressibility modulus og in-plane viskositet. For å illustrere den biologiske betydningen av NSE-studier diskuteres utvalgte eksempler på membranfenomener undersøkt av NSE, nemlig effekten av tilsetningsstoffer på membranbøyende stivhet, virkningen av domenedannelse på membransvingninger og den dynamiske signaturen av membranproteininteraksjoner.

Introduction

Forståelsen av cellemembraner og deres funksjon har utviklet seg bemerkelsesverdig de siste tiårene. Det tidligere synet på cellemembraner som passive lipid-bilayere som definerer cellegrenser og husmembranproteiner1, har gradvis forvandlet seg til en dynamisk modell der lipidbilayere spiller en viktig rolle i å regulere vitale biologiske prosesser, inkludert cellulær signalering, molekylær utveksling og proteinfunksjon for å nevne noen2,3,4,5,6. Denne erkjennelsen av at cellemembraner er svært dynamiske, som stadig gjennomgår ombygging og molekylær omfordeling, har oppfordret til vitenskapelige undersøkelser utover likevektsstrukturer av membraner7,8,9. Følgelig er flere tilnærminger utviklet for å studere de ulike dynamiske modusene i biologiske og bioinspirerte lipidmembraner. Til dags dato har de fleste av disse studiene primært fokusert på diffusive molekylære bevegelser10,11,12,13 og makroskopiske formsvingninger14,15,16, og etterlater et betydelig gap i å forstå mellomliggende membrandynamikk, det vil si kollektive svingninger i lipidsamlinger som består av få 10-100-tallet lipidmolekyler. Disse dynamikkene forekommer over lengdeskalaer på få tiere til få 100 Å og over tid skalaer av sub-ns til få hundre ns (se figur 1), referert til her som mesoskopiske skalaer. Det er faktisk på disse skalaene at viktig biologisk aktivitet foregår påmembrannivå 17. Dette inkluderer viral spirende18, kanal gating19, og membran-protein interaksjoner20. Det er også viktig å påpeke at energilandskapet til membranproteiner21,22 viser at konformasjonsendringer i proteiner nødvendig for deres regulatoriske rolle skjer over ns-tidsskalaene23 av kollektive membransvingninger, og understreker ytterligere betydningen av mesoskopisk dynamikk i cellemembranens biologiske funksjon og deres bioinspirerte analoger20. Dette papiret fokuserer på de to primære mesoskopiske dynamiske modusene i lipidmembraner, nemlig bøyningssvingninger og tykkelsessvingninger.

Hovedutfordringen med å undersøke disse svingningsmodusene direkte er vanskeligheten med samtidig tilgang til deres romlige og tidsmessige skalaer ved hjelp av standard spektroskopimetoder. Den andre utfordringen er at direkte kontaktteknikker kan påvirke de samme svingningene de er ment å måle16. Dette forverres ytterligere av sammensetningen og strukturell kompleksiteten til biologiske membraner24,25, noe som resulterer i ikke-homogene membranegenskaper, inkludert lipiddomenedannelse26,27,28,29,30 og membran asymmetri31,32,33 krever selektive sonder for å forstå dynamikken i forskjellige membranegenskaper. Heldigvis kan disse utfordringene overvinnes med ikke-invasive nøytronspektroskopimetoder, for eksempel nøytronspinnekko (NSE), som i seg selv får tilgang til ønsket lengde og tidsskalaer, og ytterligere muliggjør studier av selektive membranfunksjoner uten å endre deres fysisk-kjemiske miljø34. Faktisk har NSE-spektroskopi de siste årene utviklet seg til en unik og kraftig sonde av kollektiv membrandynamikk35. Resultater fra NSE-studier på lipidmembraner har gitt ny innsikt imekaniske 36,37 og viskoelastiske38,39 egenskaper til lipidmembraner og har kastet nytt lys over deres potensielle rolle i biologisk funksjon40,41.

