Summary
Здесь мы представляем протокол анализа общегеномного распространения модификаций гистонов, который может идентифицировать новые гены-мишени в патогенезе M. oryzae и других нитевидных грибов.
Abstract
Секвенирование иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq) является мощным и широко используемым молекулярным методом для картирования местоположения всего генома факторов транскрипции (TF), регуляторов хроматина и модификаций гистонов, а также обнаружения целых геномов для выявления паттернов связывания TF и посттрансляционных модификаций гистонов. Хроматин-модифицирующие действия, такие как метилирование гистонов, часто набираются в специфические регуляторные последовательности генов, вызывая локализованные изменения в структурах хроматина и приводя к специфическим транскрипционным эффектам. Рисовый взрыв является разрушительным грибковым заболеванием на рисе во всем мире и является модельной системой для изучения взаимодействия грибка и растений. Тем не менее, молекулярные механизмы в том, как модификации гистонов регулируют свои гены вирулентности в Magnaporthe oryzae, остаются неуловимыми. Больше исследователей должны использовать ChIP-seq для изучения того, как эпигенетическая модификация гистонов регулирует их гены-мишени. ChIP-seq также широко используется для изучения взаимодействия белка и ДНК у животных и растений, но он менее используется в области патологии растений и не был хорошо развит. В этой статье мы описываем экспериментальный процесс и метод работы ChIP-seq для идентификации общегеномного распределения гистонового метилирования (такого как H3K4me3), которое связывается с функциональными генами-мишенями у M. oryzae. Здесь мы представляем протокол анализа общегеномного распространения модификаций гистонов, который может идентифицировать новые гены-мишени в патогенезе M. oryzae и других нитевидных грибов.
Introduction
Эпигенетика — это отрасль генетических исследований, которая относится к наследственным изменениям экспрессии генов без изменения нуклеотидной последовательности генов. Все большее число исследований показало, что эпигенетическая регуляция играет важную роль в росте и развитии эукариотических клеток, включая хроматин, который регулирует и влияет на экспрессию генов посредством динамического процесса складывания и сборки в структуры более высокого порядка1,2. Ремоделирование хроматина и ковалентная модификация гистонов влияют и регулируют функцию и структуру хроматина посредством вариации полимеров хроматина, тем самым достигая функции регуляции экспрессии генов3,4,5,6. Посттрансляционные модификации гистонов включают ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, моноубиквитинирование, сумоилирование и АДФ рибозилирование7,8,9. Метилирование гистонов H3K4, особенно триметилирование, было нанесено на карту с местами начала транскрипции, где оно связано с репликацией транскрипции, рекомбинацией, репарацией и обработкой РНК у эукариот10,11.
Технология ChIP-seq была внедрена в 2007 году и стала экспериментальным стандартом для общегеномного анализа транскрипционной регуляции и эпигенетических механизмов12,13. Этот метод подходит в масштабе всего генома и для получения информации о взаимодействии гистонов или транскрипционных факторов, включая сегменты ДНК ДНК-связывающих белков. Любые последовательности ДНК, сшитые с белками, представляющими интерес, будут сопреципитировать как часть комплекса хроматина. Методы секвенирования нового поколения также используются для секвенирования 36-100 bp ДНК, которые затем сопоставляются с соответствующим геномом-мишенью.
