Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
Abstract
רצף immunoprecipitation Chromatin (ChIP-seq) היא טכניקה מולקולרית רבת עוצמה ונפוצה למיפוי מיקומי גנום שלמים של גורמי שעתוק (TFs), מווסתי כרומטין ושינויי היסטון, כמו גם זיהוי גנומים שלמים לחשיפת דפוסי כריכה TF ושינויים פוסט-טרנסלציה של histone. פעילויות לשינוי כרומטין, כגון מתילציה histone, מגויסים לעתים קרובות רצפים רגולטוריים גנים ספציפיים, גרימת שינויים מקומיים מבני כרומטין וכתוצאה מכך אפקטים שעתוק ספציפיים. פיצוץ האורז הוא מחלה פטרייתית הרסנית על אורז ברחבי העולם והוא מערכת מודל לחקר אינטראקציה פטרייה-צמח. עם זאת, המנגנונים המולקולריים באופן שבו השינויים histone לווסת הגנים virulence שלהם Magnaporthe oryzae להישאר חמקמק. חוקרים נוספים צריכים להשתמש ChIP-seq כדי לחקור כיצד שינוי אפיגנטי histone מווסת את הגנים היעד שלהם. ChIP-seq נמצא גם בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון ו- DNA בבעלי חיים וצמחים, אבל זה פחות בשימוש בתחום הפתולוגיה הצמחית ולא פותח היטב. במאמר זה, אנו מתארים את התהליך הניסיוני ואת שיטת הפעולה של ChIP-seq כדי לזהות את ההתפלגות הגנום כולו של מתילציה histone (כגון H3K4me3) שנקשרת לגנים היעד הפונקציונלי ב M. oryzae. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
Introduction
אפיגנטיקה היא ענף של מחקר גנטי המתייחס לשינוי המשתי של ביטוי הגנים מבלי לשנות את רצף הנוקלאוטידים של הגנים. מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי רגולציה אפיגנטית ממלאת תפקיד חשוב בצמיחה ובהתפתחות של תאים אאוקריוטים, כולל כרומטין המסדיר ומשפיע על ביטוי הגנים באמצעות התהליך הדינמי של קיפול והרכבה למבנים מסדר גבוה יותר1,2. שיפוץ כרומטין ושינוי histone קוולנטי משפיעים ומווסתים את התפקוד והמבנה של הכרומטין באמצעות וריאציה של פולימרים כרומטין, ובכך להשיג את הפונקציה של ויסות ביטויגנים 3,4,5,6. שינויים פוסט-יבשתיים של היסטון כוללים אצטילציה, זרחן, מתילציה, מונוביקוויטינציה, סומוילציה, ריבוזילציה ADP7,8,9. Histone H3K4 מתילציה, במיוחד טרימתילציה, מופתה לאתרי התחלת תמלול שבהם היא קשורה לשכפול תמלול, רקומבינציה, תיקון ועיבוד RNA באאוקריוטים10,11.
טכנולוגיית ChIP-seq הוצגה בשנת 2007 והפכה לסטנדרט הניסיוני לניתוח כלל הגנום של רגולציה תמלולית ומנגנונים אפיגנטיים12,13. שיטה זו מתאימה בקנה מידה רחב הגנום ולקבלת מידע אינטראקציה histone או גורם שעתוק, כולל מקטעי DNA של חלבונים מחייב DNA. כל רצפי דנ"א המקושרים לחלבונים מעניינים יעברו חלק מתסביך הכרומטין. טכניקות רצף מהדור החדש משמשות גם לרצף של 36-100 bp של DNA, אשר מותאמות לאחר מכן לגנום היעד המתאים.
