Summary
Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie sequencing (ChIP-seq) is een krachtige en veel gebruikte moleculaire techniek voor het in kaart brengen van hele genoomlocaties van transcriptiefactoren (TF's), chromatineregulatoren en histonmodificaties, evenals het detecteren van volledige genomen voor het blootleggen van TF-bindingspatronen en histon posttranslatiele modificaties. Chromatinemodificerende activiteiten, zoals histonmethylatie, worden vaak gerekruteerd voor specifieke genregulerende sequenties, waardoor gelokaliseerde veranderingen in chromatinestructuren ontstaan en resulteren in specifieke transcriptionele effecten. De rijstexplosie is een verwoestende schimmelziekte op rijst over de hele wereld en is een modelsysteem voor het bestuderen van schimmel-plantinteractie. De moleculaire mechanismen in hoe de histonmodificaties hun virulentiegenen in Magnaporthe oryzae reguleren, blijven echter ongrijpbaar. Meer onderzoekers moeten ChIP-seq gebruiken om te bestuderen hoe histon epigenetische modificatie hun doelgenen reguleert. ChIP-seq wordt ook veel gebruikt om de interactie tussen eiwit en DNA in dieren en planten te bestuderen, maar het wordt minder gebruikt op het gebied van plantenpathologie en is niet goed ontwikkeld. In dit artikel beschrijven we het experimentele proces en de werkwijze van ChIP-seq om de genoombrede verdeling van histonmethylatie (zoals H3K4me3) te identificeren die bindt aan de functionele doelgenen in M. oryzae. Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.
Introduction
Epigenetica is een tak van genetisch onderzoek die verwijst naar de erfelijke verandering van genexpressie zonder de nucleotidesequentie van genen te veranderen. Een toenemend aantal studies heeft aangetoond dat epigenetische regulatie een belangrijke rol speelt bij de groei en ontwikkeling van eukaryote cellen, waaronder chromatine dat genexpressie reguleert en beïnvloedt door het dynamische proces van vouwen en assembleren in structuren van hogere orde1,2. Chromatineremodellering en covalente histonmodificatie beïnvloeden en reguleren de functie en structuur van chromatine door de variatie van chromatinepolymeren, waardoor de functie van het reguleren van genexpressie3,4,5,6wordt bereikt. Posttranslatiele modificaties van histon omvatten acetylering, fosforylering, methylatie, monoubiquitinatie, sumylering en ADP ribosylatie7,8,9. Histon H3K4-methylatie, met name trimethylatie, is in kaart gebracht op transcriptiestartplaatsen waar het wordt geassocieerd met transcriptiereplicatie, recombinatie, reparatie en RNA-verwerking in eukaryoten10,11.
ChIP-seq-technologie werd geïntroduceerd in 2007 en is de experimentele standaard geworden voor de genoombrede analyse van transcriptionele regulatie en epigenetische mechanismen12,13. Deze methode is geschikt op genoombrede schaal en voor het verkrijgen van histon- of transcriptiefactorinteractie-informatie, inclusief DNA-segmenten van DNA-bindende eiwitten. Alle DNA-sequenties die zijn gekoppeld aan interessante eiwitten, zullen samen neerslaan als onderdeel van het chromatinecomplex. Sequencingtechnieken van de nieuwe generatie worden ook gebruikt om 36-100 bp DNA te sequencen, die vervolgens worden gematcht met het overeenkomstige doelgenoom.