В фитопатогенных грибах недавно начались исследования по изучению того, как модификации метилирования гистонов регулируют их целевые гены в процессе патогенности. Некоторые предыдущие исследования доказали, что регуляция генов, связанных с гистонметилазой, в основном отражается на глушении генов и катализе производства вторичных метаболитов (СМ). MoSet1 представляет метилазу H3K4 в M. oryzae. Нокаут этого гена приводит к полной делеции H3K4me3 модификации14. По сравнению со штаммом дикого типа экспрессия гена MoCEL7C у мутанта ингибируется в CMC-индуцированном состоянии и в неиндуцированном состоянии (глюкоза или целлобиоза), экспрессия MoCEL7C увеличилась на15. В Fusarium graminearumKMT6 может катализировать модификацию метилирования H3K27me3, регулировать нормальное развитие грибов и помогать регулировать «загадочный геном», содержащий кластер генов SM16,17,18,19. В 2013 году Коннолли сообщил, что метилирование H3K9 и H3K27 регулирует патогенный процесс грибов через вторичные метаболиты и эффекторные факторы, которые регулируют ингибированиегенов-мишеней 20. У Aspergillusмодификация гистонов H3K4me2 и H3K4me3 связана с активацией генов и играет важную роль в контроле регуляции уровня хроматина кластеров генов SM21. У M. oryzaeTig1 (гомологичная Tig1 у дрожжей и млекопитающих) представляет собой HADC (гистон-деацетилаза)22. Нокаут гена Tig1 приводит к полной потере патогенности и способности к производству спор у нулевого мутанта. Он более чувствителен к пероксигенной среде, которая не может продуцировать инфекционные гифы22.
Рисовый взрыв, вызванный M. oryzae., является одним из самых серьезных заболеваний риса в большинстве рисоводных районов в мире19. Благодаря своему репрезентативному инфекционному процессу, M. oryzae похож на процесс заражения многих важных патогенных грибов. Поскольку гриб легко может выполнять молекулярно-генетические операции, он стал модельным организмом для изучения грибо-растительных взаимодействий23. Блокирование каждого этапа инфекционного процесса M. oryzae может привести к неудачному заражению. Морфологические изменения в процессе заражения строго регулируются всей функцией генома и транскрипцией гена. Среди них эпигенетические модификации, такие как метилирование гистонов, играют существенную роль в транскрипционной регуляции функциональных генов24,25. Однако до сих пор было проведено мало исследований молекулярного механизма эпигенетических модификаций, таких как метилирование гистонов и ацетилирование гистонов в транскрипции генов патогенеза у M. oryzae. Таким образом, дальнейшее развитие механизма эпигенетической регуляции гриба рисового бласта при одновременном исследовании регуляторной сети этих патогенных генов поможет разработать стратегии профилактики и контроля рисового взрыва.
С развитием функциональной геномики, такой как ChIP-seq, особенно в эпигенетике, этот высокопроизводительный метод сбора данных ускорил исследования хромосом. Используя экспериментальную технологию ChIP-seq, можно идентифицировать общегеномное распределение гистонового метилирования (например, H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) в M. oryzae и других нитевидных грибах. Таким образом, этот метод может помочь прояснить молекулярные механизмы, лежащие в основе того, как эпигенетические модификации регулируют свои гены-мишени во время грибкового патогенеза при патологии растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка протопластов из M. oryzae
- Приготовьте овсяно-томатный агар (ОТА).
- Взвесите 30-50 г овсянки и отварите ее в 800 мл воды (ddH2O) в течение 20 мин. Процедить через два слоя марли и взять фильтрат.
- Соберите спелые помидоры и очистите их. Выжмите сок и процедить через два слоя марли, чтобы собрать 150 мл фильтрованного сока.
- Тщательно перемешайте весь томатный сок и приготовленный овсяный фильтрат и добавьте ddH2O до 1000 мл.
- Добавьте 250 мл ОТА и 2,5 г порошка агара в коническую колбу 500 мл и автоклав в течение 20 мин. Хранить при 25 °C.
- Налейте 25 мл автоклавного ОТА в стакан 5 см х 5 см чашку Петри. Приготовьте всего 10 таких блюд Петри. После того, как OTA затвердеет на чашке Петри, храните посуду вверх ногами при 25 °C.
- Используйте стерилизованную зубочистку, чтобы выкопать небольшой кусочек мицелия из M. oryzae (штамм дикого типа P131, нокаутирующие штаммы Δmobre2, Δmospp1 и Δmoswd2)и поместите их на приготовленные блюда OTA. Культивную культуру в течение 4-6 дней при 28 °C при освещении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переверните чашку Петри вверх дном, чтобы предотвратить загрязнение. - Добавьте 1000 мкл жидкой полной среды (CM) (0,6% дрожжевого экстракта, 0,3% ферментативного гидролизата казеина, 0,3% кислого гидролизата казеина, 1% глюкозы) в блюда OTA с использованием пипетки 1000 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гифы росли на блюдах ОТА в течение 4-6 дней. - Соскоблите мицелий штамма дикого типа и нокаутирующего штамма с помощью петлии прививки.