בפטריות פיטופתיות, מחקרים החלו לאחרונה לחקור כיצד שינויים מתילציה histone לווסת את הגנים היעד שלהם בתהליך של פתוגניות. כמה מחקרים קודמים הוכיחו כי הרגולציה של גנים הקשורים histone מתילאז באה לידי ביטוי בעיקר השתקת גנים וזרז את הייצור של מטבוליטים משניים (SM). MoSet1 הוא מתילאז H3K4 ב M. oryzae. הסתרה של גן זה גורמת למחיקה מלאה של שינוי H3K4me314. בהשוואה לזן מסוג בר, הביטוי של הגן MoCEL7C במוטנט מעוכב במצב המושרה CMC ובמצב שאינו מושרה (גלוקוז או תאית), הביטוי של MoCEL7C גדל15. ב פוסאריום גרמינדרום, KMT6 יכול לזרז את שינוי המתילציה של H3K27me3, לווסת את ההתפתחות הרגילה של פטריות, ולעזור לווסת את "הגנום המסתורי" המכיל את אשכול הגנים SM16,17,18,19. בשנת 2013, קונולי דיווח כי H3K9 ו H3K27 מתילציה מסדיר את התהליך הפתוגניים של פטריות באמצעות מטבוליטים משניים וגורמי אפקט המסדירים את עיכוב של גנים היעד20. באספרגילוס, השינוי של היסטיונים H3K4me2 ו- H3K4me3 קשור להפעלת גנים וממלא תפקיד חשוב בשליטה על רמת הכרומטין רגולציה של אשכולות גנים SM21. ב M. oryzae, טיג1 (הומולוג ל-Tig1 בשמרים ויונקים) הוא ה-HADC (histone deacetylase)22. נוקאאוט של הגן Tig1 מוביל לאובדן מוחלט של פתוגניות ויכולת ייצור נבגים במוטנט האפס. זה רגיש יותר לסביבת peroxygen, אשר לא יכול לייצר hyphae זיהומי22.
פיצוץ האורז שנגרם על ידי M. oryzae. הוא אחת ממחלות האורז החמורות ביותר ברוב האזורים גידול אורז בעולם19. בשל תהליך ההדבקה הייצוגי שלה, M. oryzae דומה לתהליך ההדבקה של פטריות פתוגניות חשובות רבות. כפי שהוא יכול בקלות לבצע פעולות גנטיות מולקולריות, הפטרייה הפכה אורגניזם מודל לחקר אינטראקציות פטריות-צמח23. חסימת כל שלב של תהליך ההדבקה של M. oryzae עלולה לגרום לזיהום לא מוצלח. השינויים המורפולוגיים במהלך תהליך ההדבקה מוסדרים בקפדנות על ידי כל פונקציית הגנום ותעתיק הגנים. ביניהם, שינויים אפיגנטיים כגון מתיליציה histone לשחק תפקיד חיוני ברגולציה שעתוק של גנים פונקציונליים24,25. עם זאת, עד כה, מחקרים מעטים נעשו על המנגנון המולקולרי של שינויים אפיגנטיים כגון מתילציה histone ואצטילציה histone בתעתיק של פתוגנזה גנים M. oryzae. לכן, פיתוח נוסף של מנגנון הרגולציה האפיגנטית של פטריית פיצוץ האורז תוך כדי מחקר ברשת הרגולטורית במעלה ובמורד הזרם של הגנים הקשורים לפתוגניים אלה יסייע לפתח אסטרטגיות מניעה ובקרה של פיצוץ אורז.
עם התפתחות הגנומיקה התפקודית כגון ChIP-seq, במיוחד באפיגנטיקה, שיטת רכישת נתונים בעלת תפוקה גבוהה זו האיצה את המחקר על כרומוזומים. באמצעות הטכנולוגיה הניסיונית ChIP-seq, ניתן לזהות את ההפצה הרחבה של מתילציה של היסטון (כגון H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) ב- M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות. לכן, שיטה זו יכולה לעזור להדגיש את המנגנונים המולקולריים שבבסיס האופן שבו שינויים אפיגנטיים מווסתים את הגנים היעד המועמד שלהם במהלך פתוגנזה פטרייתית בפתולוגיה של הצמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פרוטופלסטים ממ. אוריזה
- הכן את אגר שיבולת שועל עגבניות (OTA).
- שוקלים 30-50 גרם של שיבולת שועל ומרתיחים אותו ב 800 מ"ל של מים (ddH2O) במשך 20 דקות. מסננים דרך שתי שכבות של גזה ולוקח את הסינון.
- קוטפים עגבניות בשלות ומקלפים אותן. לסחוט את המיץ, ולסנן דרך שתי שכבות של גזה כדי לאסוף 150 מ"ל של מיץ מסונן.
- מערבבים את כל מיץ העגבניות ואת סינון שיבולת השועל המוכן ביסודיות ומוסיפים ddH2O עד 1000 מ"ל.