NSE spektroskopi teknikken er basert på en interferometrisk instrument design, først foreslått av Mezei42, ved hjelp av en rekke spin-flippers og magnetiske spoler for å kontrollere precession av nøytron spinn som nøytroner traversere instrumentet. Designet hviler på magnetisk speiling av magnetfeltelementene med hensyn til prøveposisjonen (Figur 1A). Dette innebærer at i fravær av energiutveksling mellom nøytron og prøven, utfører nøytronet samme antall spinnpresesjoner, i motsatte retninger, i første og andre halvdel av instrumentet (legg merke til π-flipper mellom de to precession spolene). Som et resultat forblir nøytronens endelige spinntilstand uendret i forhold til den opprinnelige tilstanden – et fenomen referert til som spin-ekko (se gjennomsiktig nøytron i figur 1A). Men når nøytronen samhandler energisk med prøven, endrer energiutvekslingen antall spinnpresesjoner i andre halvdel av instrumentet, noe som fører til en annen endelig spinntilstand (se figur 1A). Dette oppdages eksperimentelt som tap i polarisering, som vist senere i dette papiret. Hvis du vil ha mer informasjon om NSE-teknikken, henvises leseren til dedikerte tekniske papirer42,43,44,45.

Her presenteres en forenklet beskrivelse for å gi et grovt estimat av lengden og tidsskalaene som er tilgjengelige for NSE. Lengdeskalaene bestemmes av rekkevidden av oppnåelige bølgevektoroverføringer, Q = 4π sin θ/λ, hvor 2θ er spredningsvinkelen og λ er nøytronbølgelengden. Man kan se at Q er satt av bølgelengdeområdet og rotasjonsgraden til den andre armen på spektrometeret (se figur 1A). Et typisk Q-område på NSE-spektrometre er ~0,02-2 Å-146,47og opptil 0,01-4 Å-1 med nylige oppgraderinger48,49, tilsvarende romlige vekter på ~ 1-600 Å. På den annen side beregnes den tilgjengelige tidsskalaen fra den totale presesjonsvinkelen (eller fasen) som er oppnådd av nøytronet i de magnetiske precession-spolene, og er funnet å være50: Equation 12 . I dette uttrykket er t Fourier-tiden definert som Equation 13 , hvor er Equation 50 nøytron gyromagnetisk forhold, Equation 51 er spolelengden, og Equation 52 er styrken til spolens magnetfelt. Det er verdt å påpeke at Fourier-tiden er en mengde som er strengt avhengig av instrumentgeometrien, magnetfeltstyrken og nøytronbølgelengden. For eksempel, ved hjelp av nøytroner av bølgelengde Equation 70 = 8 Å og instrumentinnstillinger på Equation 51   = 1,2 m og Equation 52 = 0,4 T, beregnes Fourier-tiden til å være t ~ 50 ns. Eksperimentelt er Fourier-tiden innstilt ved å endre strømmen i precession-spolene (dvs. magnetisk feltstyrke) eller ved hjelp av forskjellige nøytronbølgelengder, noe som resulterer i typiske NSE-tidsskalaer på ~ 1 ps til 100 ns. Nylige oppgraderinger i NSE-spektrometre har imidlertid gitt tilgang til lengre Fourier-ganger, opp til ~ 400 ns på J-NSE-Phoenix spektrometeret på Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 og SNS-NSE-spektrometeret på Oak Ridge National Lab48, og opptil ~ 1000 ns på IN15 NSE-spektrometeret ved Institut Laue-Langevin (ILL)49

Foruten direkte tilgang til lengden og tidsskalaen til membrandynamikk, har NSE de iboende egenskapene til nøytronisotopfølsomhet52. Spesielt resulterer nøytronenes evne til å samhandle annerledes med isotoper av hydrogen, det mest tallrike elementet i biologiske systemer, i en annen nøytronspredningslengdetetthet,34 eller NSLD (tilsvarende den optiske indeksen for brytning50), når protium erstattes av deuterium. Dette aktiverer en tilnærming kjent som kontrastvariasjon, som vanligvis brukes til å fremheve bestemte membranfunksjoner eller skjule andre sistnevnte scenario kalles kontrastsamsvar. En hyppig påføring av kontrastvariasjon/matching er utskifting av vann (NSLD = -0,56 × 10-6 Å-2) med tungtvann eller D2O (NSLD = 6.. 4 × 10-6 Å-2) for å forsterke nøytronsignalet fra protierte lipidmembraner (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). Denne tilnærmingen er svært effektiv i studier av membranstruktur fordi penetrasjonen av D2O i membranens hodegrupperegion tillater nøyaktig bestemmelse av membrantykkelsene (se figur 2A, venstre panel) og av plasseringen av forskjellige lipidundergrupper når mer sofistikerte modeller påføres53,54. Dette dokumentet fremhever noen eksempler på bruk av kontrastvariasjon for studier av kollektiv dynamikk i biomimetiske membraner og utvalgte membranfunksjoner.