- Соберите остатки мицелия и перенесите их в 250 мл жидкой полной среды (СМ).
- Выращивайте грибковый мусор в треугольной колбе при 28 °C в течение 36 ч с встряхиванием при 150 об/мин.
- Используйте воронку для фильтрации и сбора грибковых гиф.
- Промыть грибковые гифы 500 мл раствора NaCl 0,7 М.
- Соберите грибковый мицелий и взвесьте его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мицелий не нужно сушить перед взвешиванием. - Добавьте ~1 мл раствора фермента лизиса на 1 г грибкового мицелия.
- Готовят раствор для проницания фермента лизиса 20 мг/мл, растворяя фермент лизиса из Trichoderma harzianum в 0,7 М NaCl.
- Поместите гифы для лизирования при 28 °C в течение 3-4 ч с встряхиванием при 150 об/мин.
- Промыть лизированные гифы 50 мл раствора NaCl 0,7 М.
- Соберите протопласты и центрифугу в течение 15 мин при 2000 х г и 4 °C.
- После центрифугирования осторожно выбросьте супернатант. Повторное суспендирование протопластов в 20 мл 0,7 M naCI буфера при 4 °C.
2. Сшивание in vivo и ультразвук
- Добавьте 55 мкл 37% формальдегида (добавляйте формальдегид капля за каплей до тех пор, пока конечная концентрация не сойдета не сойдета 1%) до 2 мл буфера NaCI, содержащего протопласт для сшивания.
- Инкубировать протопласты при 25 °C в 10 мин.
- Добавьте 20 мкл 10-кратного глицина в каждую пробирку, чтобы погасить нереактированный формальдегид.
- Закрутить для смешивания и инкубации при 25 °C в течение 5 мин.
- Центрифуга в течение 15 мин при 2 000 х г и 4 °C.
- После центрифугирования осторожно выбросьте супернатант. Повторно суспендируют гранулы в 1 мл 0,7 М раствора NaCI.
- Центрифуга в течение 10 мин при 2 000 х г и 4 °C.
- После центрифугирования осторожно выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 750 мкл буфера RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА рН 8, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и ингибиторы протеазы).
- Добавьте 37,5 мкл 20-кратного ингибитора протеазы.
- Перенесите протопласты с предыдущей стадии в центрифужную трубку 1,5 мл.
- Выполняйте ультразвуковую работу (25% Вт, выход 3 с, остановка 5 с, 4 °C) сразу же с помощью ультразвукового прибора в течение примерно 10 минут. Целью этого этапа является обхват сшитого лисата ультразвуком в течение определенного периода времени для определения наилучших условий.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе лизат может быть заморожен при -80 °C. - Если оптимальные условия для ультразвуковой работы уже определены, переходите к следующему шагу.
- При желании удаляют 5 мкл протопластов для анализа агарозного геля (неслышанная ДНК).
- Отрежь хроматин ультразвуковым методом ультразвукового гомогенизатора в течение 8 мин (25% Вт, выход 3 с, стоп 5 с, 4 °С).
- После того, как образец будет УЗИ сломан, выньте часть образца в качестве «входных». Вход не выполняет эксперимент ChIP и содержит всю ДНК и белок, высвобождаемые после того, как образец облит ультразвуком.
- После ультразвуковой работы запустите электрофорез 1% агарозного геля для анализа длины фрагментов ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты электрофореза агарозного геля показывают, что длина фрагмента ДНК составляет 200-500 bp(рисунок 4). - Поместите ультразвуковую трубку на лед, чтобы предотвратить деградацию белка.
- Центрифуга в течение 10 мин при 10 000 х г и 4 °C.