- הוסיפו 250 מ"ל של OTA ו-2.5 גרם אבקת אגר לבקבוק חרוט של 500 מ"ל, וקחו אוטומטית למשך 20 דקות. יש לאחסן ב-25 °C (75 °F).
- יוצקים 25 מל של OTA autoclaved לתוך 5 סמ x 5 סמ צלחת פטרי. הכינו 10 מנות פטרי אלה בסך הכל. לאחר OTA התגבש על מנות פטרי, לאחסן את הכלים הפוך ב 25 °C (70 °F).
- השתמש קיסם מעוקר כדי לחפור חתיכה קטנה של תפטיר מ M. oryzae (זן סוג בר P131, זנים נוקאאוט Δmobre2, Δmospp1, ו Δmoswd2) ומניחים אותם על מנות OTA מוכן. תרבות אותם במשך 4-6 ימים ב 28 °C (70 °F) בתנאי אור.
הערה: הפוך את צלחת הפטרי כדי למנוע זיהום. - הוסיפו 1,000 μL של נוזלים מלאים בינוניים (CM) (0.6% תמצית שמרים, 0.3% קזאין אנזימטי הידרוליזאט, 0.3% קזאין חומצי הידרוליזאט, 1% גלוקוז) למנות OTA באמצעות פיפטה של 1000 μL.
הערה: ההייפה גדל על מנות OTA במשך 4-6 ימים. - לגרד את התמצית של זן סוג פראי ומתח נוקאאוט עם לולאת חיסון.
- לאסוף את פסולת תריסים ולהעביר אותם 250 מ"ל של נוזל מלא בינוני (CM).
- לגדל את הפסולת פטרייתית בבקבוק משולש ב 28 °C (50 °F) עבור 36 שעות עם רועד ב 150 סל"ד.
- השתמש משפך כדי לסנן ולאסוף את hyphae פטרייתי.
- לשטוף את ההייפה פטרייתי עם 500 מ"ל של פתרון NaCl 0.7 M.
- לאסוף את התפטיר הפטרייתי ולשקול אותו.
הערה: אין צורך לייבש את התפטיר לפני השקילה. - הוסף ~ 1 מ"ל של תמיסת חמיצה אנזימי תמסיס לכל 1 גרם של תפטיר פטרייתי.
- הכן את פתרון 20 מ"ג/מ"ל חמיץ אנזימי תמוגה על ידי המסת אנזים תמוגה מטריכודרמה harzianum ב 0.7 M NaCl.
- מניחים את ההייפה ל- lysing ב 28 °C (75 °F) ל-3-4 שעות עם רעידות במהירות של 150 סל"ד.
- לשטוף את hyphae lysed עם 50 מ"ל של 0.7 M NaCl פתרון.
- לאסוף את protoplasts וצנטריפוגה במשך 15 דקות ב 2,000 x g ו 4 °C (70 °F).
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant בזהירות. resuspend protoplasts ב 20 מ"ל של 0.7 M NaCI חוצץ ב 4 °C (7 °F).
2. ב- vivo הצלבה ו sonication
- הוסף 55 μL של 37% פורמלדהיד (הוסף פורמלדהיד טיפה אחר טיפה עד הריכוז הסופי הוא 1%) ל 2 מ"ל של מאגר NaCI המכיל protoplast עבור crosslinking.
- לדגור את הפרוטופלסטים ב 25 °C (55 °F) ל 10 דקות.
- הוסף 20 μL של גליצין 10x לכל צינור כדי להרוות את פורמלדהיד לא נטען.
- מערבבים לערבב ודגרה ב 25 °C (5 דקות).
- צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 2,000 x g ו 4 °C (70 °F).
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant בזהירות. resuspend הכדור ב 1 מ"ל של 0.7 M פתרון NaCI.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 2,000 x g ו 4 °C (70 °F).
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant בזהירות. Resuspend הכדור ב 750 μL של חיץ RIPA(50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% SDS, ומעכבי פרוטאז).
- הוסף 37.5 μL של מעכב פרוטאז 20x.
- העבר את הפרוטופלסטים מהשלב הקודם לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.
- בצע sonication (25% W, פלט 3 s, לעצור 5 s, 4 °C ) מיד עם sonicator במשך כ 10 דקות. מטרת צעד זה היא sonicate ליסאט מקושר חוצה לתקופה של זמן כדי לקבוע את התנאים הטובים ביותר.