In fytopathogene schimmels is onlangs onderzoek begonnen om te bestuderen hoe histonmethylatiemodificaties hun doelgenen reguleren in het proces van pathogeniciteit. Sommige eerdere studies bewezen dat de regulatie van histonmethylase-gerelateerde genen voornamelijk wordt weerspiegeld in gen-uitschakeling en katalysering van de productie van secundaire metabolieten (SM). MoSet1 is de H3K4 methylase in M. oryzae. Knock-out van dit gen resulteert in de volledige deletie van H3K4me3 modificatie14. Vergeleken met de wild-type stam, de expressie van het gen MoCEL7C in de mutant wordt geremd in de CMC-geïnduceerde toestand en in de niet-geïnduceerde toestand (glucose of cellobiose), de expressie van MoCEL7C verhoogd15. In Fusarium graminearumkan KMT6 de methylatiemodificatie van H3K27me3 katalyseren, de normale ontwikkeling van schimmels reguleren en helpen bij het reguleren van het "cryptische genoom" dat het SM-gencluster16,17,18,19bevat. In 2013 meldde Connolly dat H3K9- en H3K27-methylatie het pathogene proces van schimmels reguleert via secundaire metabolieten en effectorfactoren die de remming van doelgenen reguleren20. In Aspergillusis de modificatie van histonen H3K4me2 en H3K4me3 gerelateerd aan genactivering en speelt een belangrijke rol bij het beheersen van de chromatineniveauregulatie van SM-genclusters21. In M. oryzaeis Tig1 (homoloog aan Tig1 bij gist en zoogdieren) een HADC (histon deacetylase)22. Knock-out van het Tig1-gen leidt tot het volledige verlies van pathogeniciteit en sporenproductievermogen in de nulmutant. Het is gevoeliger voor een peroxygeenomgeving, die geen infectieuze schimmeldraden kan produceren22.
De rijstexplosie veroorzaakt door M. oryzae. is een van de ernstigste rijstziekten in de meeste rijstteeltgebieden ter wereld19. Vanwege het representatieve infectieproces is M. oryzae vergelijkbaar met het infectieproces van veel belangrijke pathogene schimmels. Omdat het gemakkelijk moleculair genetische operaties kan uitvoeren, is de schimmel een modelorganisme geworden voor het bestuderen van schimmel-plantinteracties23. Het blokkeren van elke stap van het infectieproces van M. oryzae kan leiden tot een mislukte infectie. De morfologische veranderingen tijdens het infectieproces worden strikt gereguleerd door de gehele genoomfunctie en gentranscriptie. Onder hen spelen epigenetische modificaties zoals histonmethylatie een essentiële rol in de transcriptionele regulatie van functionele genen24,25. Tot nu toe zijn er echter weinig studies gedaan naar het moleculaire mechanisme van epigenetische modificaties zoals histonmethylatie en histonacetylering in de transcriptie van pathogenesegenen in M. oryzae. Daarom zal de verdere ontwikkeling van het epigenetische regulatiemechanisme van de rijststraalschimmel, terwijl onderzoek wordt gedaan naar het upstream- en downstream-regulerende netwerk van deze pathogene gerelateerde genen, helpen bij het ontwikkelen van strategieën voor het voorkomen en beheersen van rijststralen.
Met de ontwikkeling van functionele genomica zoals ChIP-seq, vooral in de epigenetica, heeft deze high-throughput data-acquisitiemethode het onderzoek naar chromosomen versneld. Met behulp van de ChIP-seq experimentele technologie kan de genoombrede verdeling van histonmethylatie (zoals H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae en andere filamenteuze schimmels worden geïdentificeerd. Daarom kan deze methode helpen bij het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hoe epigenetische modificaties hun kandidaat-doelgenen reguleren tijdens schimmelpathogenese in plantenpathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van protoplasten van M. oryzae
- Bereid de havermout-tomatenagar (OTA).
- Weeg 30-50 g havermout en kook het gedurende 20 minuten in 800 ml water (ddH2O). Filtreer door twee lagen gaas en neem het filtraat.
- Pluk rijpe tomaten en schil ze. Pers het sap uit en filter door twee lagen gaas om 150 ml van het gefilterde sap te verzamelen.
- Meng al het tomatensap en het bereide haverfitraat grondig en voeg ddH2O toe tot 1000 ml.