- После центрифугирования перенесите центрифугированный супернатант в новую центрифужную трубку 1,5 мл и храните его при -80 °C для последующего использования. Полученный на этом этапе раствор хроматина может быть использован для последующего ИП.
- Перед проведением эксперимента с IP разбавьте каждый образец хроматина до соотношения 1:10 с 1x буфером RIPA (например, добавьте 10 мкл образца хроматина к 1 мкл буфера 1×RIPA).
3. IP сшитого белка/ДНК
- Пипетка 50 мкл суперпарамагнитных белковых шариков в 2 мл центрифужной трубки. Поместите трубки на магнитную подставку. Дайте магнитным шарикам выпасть в осадок. Удалите супернатант.
- Добавьте в трубку 1 мл 1x RIPA-буфера (предварительно охлажденного на льду) и трижды промыть суперпарамагнитные белковые шарики. После стирки поместите трубки на магнитную подставку и удалите супернатант. Добавьте 100 мкл 1x RIPA буфера в каждую трубку.
- Добавьте в пробирку 300 мкл образца хорматина (было использовано2 х 10 7 клеток), 100 мкл суперпарамагнитных белковых шариков и 4 мкл антитела H3K4me3.
- Используйте образцы с Mouse IgG в качестве отрицательного элемента управления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиный IgG, используемый в этом протоколе, содержит 0,01 М фосфатного буфера и 0,15 М NaCl и останется замороженным ниже 20 °C (см. Таблицу материалов). - После хорошего перемешивания поместите образцы на вращающийся шейкер и инкубируют в течение ночи при 4 °C, 30 х г.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, удастся сократить инкубационную продолжительность иммунопреципитации (ИП). Время инкубации зависит от различных факторов (например, антитело, мишень гена, тип клетки и т. Д.) И должно быть эмпирически протестировано.
4. Сбор и промывка продуктов ИС
- Гранулируют суперпарамагнитные белковые шарики, поместив их на магнитную подставку. Аспирировать и выбросить супернатант.
- Промывайте суперпарамагнитный белковый комплекс шарик-антитело/хроматин путем повторного усвоения шариков в 1 мл 1x буфера RIPA.
- Промойте трубку на ротационном шейкере в течение 5 мин и удалите супернатант при 30 х г.
- Добавьте 1 мл буфера промывки иммунного комплекса с низким содержанием соли (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl pH 8,1 и 150 мМ NaCl).
- Промойте трубку на ротационном шейкере в течение 5 минут и удалите супернатант.
- Добавьте 1 мл буфера промывки высокосолевого иммунного комплекса (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl pH 8,1 и 500 мМ NaCl) в трубку центрифуги.
- Поместите трубку на вращающийся шейкер на 5 минут и удалите супернатант.
- Промыть 1 мл LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолевой кислоты, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ Tris-HCl pH 8,1) в центрифужной трубке.
- Поместите трубку на вращающийся шейкер на 5 минут и удалите супернатант.
- Снова промойте пробирку 1 мл буфера LiCI 0,25 М, удалите супернатант пипеткой, а затем выбросьте супернатант.
- Добавьте 1 мл буфера TE (10 мМ Tris-HCl pH 8,1, 1 мМ ЭДТА).
- Поместите трубку на вращающийся шейкер на 5 мин при 30 х г.
- Снова вымойте трубку буфером 1 мл TE и удалите супернатант пипеткой.
- Соберите бусины.
5. Элюция белково-ДНК-комплексов
- Подготовьте буфер элюдения (10 мкл 20% SDS, 20 мкл 1 M NaHCO3,170 мкл стерильного дистиллированногоH2O) для всех IP и входных трубок.
- Добавьте 100 мкл буфера элюдения в каждую трубку центрифуги.
- Элюирование при 65 °C в течение 15 мин.
- Центрифуга в течение 1 мин при 10 000 х г и 4 °C и сбор супернатанта в новые центрифужные трубки.
- Повторите шаги 5.2 - 5.4 и объедините элюаты. Добавьте 190 мкл буфера элюации к 10 мкл входной ДНК. (общий объем = 200 мкл).