הערה: ניתן להקפיא את ה- lysate ב- -80 °C (70 °F) בשלב זה. - אם כבר נקבעו תנאים אופטימליים עבור sonication, המשך לשלב הבא.
- אם תרצה, להסיר 5 μL של protoplasts לניתוח ג'ל agarose (DNA unsheared).
- לגזור את הכרומטין על ידי sonication עם homogenizer קולי במשך 8 דקות (25% W, פלט 3 s, לעצור 5 s, 4 °C ).
- לאחר המדגם שבור באולטרסאונד, להוציא חלק של המדגם כמו "קלט". הקלט אינו מבצע את ניסוי ChIP ומכיל את כל ה- DNA והחלבון ששוחררו לאחר דגימת sonicated.
- לאחר sonication, להפעיל אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1% כדי לנתח את אורך שברי ה- DNA.
הערה: תוצאות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז מראות כי אורך שבר ה- DNA הוא 200-500 bp (איור 4). - מניחים את הצינור sonicated על קרח כדי למנוע השפלת חלבון.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 10,000 x g ו 4 °C (70 °F).
- לאחר צנטריפוגה, להעביר את supernatant צנטריפוגה לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל ולאחסן אותו ב -80 °C (70 °F) לשימוש מאוחר יותר. פתרון הכרומטין המתקבל בשלב זה יכול לשמש עבור IP עוקב.
- לפני ביצוע ניסוי ה- IP, לדלל כל דגימת כרומטין ליחס של 1:10 עם מאגר RIPA 1x (למשל, להוסיף 10 μL של דגימת כרומטין ל 1 μL של 1×מאגרRIPA).
3. IP של חלבון/DNA מקושרים
- פיפטה 50 μL של חרוזי חלבון סופר-פרלמגנטיים לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי. תן החרוזים המגנטיים לזרז. הסר את סופר-טבעי.
- יש להוסיף לצינור מ"ל אחד של חיץ RIPA 1x (מקורר מראש על הקרח) ולשטוף חרוזים של חלבון סופר-פרמגנטי שלוש פעמים. לאחר הכביסה, מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי ומסירים את supernatant. הוסף 100 μL של 1x RIPA חוצץ לכל צינור.
- הוסף 300 μL של דגימת כורמטין (2 x 107 תאים שימשו), 100 μL של חרוזי חלבון סופרפארמגנטי ו 4 μL של נוגדן H3K4me3 לצינור.
- השתמש בדוגמאות עם Mouse IgG כפקד השלילי.
הערה: עכבר IgG המשמש בפרוטוקול זה מכיל 0.01 M חוצץ פוספט ו 0.15 M NaCl, ויישאר קפוא מתחת 20 °C (ראה טבלת חומרים). - לאחר ערבוב טוב, מניחים את הדגימות על שייקר סיבובי ודגרה לילה ב 4 °C (50 °F), 30 x g.
הערה: ייתכן שניתן יהיה להפחית את זמן הדגירה של אימונופרציפיטציה (IP). זמן הדגירה תלוי בגורמים שונים (למשל, הנוגדן, מטרת הגנים, סוג התא וכו ') ויהיה צורך להיבדק אמפירית.
4. איסוף ושטיפה של מוצרי הקניין הרוחני
- גלם את חרוזי חלבון סופרפארמגנטי על ידי הצבתם על מעמד מגנטי. שאפו והשליכו את הסופר-טבעי.
- לשטוף את קומפלקס חרוזים חלבון סופר-פרומגנטי /כרומטין על ידי שימוש חוזר החרוזים 1 מ"ל של 1x חיץ RIPA.
- לשטוף את הצינור על שייקר סיבובי במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant ב 30 x g.
- יש להוסיף מ"ל אחד של חוצץ שטיפה קומפלקס חיסוני נמוך (0.1% SDS, 1% טריטון X-100, 2 מ"מ EDTA, 20 מ"מ טריס-HCl pH 8.1 ו-150 מ"ר NaCl).
- שוטפים את הצינור על שייקר סיבובי במשך 5 דקות ומסירים את supernatant.