- Voeg 250 ml van de OTA en 2,5 g agarpoeder toe aan een erlenmeyer van 500 ml en autoclaaf gedurende 20 minuten. Bewaren bij 25 °C.
- Giet 25 ml van de geautoclaveerde OTA in een glazen petrischaaltje van 5 cm x 5 cm. Bereid in totaal 10 van deze petrischaaltjes. Nadat de OTA op de petrischaaltjes is gestold, bewaar je de schalen ondersteboven bij 25 °C.
- Gebruik een gesteriliseerde tandenstoker om een klein stukje mycelium uit M. oryzae (de wild-type soort P131, knock-out stammen Δmobre2, Δmospp1 en Δmoswd2) uit te graven en plaats ze op de bereide OTA-gerechten. Kweek ze gedurende 4-6 dagen bij 28 °C onder lichtomstandigheden.
OPMERKING: Draai de petrischaal ondersteboven om vervuiling te voorkomen. - Voeg 1000 μL vloeibaar Volledig Medium (CM) (0,6% gistextract, 0,3% enzymatisch caseïnehydrolysaat, 0,3% zure caseïnehydrolysaat, 1% glucose) toe aan de OTA-schotels met behulp van een pipet van 1000 μL.
OPMERKING: De schimmeldraden groeiden op de OTA-gerechten gedurende 4-6 dagen. - Schraap de mycelia van de wild-type stam en knock-out stam met een inentingslus.
- Verzamel het mycelia-vuil en breng ze over in 250 ml vloeibaar Complete Medium (CM).
- Kweek het schimmelafval in een driehoekige kolf bij 28 °C gedurende 36 uur met schudden bij 150 tpm.
- Gebruik een trechter om de schimmeldraden te filteren en te verzamelen.
- Was de schimmeldraden met 500 ml 0,7 M NaCl-oplossing.
- Verzamel het schimmelmycelium en weeg het.
OPMERKING: Het mycelium hoeft niet te worden gedroogd voordat het wordt gewogen. - Voeg ~1 ml lysis-enzympermeatieoplossing toe per 1 g van het schimmelmycelium.
- Bereid de 20 mg/ml lysis-enzympermeatieoplossing door het lysis-enzym van Trichoderma harzianum op te lossen in 0,7 M NaCl.
- Plaats de schimmeldraden om 3-4 uur bij 28 °C te liggen met schudden bij 150 tpm.
- Was de gelyseerde schimmeldraden met 50 ml 0,7 M NaCl-oplossing.
- Verzamel de protoplasten en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.
- Gooi na het centrifugeren het bovennatuurlijk voorzichtig weg. Resuspend de protoplasten in 20 ml van 0,7 M NaCI-buffer bij 4 °C.
2. In vivo crosslinking en ultrasoonapparaat
- Voeg 55 μL 37% formaldehyde (voeg formaldehyde druppel voor druppel toe tot de uiteindelijke concentratie 1%) is aan 2 ml NaCI-buffer met protoplast voor crosslinking.
- Incubeer de protoplasten bij 25 °C gedurende 10 min.
- Voeg 20 μL 10x glycine toe aan elke buis om de niet-gereageerde formaldehyde te dempen.
- Wervel om te mengen en incubeer bij 25 °C gedurende 5 min.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.
- Gooi na het centrifugeren het bovennatuurlijk voorzichtig weg. Resuspend de pellet in 1 ml 0,7 M NaCI-oplossing.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g en 4 °C.
- Gooi na het centrifugeren het bovennatuurlijk voorzichtig weg. Resuspend de pellet in 750 μL RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholieaat, 0,1% SDS en proteaseremmers).
- Voeg 37,5 μL 20x proteaseremmer toe.
- Breng de protoplasten van de vorige stap over naar een centrifugebuis van 1,5 ml.