6. Обратное сшивание белковых/ДНК-комплексов
- Добавьте 8 мкл 5 M NaCl во все пробирки и инкубировать при 65 °C в течение 4-5 ч или на ночь, чтобы обратить вспять сшивки ДНК-белок.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага сохраните образцы при -20 °C и при необходимости продолжайте протокол на следующий день. - Добавить 1 мкл РНКазы А и инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
- Добавляют 4 мкл протеиназы К (растворяют вН2Опри 20 мг/мл и хранят при -20°С) в каждую пробирку и инкубируют при 45°С в течение 1-2 ч.
7. Очистка и восстановление ДНК
- Добавьте 550 мкл смеси фенола/хлороформа/изоамилового спирта (соотношение 25:24:1) в трубку центрифуги.
- Тщательно вихрь смесь в течение 1 мин.
- Центрифуга в течение 15 мин при 10 000 х г и аспирировать супернатант.
- Перенесите извлеченный супернатант с предыдущей ступени в новую центрифужную трубку 1,5 мл.
- Добавьте в пробирку 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия, 2,5 объема абсолютного этанола и 3 мкл гликогена (20 мг/мл).
- Поместите образец в холодильник при -20 °C на ночь для осадков.
- Центрифуга в течение 15 мин при 10 000 х г и 4 °C.
- Выбросьте супернатант после центрифугирования. Промыть гранулу три раза 1 мл 75% этанола (необходимо приготовить свежим) при 10 000 х г.
- Поместите промытый осадок на чистую скамейку, чтобы спирт высох.
- Добавьте 50 мкл стерильного деионизированногоH2O для достаточного растворения осадка.
- Развяжийте адаптер секвенирования с фрагментом ДНК и используйте высокопроизводительную платформу секвенирования для секвенирования ДНК.
8. Восстановление ДНК и построение библиотеки Solexa
- Репарировать концы ДНК для генерации тупой ДНК с помощью набора для конечного восстановления ДНК (1-34 мкл ДНК, 5 мкл 10-кратного буфера конечной репарации, 5 мкл 2,5 мМ каждый dNTP, 5 мкл 10 мМ АТФ, 1 мкл смеси ферментов конечного репарации иH2O для регулировки объема реакции до 49 мкл).
- Используйте набор для очистки ПЦР или фенол: экстракция хлороформа для очистки ДНК. Элюют или повторно суспендировали ДНК в 30 мкл 1x TE рН 7,4.
- Добавьте «А» к 3' концам (30 мкл ДНК со ступени 2, 2 мклH2O, 5 мкл 10x Taq буфера, 10 мкл 1 мМ dATP и 3 мкл Taq ДНК-полимеразы). Добавьте реагенты в 0,2 мл центрифужной трубки ПЦР, хорошо перемешайте и реагируйте в машине ПЦР при 72 °C в течение 10 мин.
- Выполняют линкерное лигирование путем смешивания 10 мкл ДНК, 9,9 мклH2O, 2,5 мкл буфера ДНК-лигазы T4, 0,1 мкл переходной олиго-смеси и 2,5 мкл Т4-лигазы ДНК. Добавьте реагенты в трубку центрифуги ПЦР 0,2 мл и хорошо перемешайте. Инкубировать их при 16 °C в течение 4 ч.
- Очистите ДНК с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Элют с 20-25 мкл буфера элюения.
- Прежде чем библиотека ДНК будет создана, определите концентрацию очищенной ДНК, чтобы подтвердить ее использование для последующих экспериментов по секвенированию.
- Определите концентрацию ДНК с помощью флуорометра. После таяния образца на льду тщательно перемешайте его и центрифугируют в течение 30 с при 1000 х г и 4 °C. Затем берут соответствующее количество образца и измеряют его в флуорометре с длиной волны 260 нм.
- Поместите образцы ДНК с квалифицированным качеством и концентрацией на платформу секвенирования Illumina для секвенирования.