- יש להוסיף מ"ל אחד של חוצץ שטיפה מורכב של מערכת החיסון (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 מ"מ EDTA, 20 מ"מ טריס-HCl pH 8.1 ו-500 מ"מ NaCl) לצינור הצנטריפוגה.
- מניחים את הצינור על שייקר סיבובי במשך 5 דקות ומסירים את supernatant.
- יש לשטוף עם 1 מ"ל LiCl (0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% חומצה דה-אוקסיכולית, 1 מ"מ EDTA ו-10 מ"מ טריס-HCl pH 8.1) בצינור הצנטריפוגה.
- מניחים את הצינור על שייקר סיבובי במשך 5 דקות ומסירים את supernatant.
- לשטוף את המבחנה שוב עם 1 מ"ל של 0.25 M LiCI חוצץ, להסיר את supernatant עם pipette, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר TE (10 מ"מ טריס-HCl pH 8.1, 1 מ"מ EDTA).
- מניחים את הצינור על שייקר סיבובי במשך 5 דקות ב 30 x g.
- לשטוף את הצינור שוב עם 1 מ"ל TE חוצץ ולהסיר את supernatant עם pipette.
- תאסוף את החרוזים.
5. אלוטציה של קומפלקסים של חלבון/דנ"א
- הכן את מאגר elution (10 μL של 20% SDS, 20 μL של 1 M NaHCO3, 170 μL של H2O מזוקק סטרילי) עבור כל IP וצינורות קלט.
- הוסף 100 μL של חוצץ elution לכל צינור צנטריפוגה.
- אלוטיון ב 65 °C (5 °F) במשך 15 דקות.
- צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-10,000 x ז' ו-4 מעלות צלזיוס, ואוספים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות חדשים.
- חזור על שלבים 5.2 - 5.4 ושלב את האלאטס. הוסף 190 μL של מאגר elution ל 10 μL של DNA הקלט. (נפח כולל = 200 μL).
6. הפוך קישור של קומפלקס חלבון / DNA
- הוסף 8 μL של 5 M NaCl לכל הצינורות ודגר ב 65 °C (65 °F) עבור 4-5 שעות או לילה כדי להפוך את הצלבות חלבון DNA.
הערה: לאחר שלב זה, לאחסן את הדגימות ב -20 °C (70 °F), ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת, במידת הצורך. - הוסף 1 μL של RNase A ודגרה במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
- יש להוסיף 4 מיקרו-אל של פרוטאינאז K (מומס ב-H2O ב-20 מ"ג/מ"ל ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס) לכל שפופרת ולדגירה ב-45 °C למשך 1-2 שעות.
7. טיהור ושחזור של DNA
- הוסף 550 μL של תערובת אלכוהול פנול / כלורופורם / איזואמיל (יחס של 25:24:1) לצינור הצנטריפוגה.
- מערבולת ביסודיות את התערובת במשך 1 דקות.
- צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 x ז' ושאפה את הסופר-נטאנט.
- העבר את supernatant שחולץ מהשלב הקודם לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל.
- הוסף 1/10 נפח של פתרון אצטט נתרן 3 מ ', 2.5 כרכים של אתנול מוחלט, ו 3 μL של גליקוגן (20 מ"ג / מ"ל) לצינור.
- מניחים את הדגימה במקרר ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה למשפך.
- צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
- השלך את סופרנט לאחר צנטריפוגה. לשטוף את הכדור שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 75% אתנול (צריך להיות מוכן טרי) ב 10,000 x g.
- מניחים את המשקעים השטופים על ספסל נקי כדי לתת לאלכוהול להתייבש.
- הוסף 50 μL של סטרילי deionized H2O כדי להמיס מספיק את המשקעים.
- ליג את מתאם הרצף לרסיס הדנ"א והשתמש בפלטפורמת ריצוף בעלת תפוקה גבוהה כדי לרצף את הדנ"א.
8. תיקון DNA ובניית ספריית סולקסה
- תקן את קצות ה- DNA כדי ליצור דנ"א קהה באמצעות ערכת תיקון קצה DNA (DNA 1-34 μL DNA, 5 μL של חיץ תיקון קצה 10x, 5 μL של 2.5 mM כל dNTP, 5 μL של 10 mM ATP, 1 μL של תערובת אנזימים לתיקון קצה, ו- H 2 O כדילהתאיםאת נפח התגובה ל 49 μL).