- Voer ultrasoonapparaat (25% W, uitgang 3 s, stop 5 s, 4 °C) onmiddellijk uit met een sonicator gedurende ongeveer 10 minuten. Het doel van deze stap is om het vertwijfde lysaat gedurende een bepaalde periode te soniceren om de beste omstandigheden te bepalen.
OPMERKING: Het lysaat kan in deze stap worden ingevroren bij -80 °C. - Als de optimale omstandigheden voor ultrasoonapparaat al zijn bepaald, gaat u verder met de volgende stap.
- Verwijder indien gewenst 5 μL protoplasten voor agarosegelanalyse (ongehoord DNA).
- Schuif het chromatine door ultrasoonapparaat met een ultrasone homogenisator gedurende 8 minuten (25% W, uitgang 3 s, stop 5 s, 4 °C).
- Nadat het monster ultrasoon is gebroken, neemt u een deel van het monster als "invoer". De invoer voert het ChIP-experiment niet uit en bevat al het DNA en eiwit dat vrijkomt nadat het monster is gesonificeerd.
- Voer na ultrasoonapparaat een 1% agarose gel-elektroforese uit om de lengte van de DNA-fragmenten te analyseren.
OPMERKING: De agarose gel elektroforese resultaten tonen aan dat de lengte van het DNA-fragment 200-500 bp is(figuur 4). - Plaats de gesonificeerde buis op ijs om eiwitafbraak te voorkomen.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en 4 °C.
- Breng na het centrifugeren het gecentrifugeerde supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze bij -80 °C voor later gebruik. De chromatineoplossing die in deze stap wordt verkregen, kan worden gebruikt voor latere IP.
- Voordat u het IP-experiment uitvoert, verdunt u elk chromatinemonster tot een verhouding van 1:10 met 1x RIPA-buffer (voeg bijvoorbeeld 10 μL chromatinemonster toe aan 1 μL 1×RIPA-buffer).
3. IP van verknoopt eiwit/DNA
- Pipetteer 50 μL superparamagnetische eiwitparels in een centrifugebuis van 2 ml. Plaats de buizen op een magnetische standaard. Laat de magnetische kralen neerslaan. Verwijder het supernatant.
- Voeg 1 ml 1x RIPA-buffer (voorgekoeld op ijs) toe aan de buis en was driemaal superparamagnetische eiwitparels. Plaats na de was de buizen op een magnetische standaard en verwijder het supernatant. Voeg 100 μL 1x RIPA-buffer toe aan elke buis.
- Voeg 300 μL chormatinemonster (2 x 107 cellen werden gebruikt), 100 μL superparamagnetische eiwitparels en 4 μL H3K4me3-antilichaam toe aan de buis.
- Gebruik monsters met Muis IgG als negatief besturingselement.
OPMERKING: Muis IgG gebruikt in dit protocol bevat 0,01 M fosfaatbuffer en 0,15 M NaCl, en blijft bevroren onder 20 °C (zie Tabel van materialen). - Plaats de monsters na goed mengen op een roterende shaker en incubeer een nacht bij 4 °C, 30 x g.
OPMERKING: Het kan mogelijk zijn om de incubatietijd van de immunoprecipitatie (IP) te verkorten. De incubatietijd is afhankelijk van verschillende factoren (bijv. het antilichaam, gendoel, celtype, enz.) en moet empirisch worden getest.
4. Verzamelen en spoelen van de IP-producten
- Pellet de superparamagnetische eiwitkorrels door ze op een magnetische standaard te plaatsen. Aspirateer en gooi het supernatant weg.
- Was het superparamagnetische eiwitkraal-antilichaam/chromatinecomplex door de kralen opnieuw op te suspenderen in 1 ml ripa-buffer.
- Spoel de tube gedurende 5 minuten af op een roterende shaker en verwijder het supernatant bij 30 x g.
- Voeg 1 ml wasbuffer met een laag zoutafweercomplex toe (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 en 150 mM NaCl).