Her illustreres effektiviteten av NSE i å gi unik innsikt i dynamiske og funksjonelle membranegenskaper gjennom konkrete eksempler på NSE-studier på modell og biologisk relevante lipidmembransystemer med vekt på mesoskala dynamikk i frittstående membraner, i form av liposomale suspensjoner. For NSE-målinger av in-plane membrandynamikk henvises leseren til dedikerte publikasjoner om beiteforekomst nøytron spin-echo spektroskopi (GINSES)55,56 og andre studier av justerte multilamellarmembran stabler57,58,59,60.

For enkelhets skyld fremhever dette dokumentet tre forskjellige ordninger for membrandeuterasjon illustrert på en godt studert domeneforming, eller fase separering, lipid bilayer system av 1,2-dimyristoyl-sn-glysero-3-fosfocholine (DMPC) og 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfocholine (DSPC) blandinger61,62. De to lipidene er preget av en uoverensstemmelse i deres hydrokarbonkjedelengde (14 karboner/hale i DMPC vs. 18 karboner/hale i DSPC) og deres overgangstemperatur for gelvæske (Tm, DMPC = 23 °C vs. Tm, DSPC = 55 °C). Dette resulterer i lateral faseseparasjon i DMPC: DSPC-membraner ved temperaturer mellom øvre og nedre overgangstemperaturer i blandingen63. Deuterasjonsordningene som vurderes her, velges for å demonstrere de forskjellige dynamiske modusene som er tilgjengelige i NSE-målinger på liposomale membraner, nemlig bøyesvingninger, tykkelsessvingninger og selektive bøynings- / tykkelsessvingninger i laterale domener. Alle lipidsammensetninger rapporteres for DMPC:DSPC-bilayers fremstilt ved en molefraksjon på 70:30, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige protierte og perdeutererte varianter av DMPC og DSPC. Alle prøveprepareringstrinn er basert på 4 ml liposomal suspensjon, i D2O, med en lipidkonsentrasjon på 50 mg / ml, for en total lipidmasse på Mtot = 200 mg per prøve.

Protocol

1. Deuteration ordningen som kreves for eksperimentet For bøyevariasjonsmålinger, lag fullt protierte liposomer i D2O (D 99,9%) eller D2O-buffer (f.eks. fosfatbuffer fremstilt med D2O i stedet forH2O). Bruk fullt protert DMPC (C36H72NO8P) og DSPC (C44H88NO8P) med 133,4 mg, der XDMPC og XDSPC er…

Representative Results

NSE-studier som får tilgang til bøyesvingninger utføres vanligvis over et Q-område på ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Dette Q-området tilsvarer mellomliggende lengdeskalaer mellom membrantykkelsen og liposomal radius, hvor bøyedynamikk dominerer. Måling over et utvidet Q-område kan gi tilgang til flere dynamiske moduser, inkludert liposomal diffusjon og intramembrane dynamikk. Hvis du vil ha mer informasjon om krysset i membrandynamikken som NSE har tilgang til, kan du se disse relevante publikasjonene<sup class…

Discussion

NSE er en kraftig og unik teknikk for å måle mesoskopisk dynamikk i lipidmembraner under ulike forhold. Den effektive utnyttelsen av NSE avhenger av prøvekvalitet, nøytronkontrast og utvalget av tilgjengelig dynamikk som kan undersøkes for en gitt prøve. Dermed kreves det flere kritiske trinn for å utføre vellykkede NSE-eksperimenter og samle inn data av høy kvalitet. Et viktig skritt for å sikre effektiv bruk av nøytronstråletid under et NSE-eksperiment er å karakterisere liposomale suspensjoner med laborat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R. Ashkar takker M. Nagao, L.-R. Stingaciu og P. Zolnierczuk for mange nyttige diskusjoner og for deres hyppige hjelp med NSE-eksperimenter på deres respektive bjelkelinjer. Forfatterne erkjenner bruken av nøytron spinn ekkospektrometre ved NIST og ORNL. NSE-spektrometeret ved NIST støttes av Center for High Resolution Neutron Scattering, et partnerskap mellom National Institute of Standards and Technology og National Science Foundation under avtalenr. DMR-1508249. NSE-spektrometeret ved ORNLs Spallation Neutron Source støttes av Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory administreres av UT-Battelle, LLC under US DOE Contract No. DE-AC05-00OR22725.