- השתמש בערכת טיהור PCR או פנול: מיצוי כלורופורם כדי לטהר את ה- DNA. האלגנטי או תקיף מחדש את הדנ"א ב- 30 μL של 1x TE pH 7.4.
- הוסף "A" ל- 3' קצוות (30 μL של DNA בשלב 2, 2 μL של H2O, 5 μL של 10x מאגר טאק, 10 μL של 1 mM dATP, ו 3 μL של פולימראז DNA טאק). מוסיפים את הריאגנטים לצינור צנטריפוגה PCR 0.2 מ"ל, מערבבים היטב ומגיבים במכונת PCR במהירות של 72 °C (72 °F) למשך 10 דקות.
- בצע קשירת קישור על ידי ערבוב 10 μL של DNA, 9.9 μL של H2O, 2.5 μL של חיץ ligase DNA T4, 0.1 μL של תערובת אוליגו מתאם, ו 2.5 μL של ligase DNA T4. מוסיפים את הריאגנטים לצינור צנטריפוגה PCR 0.2 מ"ל ומערבבים היטב. לדגור אותם ב 16 °C (55 °F) במשך 4 שעות.
- טהר את הדנ"א באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. Elute עם 20-25 μL של חוצץ elution.
- לפני הקמת ספריית הדנ"א, זהה את ריכוז הדנ"א המטוהר כדי לאשר את השימוש בו לניסויי הריצוף הבאים.
- לזהות את ריכוז ה-DNA באמצעות פלואורומטר. לאחר המסת הדגימה על קרח, מערבבים אותה ביסודיות וצנטריפוגה במשך 30 s ב 1000 x g ו 4 °C (70 °F). ואז לקחת כמות מתאימה של מדגם ולמדוד אותו פלואורומטר עם אורך גל של 260 ננומטר.
- מקם דגימות DNA עם איכות מוסמכת וריכוז על פלטפורמת הריצוף Illumina לרצף.
- לפני הרצף, להגביר את ה- DNA באמצעות פריימרים PCR, PE1.0 ו PE2.0, ותערובת מאסטר נאמנות גבוהה 2x (10.5 μL של DNA, 12.5 μL של 2x תערובת מאסטר נאמנות גבוהה, 1 μL של PCR פריימר PE1.0, ו 1 μL של PCR פריימר PE2.0). מוסיפים את הריאגנטים לצינור צנטריפוגה PCR 0.2 מ"ל ומערבבים היטב.
- הפעל את תגובת PCR במחשב PCR: 95 °C predenaturation במשך 2 דקות; ואז 35 מחזורים של 95 °C denaturation עבור 10 s, חישול ב 60 °C (70 °F) עבור 15 °C, הארכה ב 72 °C (72 °F) עבור 5 s; הארכה סופית ב 72 °C (5 דקות). לבסוף, לדגור על התגובה ב 4 °C (5 °F).
- השתמש בדנ"א ליצירת אשכולות ובצע רצף אחר סינתזה על Illumina Hiseq 2000.
הערה: בפרוטוקול זה, תאי זרימה Illumina שימשו ליצירת אשכולות. הרצף-אחר-סינתזה בוצע על מנתח גנום Illumina בעקבות הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים הזרימה כולו של שיטת ChIP-seq מוצג באיור 1. ניסויי ChIP-seq בוצעו באמצעות נוגדנים נגד H3K4me3 בזן מסוג בר P131 ושלושה זנים מוטנטיים ריקים שהיו נטולי mobre2, mospp1, וגן moswd2 כדי לאמת את כל הפרופיל הגנום של הפצת histone H3K4me3 ב M. oryzae. הפרוטופלסטים של זן בר, Δmobre2, Δmospp1, ו Δmoswd2, היו מוכנים ו sonicated ב 25% W, פלט 3 s, לעצור 5 s, ב 4 °C (5 °F). יתר על כן, הכרומטין היה אימונופורמי עם נוגדן H3K4me3 וחלבון Dynabeads A / G. לאחר מכן, שברי DNA חולצו בשיטת פנול-כלורופורם לבניית ספריית רצף ורצף עם קצוות בודדים על פלטפורמת רצף תפוקה גבוהה.