- Spoel de tube gedurende 5 minuten af op een roterende shaker en verwijder het supernatant.
- Voeg 1 ml wasbuffer met een hoog zoutgehalte (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 en 500 mM NaCl) toe aan de centrifugebuis.
- Plaats de tube gedurende 5 minuten op een roterende shaker en verwijder het supernatant.
- Spoel met 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholzuur, 1 mM EDTA en 10 mM Tris-HCl pH 8,1) in de centrifugebuis.
- Plaats de tube gedurende 5 minuten op een roterende shaker en verwijder het supernatant.
- Spoel de reageerbuis opnieuw af met 1 ml 0,25 M LiCI-buffer, verwijder het supernatant met een pipet en gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 ml TE-buffer toe (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
- Plaats de tube op een roterende shaker gedurende 5 min bij 30 x g.
- Was de tube opnieuw met 1 ml TE-buffer en verwijder het supernatant met een pipet.
- Verzamel de kralen.
5. Elutie van eiwit/DNA-complexen
- Bereid de elutiebuffer (10 μL van 20% SDS, 20 μL van 1 M NaHCO3,170 μL steriel gedestilleerd H2O) voor alle IP- en ingangsbuizen.
- Voeg 100 μL elutiebuffer toe aan elke centrifugebuis.
- Elutie bij 65 °C gedurende 15 min.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g en 4 °C en vang het supernatant op in nieuwe centrifugebuizen.
- Herhaal stap 5.2 - 5.4 en combineer de eluaten. Voeg 190 μL elutiebuffer toe aan de 10 μL van het input-DNA. (totaal volume = 200 μL).
6. Reverse crosslinking van eiwit/DNA-complexen
- Voeg 8 μL van 5 M NaCl toe aan alle buisjes en incubeer bij 65 °C gedurende 4-5 uur of 's nachts om de DNA-eiwit crosslinks om te keren.
OPMERKING: Bewaar de monsters na deze stap bij -20 °C en ga indien nodig de volgende dag verder met het protocol. - Voeg 1 μL RNase A toe en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
- Voeg 4 μL Proteïnase K (opgelost in H2O bij 20 mg/ml en bewaard bij -20 °C) toe aan elke buis en incubeer bij 45 °C gedurende 1-2 uur.
7. Zuivering en herstel van DNA
- Voeg 550 μL fenol/chloroform/isoamylalcoholmengsel (verhouding van 25:24:1) toe aan de centrifugebuis.
- Vortex het mengsel grondig gedurende 1 min.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 x g en aspirateer het supernatant.
- Breng het geëxtraheerde supernatant uit de vorige stap over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaatoplossing, 2,5 volumes absolute ethanol en 3 μL glycogeen (20 mg/ml) toe aan de buis.
- Plaats het monster 's nachts in een koelkast bij -20 °C voor neerslag.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 x g en 4 °C.
- Gooi het supernatant na het centrifugeren weg. Was de pellet drie keer met 1 ml 75% ethanol (moet vers worden bereid) op 10.000 x g.
- Leg het gewassen neerslag op een schone bank om de alcohol te laten drogen.
- Voeg 50 μL steriel gedeïeniseerd H2O toe om het neerslag voldoende op te lossen.
- Ligate de sequencing-adapter naar het DNA-fragment en gebruik een high-throughput sequencingplatform om het DNA te sequencen.
8. DNA-reparatie en Solexa bibliotheekconstructie
- Repareer de DNA-uiteinden om stomp DNA te genereren met behulp van een DNA-eindreparatiekit (1-34 μL DNA, 5 μL 10x eindherstelbuffer, 5 μL van 2,5 mM elk dNTP, 5 μL van 10 mM ATP, 1 μL eindreparatie-enzymmix en H2O om het reactievolume aan te passen tot 49 μL).
- Gebruik een PCR-zuiveringskit of fenol: chloroformextractie om het DNA te zuiveren. Eluteer of resuspend het DNA in 30 μL van 1x TE pH 7,4.