Materials

Chloroform (biotech grade) Sigma Aldrich 496189 Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath Julabo SE-12 Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide Cambridge Isotopes Laboratories DLM-4 Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance Mettler Toledo MS105 Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade) Sigma Aldrich E7023 200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets VWR 36360-536 Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials Thermo Scientific B7990-1 Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer Fisher Scientific IU2886D Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated) Avanti Polar Lipids varies by lipid Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier Millipore Sigma ZRQSVP3US Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set Avanti Polar Lipids 610020 Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings Grainger 2YDA1 and 2YDA7 Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump SyringePump.com New Era-1000 Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath Fisher Scientific CPX2800 Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven Thermo Scientific 3608 0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-414 Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

References

  1. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
  2. Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 107-130 (2007).
  3. Lundbæk, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. Journal of The Royal Society Interface. 7 (44), 373-395 (2010).
  4. Bradley, R. P., Radhakrishnan, R. Curvature-undulation coupling as a basis for curvature sensing and generation in bilayer membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 117-124 (2016).
  5. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  6. Jensen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., Mouritsen, O. G. Lipids do influence protein function-the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 205-226 (2004).
  7. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  8. Katchalsky, A., Spangler, R. Dynamics of membrane processes. Quarterly Reviews of Biophysics. 1 (2), 127-175 (1968).
  9. Rheinstädter, M. C. Collective molecular dynamics in proteins and membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), 83-90 (2008).
  10. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1082 (2002).
  11. Hac, A. E., Seeger, H. M., Fidorra, M., Heimburg, T. Diffusion in two-component lipid membranes–a fluorescence correlation spectroscopy and monte carlo simulation study. Biophysical Journal. 88 (1), 317-333 (2005).
  12. Heinrich, M., Tian, A., Esposito, C., Baumgart, T. Dynamic sorting of lipids and proteins in membrane tubes with a moving phase boundary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7208-7213 (2010).
  13. Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring lipid membrane viscosity using rotational and translational probe diffusion. Physical Review Letters. 112 (18), 188101 (2014).
  14. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
  15. Bassereau, P., Sorre, B., Lévy, A. Bending lipid membranes: Experiments after W. Helfrich’s model. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 47-57 (2014).
  16. Monzel, C., Sengupta, K. Measuring shape fluctuations in biological membranes. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (24), 243002 (2016).
  17. Deserno, M. Mesoscopic membrane physics: concepts, simulations, and selected applications. Macromolecular Rapid Communications. 30 (9-10), 752-771 (2009).
  18. Reynwar, B. J., et al. Aggregation and vesiculation of membrane proteins by curvature-mediated interactions. Nature. 447 (7143), 461-464 (2007).
  19. Haswell, E. S., Phillips, R., Rees, D. C. Mechanosensitive channels: what can they do and how do they do it. Structure. 19 (10), 1356-1369 (2011).
  20. Phillips, R., Ursell, T., Wiggins, P., Sens, P. Emerging roles for lipids in shaping membrane-protein function. Nature. 459 (7245), 379-385 (2009).
  21. Dill, K. A., Chan, H. S. From Levinthal to pathways to funnels. Nature Structural Biology. 4 (1), 10-19 (1997).
  22. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  23. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  24. Lyman, E., Hsieh, C. -. L., Eggeling, C. From dynamics to membrane organization: experimental breakthroughs occasion a “modeling manifesto”. Biophysical Journal. 115 (4), 595-604 (2018).