התוצאות הייצוגיות של זנים מסוג בר, Δmobre2, Δmospp1ו- Δmoswd2 עם שיטת ChIP-seq באמצעות נוגדן H3K4me3 מוצגות באיור 2. האותות H3K4me3 של Δmobre2, Δmospp1, ו Δmoswd2 מוטציות מחיקה ירדו באופן משמעותי באזורי היעד הפונקציונליים שלה. כפי שניתן לראות באיור 2, כמה גנים נבחרים המיועדים, כולל MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 MGG_04235, מופו להפצת H3K4me3. בהשוואה לזן הפראי P131, האותות של מוטנטים מועשרים H3K4me3-ChIP-seq ב- Δmobre2, Δmospp1ו- Δmoswd2 מוטציות מחיקה ירדו במידה רבה (איור 2)26. תוצאות אלה מצביעות על כך ששינוי H3K4me3 ממלא תפקידים חשובים בוויסות ביטוי גן היעד ב- M. oryzae.
איור 1. תרשים הזרימה של שיטת ChIP-seq ב- M. oryzae. (א) הדנ"א הגנומי של מ. אוריזה הוצלב עם 1% פורמלדהיד. (B) תאי פטריית פיצוץ ליס, DNA שבור, DNA חינם, ו- DNA מחייב histone הושגו לאחר מכן. (C) שברי דנ"א הקשורים להססנים וחולצו על ידי כריכה ספציפית לנוגדן H3K4me3. (D) באמצעות קישור הפוך, DNA מטוהר לאחר מכן השיג שברי DNA שונה על ידי H3K4me3 היסטונים. (E-F) שברי דנ"א היו רצפים, תוצאות הרצף הושוו, ורצפים זוהו בקבוצת הדנ"א של M. oryzae. (ז) גנים ספציפיים ו loci של H3K4me3 היסטונים ב M. oryzae אוחזרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. מוטציות המחיקה Δmobre2, Δmospp1ו- Δmoswd2 הפחיתו באופן משמעותי את פרופילי H3K4me3 באזורי היעד שלהם. התפלגות H3K4me3-ChIP-seq של פסגות מועשרות סביב אזורי הקידוד של הגנים החופפים ב-Δmobre2, Δmospp1,ומוטנטיםלמחיקת מוסויד2 של Δ, מושבתת בהשוואה לזן הפראיMGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 ובגנים MGG_0423526. המספר ב- WT (קלט) המסומן כ-[0-2074] פירושו התוצאות של ChIP בטווח הדנ"א הגנומי [0-2074]. [0-2074] מתייחס ל-0-2074bp של כרומוזום 6.האיור מציג בחירה אקראית של תוצאות הריצוף, המייצגת רק את התפלגות הדנ"א בכרומוזום 6. תוצאות הרצף המלאות הוגשו לג'נבנק. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ 649321) 26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר סידורי | שם לדוגמה | מספר סידורי לדוגמה | מספר צינורות | סה"כ (מיקרוגרם) | התפלגות מקטעים | סוג מסד נתונים | הערות | ||||
| 1 | קלט | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | השיא העיקרי הוא מתחת 100bp, אבל יש התפלגות DNA בין 100bp-500bp | ChIP-seq | השבר קטן מדי | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | קלט | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | השיא העיקרי הוא מתחת 100bp, אבל יש התפלגות DNA בין 100bp-500bp | ChIP-seq | השבר קטן מדי | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | input Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | השיא העיקרי הוא מתחת 100bp, אבל יש התפלגות DNA בין 100bp-500bp | ChIP-seq | השבר קטן מדי | ||||
| 4 | input Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | השיא העיקרי הוא מתחת 100bp, אבל יש התפלגות DNA בין 100bp-500bp | ChIP-seq | השבר קטן מדי | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | השיא העיקרי הוא בין 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | השיא העיקרי הוא בין 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | השיא העיקרי הוא בין 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | השיא העיקרי הוא בין 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
טבלה 1. הכמות הכוללת של DNA בניסוי זה. הכמות הכוללת של קלט P131(2) הוא 2.7948 מיקרוגרם, הסכום הכולל של Δmobre2(3) (קלט) הוא 2.4748 מיקרוגרם, הסכום הכולל של Δmospp1(4) (קלט) הוא 3.22 מיקרוגרם, הסכום הכולל של Δmoswd2 (5) (קלט) הוא 3.97 מיקרוגרם, והסכום הכולל של P131(2) הוא 0.0735 מיקרוגרם, הסכום הכולל של Δmobre2(3) הוא 0.0491μg, הסכום הכולל של Δmospp1(4) הוא 0.0288 מיקרוגרם, הסכום הכולל של Δmoswd2(5) הוא 0.0527 מיקרוגרם.