- Voeg "A" toe aan 3' uiteinden (30 μL DNA uit stap 2, 2 μL H2O, 5 μL 10x Taq buffer, 10 μL 1 mM dATP en 3 μL Taq DNA polymerase). Voeg de reagentia toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 ml, meng goed en reageer gedurende 10 minuten in een PCR-machine bij 72 °C.
- Voer linkerligatie uit door 10 μL DNA, 9,9 μL H2O, 2,5 μL T4 DNA-ligasebuffer, 0,1 μL adapter oligomix en 2,5 μL T4 DNA-ligase te mengen. Voeg de reagentia toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 ml en meng goed. Incubeer ze bij 16 °C gedurende 4 uur.
- Zuiver het DNA met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant. Eluen met 20-25 μL elutiebuffer.
- Voordat de DNA-bibliotheek wordt vastgesteld, identificeert u de concentratie van het gezuiverde DNA om het gebruik ervan voor de daaropvolgende sequencing-experimenten te bevestigen.
- Detecteer de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer. Nadat het monster op ijs is gesmolten, mengt u het grondig en centrifugeert u gedurende 30 s bij 1000 x g en 4 °C. Neem vervolgens een geschikte hoeveelheid monster en meet het in een fluorometer met een golflengte van 260 nm.
- Plaats DNA-monsters met gekwalificeerde kwaliteit en concentratie op het Illumina-sequencingplatform voor sequencing.
- Voordat u gaat sequentiëren, versterkt u het DNA met behulp van PCR-primers, PE1.0 en PE2.0 en 2x high-fidelity mastermix (10,5 μL DNA, 12,5 μL 2x high fidelity mastermix, 1 μL PCR-primer PE1.0 en 1 μL PCR-primer PE2.0). Voeg de reagentia toe aan een PCR-centrifugebuis van 0,2 ml en meng goed.
- Voer de PCR-reactie uit in de PCR-machine: 95 °C predenaturatie gedurende 2 minuten; vervolgens 35 cycli van 95 °C denaturatie gedurende 10 s, gloeien bij 60 °C gedurende 15 s, verlenging bij 72 °C gedurende 5 s; een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. Incubeer ten slotte de reactie bij 4 °C.
- Gebruik het DNA voor clustergeneratie en voer sequencing-by-synthesis uit op een Illumina Hiseq 2000.
OPMERKING: In dit protocol werden Illumina-stroomcellen gebruikt voor het genereren van clusters. De sequencing-by-synthesis werd uitgevoerd op een Illumina Genome Analyzer volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het volledige stroomschema van de ChIP-seq methode is weergegeven in figuur 1. ChIP-seq-experimenten werden uitgevoerd met behulp van antilichamen tegen H3K4me3 in de wild-type stam P131 en drie nulmutante stammen die verstoken waren van mobre2, mospp1en moswd2 gen om het hele genoombrede profiel van histon H3K4me3 distributie in M. oryzaete verifiëren. De protoplasten van de wildtype stam, Δmobre2, Δmospp1en Δmoswd2, werden bereid en gesonificeerd bij 25% W, output 3 s, stop 5 s, bij 4 °C. Verder werd het chromatine immunopurificeerd met H3K4me3-antilichaam en Dynabeads-eiwit A /G. Vervolgens werden DNA-fragmenten geëxtraheerd met behulp van de fenol-chloroform-methode voor het construeren van een sequencingbibliotheek en gesequenced met enkele uiteinden op een high-throughput sequencingplatform.