  25. Arriaga, L. R., et al. Dissipative curvature fluctuations in bilayer vesicles: Coexistence of pure-bending and hybrid curvature-compression modes. The European Physical Journal. E, Soft Matter. 31 (1), 105-113 (2010).
  26. Honerkamp-Smith, A. R., Veatch, S. L., Keller, S. L. An introduction to critical points for biophysicists; observations of compositional heterogeneity in lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (1), 53-63 (2009).
  27. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  28. Heberle, F. A., et al. Bilayer thickness mismatch controls domain size in model membranes. Journal of the American Chemical Society. 135 (18), 6853-6859 (2013).
  29. Nickels, J. D., et al. The in vivo structure of biological membranes and evidence for lipid domains. PLOS Biology. 15 (5), 2002214 (2017).
  30. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387 (6633), 569-572 (1997).
  31. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  32. Liu, S. -. L., et al. Orthogonal lipid sensors identify transbilayer asymmetry of plasma membrane cholesterol. Nature Chemical Biology. 13, 268 (2016).
  33. Rothman, J., Lenard, J. Membrane asymmetry. Science. 195 (4280), 743-753 (1977).
  34. Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D. 74 (12), 1129-1168 (2018).
  35. Woodka, A. C., Butler, P. D., Porcar, L., Farago, B., Nagao, M. Lipid bilayers and membrane dynamics: insight into thickness fluctuations. Physical Review Letters. 109 (5), 058102 (2012).
  36. Chakraborty, S., et al. How cholesterol stiffens unsaturated lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (36), 21896-21905 (2020).
  37. Arriaga, L. R., et al. Stiffening effect of cholesterol on disordered lipid phases: a combined neutron spin echo + dynamic light scattering analysis of the bending elasticity of large unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 96 (9), 3629-3637 (2009).
  38. Nagao, M., Kelley, E. G., Ashkar, R., Bradbury, R., Butler, P. D. Probing elastic and viscous properties of phospholipid bilayers using neutron spin echo spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (19), 4679-4684 (2017).
  39. Kelley, E. G., Butler, P. D., Ashkar, R., Bradbury, R., Nagao, M. Scaling relationships for the elastic moduli and viscosity of mixed lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (38), 23365-23373 (2020).
  40. Rickeard, B. W., et al. Transverse lipid organization dictates bending fluctuations in model plasma membranes. Nanoscale. 12 (3), 1438-1447 (2020).
  41. Nickels, J. D., et al. Mechanical properties of nanoscopic lipid domains. Journal of the American Chemical Society. 137 (50), 15772-15780 (2015).
  42. Mezei, F. Neutron spin echo: A new concept in polarized thermal neutron techniques. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 255 (2), 146-160 (1972).
  43. Hayter, J. B., Penfold, J. Neutron spin-echo integral transform spectroscopy. Zeitschrift für Physik B Condensed Matter. 35 (2), 199-205 (1979).
  44. Monkenbusch, M., Richter, D., Imae, T., Kanaya, T., Furusaka, M., Torikai, N. . Neutrons in Soft Matter. , 147-182 (2011).
  45. Pynn, R., Mezei, F., Pappas, C., Gutberlet, T. . Neutron Spin Echo. , 159-177 (2003).
  46. Holderer, O., et al. The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II. Measurement Science and Technology. 19 (3), 034022 (2008).
  47. Schleger, P., et al. The long-wavelength neutron spin-echo spectrometer IN15 at the Institut Laue-Langevin. Physica B: Condensed Matter. 241-243, 164-165 (1997).
  48. Holderer, O., Zolnierczuk, P., Pasini, S., Stingaciu, L., Monkenbusch, M. A better view through new glasses: Developments at the Jülich neutron spin echo spectrometers. Physica B: Condensed Matter. 562, 9-12 (2019).
  49. Farago, B., et al. The IN15 upgrade. Neutron News. 26 (3), 15-17 (2015).
  50. Ashkar, R. Selective dynamics in polymeric materials: Insights from quasi-elastic neutron scattering spectroscopy. Journal of Applied Physics. 127 (15), 151101 (2020).
  51. Pasini, S., Holderer, O., Kozielewski, T., Richter, D., Phoenix Monkenbusch, M. J-NSE- Phoenix, a neutron spin-echo spectrometer with optimized superconducting precession coils at the MLZ in Garching. Review of Scientific Instruments. 90 (4), 043107 (2019).
  52. Svergun, D. I., Koch, M. H. J., Timmins, P. A., May, R. P. . Small Angle X-Ray and Neutron Scattering from Solutions of Biological Macromolecules. , (2013).