איור 3. זיהוי אלקטרופורזה של DNA לאחר אולטרסאונד. לאחר sonication אולטרסאונד, ה- DNA נתון לניסוי ג'ל אגרוז 1% כדי לנתח את אורך שברי ה- DNA. אורך שבר הדנ"א sonicated הוא מ 200-500 bp, ורסיסי DNA אלה יכולים לשמש עבור השלבים הבאים של ChIP-seq. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. עקבות ביואנלייזר של דגימות קלט ו-ChIP. האיור מציג את התפלגות הקטעים של כל דגימה, כאשר המורסה מייצגת את גודל הקטע, וההסמכה מייצגת את גודל השיא. הדגימות הפועלות על הביואנליזר הן קלט P131(2), Δmobre2(3) (קלט), Δmospp1(4) (input), Δmoswd2(5) (קלט), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). ביניהם, התפלגות הקלט P131(2), Δmobre2(3) (קלט), Δmospp1(4) (קלט), Δmoswd2(5) (קלט) מראה שהשיא העיקרי הוא מתחת ל-100 bp, אך יש התפלגות DNA ב- 100-500 bp. ההתפלגות האמיתית של P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) ו Δmoswd2(5) היא בין 100-500 bp כשהשיא הראשי26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאחרונה, ChIP-seq הפך שיטת ניתוח גנומית בשימוש נרחב לקביעת אתרי הכריכה של TFs או אתרי העשרה שהשתנו על ידי היסטיונים ספציפיים. בהשוואה לטכנולוגיית ChIP-seq הקודמת, טכנולוגיית ChIP-seq החדשה רגישה וגמישה מאוד. התוצאות מסופקות ברזולוציה גבוהה ללא השפעות שליליות, כגון אות הרעש הנגרם על ידי הכלאה לא ספציפית של חומצות גרעין. למרות שמדובר בניתוח ביטוי גנים נפוץ, שיטות חישוביות רבות אומתו, והמורכבות של נתוני ChIP-seq במונחים של רעש ושונות מקשה במיוחד על ChIP-seq להתגבר. במונחים של ניתוח נתונים, ניהול וניתוח כמות גדולה של נתונים שנוצרו על ידי ניסויי ChIP-seq הוא גם אתגר שעדיין לא טופל כראוי.
ישנם מספר שלבים מרכזיים בניסוי ChIP-seq. קודם כל, הכנת הפרוטופלסטים חשובה מאוד. יש צורך לשלוט בזמן הקריסה, כך protoplasts באיכות גבוהה ניתן לאסוף. אולטראסאונד הוא גם חשוב מאוד, זמן אולטרסאונד צריך להיות נשלט, ארוך מדי או קצר מדי לא יעבוד. שנית, כמות הנוגדנים שנוספה צריכה להספיק כדי להקל על העשרה של שברי DNA נוספים שנקשרים לחלבון. בעת אימות האיכות והכמות של DNA זינק בניסוי ChIP-seq Qubit פלואורומטר שימש. Agilent 2100 שימש כדי לזהות את הריכוז ההמוני ואת התפלגות שברים של DNA, אשר מספק בסיס אם הדגימה יכולה לשמש להקמת הספרייה הבאים וניסויים רצף.
בסך הכל, פרוטוקול זה משפר את ההבנה של כל ההתפלגות הגנום רחב של שינויים אפיגנטיים המווסתים גנים פתוגניים במהלך זיהום פתוגן. שיטה זו תתרום לזיהוי מנגנונים מולקולריים של שינויים אפיגנטיים ותזהה גנים חדשים במהלך התפתחות פטריות ופתוגנזה הנגרמת על ידי פתוגן ב- M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Grant no. 31871638), פרויקט המחקר המדעי המיוחד של אוניברסיטת החקלאות של בייג'ינג (YQ201603), הפרויקט המדעי של ועדת החינוך של בייג'ינג (KM201610020005), פרויקט גידול המחקר המדעי ברמה גבוהה של BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