De representatieve resultaten van de stammen wildtype Δmobre2,Δmospp1en Δmoswd2 met de ChIP-seq-methode met behulp van het H3K4me3-antilichaam zijn weergegeven in figuur 2. De H3K4me3-signalen van de mutanten Δmobre2, Δmospp1en Δmoswd2 deletie waren significant afgenomen in de functionele doelgebieden. Zoals te zien is in figuur 2,werden enkele geselecteerde kandidaat-doelgenen, waaronder MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 en MGG_04235, in kaart gebracht voor H3K4me3-distributie. Vergeleken met de wildtype stam P131 waren de signalen van verrijkte H3K4me3-ChIP-seq-reads in de Δmobre2, Δmospp1en Δmoswd2 deletiemutanten grotendeels afgenomen (Figuur 2)26. Deze resultaten suggereren dat de H3K4me3-modificatie een belangrijke rol speelt bij het reguleren van doelgenexpressie in M. oryzae.
Figuur 1. Het stroomschema van de ChIP-seq methode in M. oryzae. (A) Het genomische DNA van M. oryzae wasverknoopt met 1% formaldehyde. (B) Vervolgens werden Lysed blast schimmelcellen, gebroken DNA, vrij DNA en histonbindend DNA verkregen. (C) DNA-fragmenten gebonden aan histonen en werden geëxtraheerd door specifieke binding aan het H3K4me3-antilichaam. (D) Door middel van reverse crosslinking verkreeg gezuiverd DNA vervolgens DNA-fragmenten gemodificeerd door H3K4me3-histonen. (E-F) DNA-fragmenten werden gesequenced, de sequencingresultaten werden vergeleken en sequenties werden geïdentificeerd in de M. oryzae DNA-groep. (G) Specifieke genen en loci van H3K4me3-histonen in M. oryzae werden teruggevonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De mutanten Δmobre2,Δmospp1en Δmoswd2 deletie daalden significant H3K4me3-profielen in hun doelgebieden. De H3K4me3-ChIP-seq verdeling van verrijkte pieken rond de coderende regio's van overlappende genen in Δmobre2, Δmospp1en Δmoswd2 deletie mutanten zijn afgetakeerd in vergelijking met de wild-type stam in de MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 en MGG_04235 genen26. Het getal in WT (input) gelabeld als [0-2074] betekent de resultaten van ChIP in het bereik van genomisch DNA [0-2074]. [0-2074] verwijst naar 0-2074bp van chromosoom 6.De figuur toont een willekeurige selectie van de sequencingresultaten, die alleen de DNA-verdeling op chromosoom 6 vertegenwoordigt. De volledige sequencing resultaten zijn ingediend bij Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ toetreding 649321) 26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Serienummer | Voorbeeldnaam | Serienummer van het voorbeeld | Aantal buizen | Totaal (μg) | Fragmentverdeling | Databasetype | Opmerkingen | ||||
| 1 | invoer | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | De hoofdpiek ligt onder de 100bp, maar er is DNA-verdeling tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment is te klein | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Invoer | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | De hoofdpiek ligt onder de 100bp, maar er is DNA-verdeling tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment is te klein | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | ingang Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | De hoofdpiek ligt onder de 100bp, maar er is DNA-verdeling tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment is te klein | ||||
| 4 | ingang Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | De hoofdpiek ligt onder de 100bp, maar er is DNA-verdeling tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment is te klein | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | De belangrijkste piek ligt tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | De belangrijkste piek ligt tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | De belangrijkste piek ligt tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | De belangrijkste piek ligt tussen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Tabel 1. De totale hoeveelheid DNA in dit experiment. De totale hoeveelheid input P131(2) is 2,7948 μg, de totale hoeveelheid Δmobre2(3) (input) is 2,4748 μg, de totale hoeveelheid Δmospp1(4) (input) is 3,22 μg, de totale hoeveelheid Δmoswd2 (5) (input) is 3,97 μg en de totale hoeveelheid P131(2) is 0,0735 μg, de totale hoeveelheid Δmobre2(3) is 0,0491μg, de totale hoeveelheid Δmospp1(4) is 0,0288 μg, de totale hoeveelheid Δmoswd2(5) is 0,0527 μg.