  53. Eicher, B., et al. Joint small-angle X-ray and neutron scattering data analysis of asymmetric lipid vesicles. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 419-429 (2017).
  54. Heberle, F. A., et al. Model-based approaches for the determination of lipid bilayer structure from small-angle neutron and X-ray scattering data. European Biophysics Journal. 41 (10), 875-890 (2012).
  55. Jaksch, S., Koutsioubas, A., Mattauch, S., Holderer, O., Frielinghaus, H. Long-range excitations in phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 225, 104788 (2019).
  56. Jaksch, S., et al. Influence of ibuprofen on phospholipid membranes. Physical Review E. 91 (2), 022716 (2015).
  57. Armstrong, C. L., et al. Effect of cholesterol on the lateral nanoscale dynamics of fluid membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 901-913 (2012).
  58. Rheinstädter, M. C., Häußler, W., Salditt, T. Dispersion relation of lipid membrane shape fluctuations by neutron spin-echo spectrometry. Physical Review Letters. 97 (4), 048103 (2006).
  59. Armstrong, C. L., Häußler, W., Seydel, T., Katsaras, J., Rheinstädter, M. C. Nanosecond lipid dynamics in membranes containing cholesterol. Soft Matter. 10 (15), 2600-2611 (2014).
  60. Nickels, J. D., et al. Lipid rafts: buffers of cell membrane physical properties. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (9), 2050-2056 (2019).
  61. Michonova-Alexova, E. I., Sugár, I. P. Component and state separation in DMPC/DSPC lipid bilayers: a Monte Carlo simulation study. Biophysical Journal. 83 (4), 1820-1833 (2002).
  62. Sugár, I. P., Thompson, T. E., Biltonen, R. L. Monte Carlo simulation of two-component bilayers: DMPC/DSPC mixtures. Biophysical Journal. 76 (4), 2099-2110 (1999).
  63. Mabrey, S., Sturtevant, J. M. Investigation of phase transitions of lipids and lipid mixtures by sensitivity differential scanning calorimetry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 73 (11), 3862-3866 (1976).
  64. . Neutron activation and scattering calculator Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2021)
  65. Scott, H. L., et al. On the mechanism of bilayer separation by extrusion, or why your LUVs are not really unilamellar. Biophysical Journal. 117 (8), 1381-1386 (2019).
  66. Ashkar, R., et al. Tuning membrane thickness fluctuations in model lipid bilayers. Biophysical Journal. 109 (1), 106-112 (2015).
  67. Carrillo, J. -. M. Y., Katsaras, J., Sumpter, B. G., Ashkar, R. A computational approach for modeling neutron scattering data from lipid bilayers. Journal of Chemical Theory and Computation. 13 (2), 916-925 (2017).
  68. Azuah, R. T. DAVE: a comprehensive software suite for the reduction, visualization, and analysis of low energy neutron spectroscopic data. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 114 (6), 341-358 (2009).
  69. Van Hove, L. Correlations in space and time and born approximation scattering in systems of interacting particles. Physical Review. 95 (1), 249-262 (1954).
  70. Zilman, A. G., Granek, R. Undulations and dynamic structure factor of membranes. Physical Review Letters. 77 (23), 4788-4791 (1996).
  71. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. . Collective dynamics in model biological membranes measured by neutron spin echo spectroscopy. , 131-176 (2019).
  72. Zheng, Y., Michihiro, N., Dobrin, P. B. Bending elasticity of saturated and monounsaturated phospholipid membranes studied by the neutron spin echo technique. Journal of Physics: Condensed Matter. 21 (15), 155104 (2009).
  73. Sharma, V. K., Qian, S. Effect of an antimicrobial peptide on lateral segregation of lipids: a structure and dynamics study by neutron scattering. Langmuir. 35 (11), 4152-4160 (2019).
  74. Boggara, M. B., Faraone, A., Krishnamoorti, R. Effect of pH and Ibuprofen on the Phospholipid Bilayer Bending Modulus. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (24), 8061-8066 (2010).
  75. Lee, J. -. H., et al. Thermal fluctuation and elasticity of lipid vesicles interacting with pore-forming peptides. Physical Review Letters. 105 (3), 038101 (2010).
  76. Chakraborty, S., Abbasi, A., Bothun, G. D., Nagao, M., Kitchens, C. L. Phospholipid bilayer softening due to hydrophobic gold nanoparticle inclusions. Langmuir. 34 (44), 13416-13425 (2018).