Figuur 3. Elektroforese detectie van DNA na echografie. Na ultrasone ultrasoonapparaat wordt het DNA onderworpen aan een 1% agarose-gelexperiment om de lengte van DNA-fragmenten te analyseren. De gesonificeerde DNA-fragmentlengte is van 200-500 bp, en deze DNA-fragmenten kunnen worden gebruikt voor de volgende stappen van ChIP-seq. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Bioanalyzer spoor van Input en ChIP monsters. De figuur toont de fragmentverdeling van elk monster, waarbij de abscissa de fragmentgrootte vertegenwoordigt en de ordinate de piekgrootte. De monsters die op de bioanalyzer lopen zijn ingang P131(2), Δmobre2(3) (ingang), Δmospp1(4) (ingang), Δmoswd2(5) (ingang), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Onder hen laat de verdeling van input P131(2), Δmobre2(3) (input), Δmospp1(4) (input), Δmoswd2(5) (input) zien dat de hoofdpiek lager is dan 100 bp, maar er is DNA-verdeling bij 100-500 bp. De werkelijke verdeling van P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) en Δmoswd2(5) ligt tussen 100-500 bp als hoofdpiek26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onlangs is ChIP-seq een veelgebruikte genomische analysemethode geworden voor het bepalen van de bindingsplaatsen van TFs of verrijkingsplaatsen die zijn gewijzigd door specifieke histonen. Vergeleken met eerdere ChIP-seq-technologie is de nieuwe ChIP-seq-technologie zeer gevoelig en flexibel. Resultaten worden geleverd in hoge resolutie zonder negatieve effecten, zoals het ruissignaal veroorzaakt door de niet-specifieke hybridisatie van nucleïnezuren. Hoewel dit een veel voorkomende genexpressieanalyse is, zijn veel computationele methoden gevalideerd en de complexiteit van ChIP-seq-gegevens in termen van ruis en variabiliteit maakt dit probleem bijzonder moeilijk voor ChIP-seq om te overwinnen. Op het gebied van data-analyse is het beheren en analyseren van de grote hoeveelheid gegevens die door ChIP-seq-experimenten wordt gegenereerd ook een uitdaging die nog niet adequaat moet worden aangepakt.
Er zijn verschillende belangrijke stappen in het ChIP-seq experiment. Allereerst is de voorbereiding van de protoplasten erg belangrijk. Het is noodzakelijk om de instortingstijd te beheersen, zodat protoplasten van hoge kwaliteit kunnen worden verzameld. Echografie is ook erg belangrijk, de echotijd moet worden gecontroleerd, te lang of te kort zal niet werken. Ten tweede moet de hoeveelheid toegevoegd antilichaam voldoende zijn om de verrijking van meer DNA-fragmenten die aan het eiwit binden te vergemakkelijken. Bij het verifiëren van de kwaliteit en kwantiteit van DNA dat in het ChIP-seq-experiment werd neergeslagen, werd Qubit Fluorometer gebruikt. Agilent 2100 werd gebruikt om de massaconcentratie en fragmentverdeling van DNA te detecteren, wat een basis biedt voor de vraag of het monster kan worden gebruikt voor latere bibliotheekinrichtings- en sequencing-experimenten.
Over het algemeen verbetert dit protocol het begrip van de hele genoombrede verdeling van epigenetische modificaties die pathogene genen reguleren tijdens pathogene infectie. Deze methode zal bijdragen aan het identificeren van moleculaire mechanismen van epigenetische modificaties en het identificeren van nieuwe doelgenen tijdens de ontwikkeling van schimmels en pathogene geïnduceerde pathogenese in M. oryzae en andere filamenteuze schimmels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), het Special Scientific Research Project van Beijing Agriculture University (YQ201603), het Scientific Project van Beijing Educational Committee (KM201610020005), het High-level scientific research cultivation project van BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