  77. Hoffmann, I., et al. Softening of phospholipid membranes by the adhesion of silica nanoparticles – as seen by neutron spin-echo (NSE). Nanoscale. 6 (12), 6945-6952 (2014).
  78. Watson, M. C., Brown, F. L. H. Interpreting membrane scattering experiments at the mesoscale: the contribution of dissipation within the bilayer. Biophysical Journal. 98 (6), 9-11 (2010).
  79. Seifert, U., Langer, S. A. Viscous modes of fluid bilayer membranes. Europhysics Letters (EPL). 23 (1), 71-76 (1993).
  80. Bingham, R. J., Smye, S. W., Olmsted, P. D. Dynamics of an asymmetric bilayer lipid membrane in a viscous solvent. EPL (Europhysics Letters). 111 (1), 18004 (2015).
  81. Rawicz, W., Olbrich, K. C., McIntosh, T., Needham, D., Evans, E. Effect of chain length and unsaturation on elasticity of lipid bilayers. Biophysical Journal. 79 (1), 328-339 (2000).
  82. Doktorova, M., LeVine, M. V., Khelashvili, G., Weinstein, H. A new computational method for membrane compressibility: bilayer mechanical thickness revisited. Biophysical Journal. 116 (3), 487-502 (2019).
  83. Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. The Journal of Physical Chemistry. 91 (16), 4219-4228 (1987).
  84. Lesieur, S., Grabielle-Madelmont, C., Paternostre, M. T., Ollivon, M. Size analysis and stability study of lipid vesicles by high-performance gel exclusion chromatography, turbidity, and dynamic light scattering. Analytical Biochemistry. 192 (2), 334-343 (1991).
  85. Heberle, F. A., et al. Direct label-free imaging of nanodomains in biomimetic and biological membranes by cryogenic electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 19943-19952 (2020).
  86. Cornell, C. E., Mileant, A., Thakkar, N., Lee, K. K., Keller, S. L. Direct imaging of liquid domains in membranes by cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 19713-19719 (2020).
  87. Yao, X., Fan, X., Yan, N. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18497-18503 (2020).
  88. Kučerka, N., Nieh, M. -. P., Katsaras, J. Fluid phase lipid areas and bilayer thicknesses of commonly used phosphatidylcholines as a function of temperature. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1808 (11), 2761-2771 (2011).
  89. Nielsen, J. E., Bjørnestad, V. A., Lund, R. Resolving the structural interactions between antimicrobial peptides and lipid membranes using small-angle scattering methods: the case of indolicidin. Soft Matter. 14 (43), 8750-8763 (2018).
  90. Kučerka, N., et al. Lipid bilayer structure determined by the simultaneous analysis of neutron and X-ray scattering data. Biophysical Journal. 95 (5), 2356-2367 (2008).
  91. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Scaling of lipid membrane rigidity with domain area fraction. Soft Matter. 15 (13), 2762-2767 (2019).
  92. Brüning, B. -. A., et al. Bilayer undulation dynamics in unilamellar phospholipid vesicles: Effect of temperature, cholesterol and trehalose. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1838 (10), 2412-2419 (2014).
  93. Kučerka, N., et al. Areas of monounsaturated diacylphosphatidylcholines. Biophysical Journal. 97 (7), 1926-1932 (2009).
  94. Sharma, V. K., Mamontov, E., Anunciado, D. B., O’Neill, H., Urban, V. S. Effect of antimicrobial peptide on the dynamics of phosphocholine membrane: role of cholesterol and physical state of bilayer. Soft Matter. 11 (34), 6755-6767 (2015).
  95. Kelley, E. G., Butler, P. D., Nagao, M. Collective dynamics in lipid membranes containing transmembrane peptides. Soft Matter. , (2021).
  96. Yu, J., et al. Structure and dynamics of lipid membranes interacting with antivirulence end-phosphorylated polyethylene glycol block copolymers. Soft Matter. 16 (4), 983-989 (2020).
  97. Stingaciu, L. -. R., et al. Revealing the dynamics of thylakoid membranes in living cyanobacterial cells. Scientific Reports. 6 (1), 19627 (2016).
  98. Stingaciu, L. -. R., O’Neill, H. M., Liberton, M., Pakrasi, H. B., Urban, V. S. Influence of chemically disrupted photosynthesis on cyanobacterial thylakoid dynamics in synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 9 (1), 5711 (2019).
  99. Miller, I. R. Energetics of fluctuation in lipid bilayer thickness. Biophysical Journal. 45 (3), 643-644 (1984).
  100. Nagao, M. Observation of local thickness fluctuations in surfactant membranes using neutron spin echo. Physical Review E. 80 (3), 031606 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (171), e62396, doi:10.3791/62396 (2021).

View Video