- Перед секвенированием ампланируйте ДНК с помощью праймеров ПЦР, PE1.0 и PE2.0 и 2x высокоточной мастер-смеси (10,5 мкл ДНК, 12,5 мкл 2x высокоточной мастер-смеси, 1 мкл праймера ПЦР PE1.0 и 1 мкл праймера ПЦР PE2.0). Добавьте реагенты в трубку центрифуги ПЦР 0,2 мл и хорошо перемешайте.
- Запуск реакции ПЦР в аппарате ПЦР: преденатурация при 95 °C в течение 2 мин; затем 35 циклов денатурации при 95 °С в течение 10 с, отжига при 60 °С в течение 15 с, удлинения при 72 °С в течение 5 с; окончательное расширение при 72 °C в течение 5 мин. Наконец, инкубируют реакцию при 4 °C.
- Используйте ДНК для генерации кластеров и выполняйте секвенирование путем синтеза на Illumina Hiseq 2000.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе проточные клетки Illumina использовались для генерации кластеров. Секвенирование путем синтеза выполняли на анализаторе генома Illumina в соответствии с инструкциями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вся блок-схема метода ChIP-seq показана на рисунке 1. Эксперименты ChIP-seq проводились с использованием антител против H3K4me3 в штамме дикого типа P131 и трех нулевых мутантных штаммах, которые были лишены генов mobre2, mospp1и moswd2, для проверки всего геномного профиля распределения гистона H3K4me3 в M. oryzae. Протопласты штамма дикого типа, Δmobre2,Δmospp1и Δmoswd2, готовили и обужали ультразвуком при 25% W, выходе 3 с, стоп 5 с, при 4 °C. Кроме того, хроматин был иммуноочищен антителом H3K4me3 и белком Dynabeads A/G. Впоследствии фрагменты ДНК извлекали с использованием метода фенол-хлороформа для построения библиотеки секвенирования и секвенировали с одиночными концами на высокопроизводительной платформе секвенирования.
Репрезентативные результаты штаммов дикого типа, Δmobre2,Δmospp1и Δmoswd2 методом ChIP-seq с использованием антитела H3K4me3 показаны на рисунке 2. Сигналы H3K4me3 мутантов делеции Δmobre2,Δmospp1и Δmoswd2 были значительно уменьшены в его функциональных целевых областях. Как показано на рисунке 2,некоторые выбранные гены-мишени-кандидаты, включая MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 и MGG_04235, были сопоставлены для распределения H3K4me3. По сравнению с штаммом дикого типа P131 сигналы обогащенных H3K4me3-ChIP-seq считываются в мутантах делеции Δmobre2, Δmospp1и Δmoswd2 (рисунок 2)26. Эти результаты свидетельствуют о том, что модификация H3K4me3 играет важную роль в регуляции экспрессии генов-мишеней у M. oryzae.
Рисунок 1. Блок-схема метода ChIP-seq в M. oryzae. (A) Геномная ДНК M. oryzae быласшита с 1% формальдегидом. (B) Впоследствии были получены клетки лизированного бластного гриба, сломанная ДНК, свободная ДНК и ДНК, связывающая гистоны. (C) Фрагменты ДНК связывались с гистонами и экстрагировались путем специфического связывания с антителом H3K4me3. (D) Путем обратного сшивания очищенная ДНК впоследствии получала фрагменты ДНК, модифицированные гистонами H3K4me3. (Е-Ф) Фрагменты ДНК были секвенированы, результаты секвенирования были сопоставлены, и последовательности были идентифицированы в группе ДНК M. oryzae. (G) Извлечены специфические гены и локусы гистонов H3K4me3 у M. oryzae. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Мутанты делеции Δmobre2,Δmospp1и Δmoswd2 значительно уменьшали профили H3K4me3 в их целевых областях. Распределение H3K4me3-ChIP-seq обогащенных пиков вокруг кодирующих областей перекрывающихся генов в мутантах делеции Δmobre2,Δmospp1и Δmoswd2 декрасцентировано по сравнению со штаммом дикого типа в генах MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 и MGG_0423526. Число в WT (вход), обозначенное как [0-2074], означает результаты ChIP в диапазоне геномной ДНК [0-2074]. [0-2074] относится к 0-2074bp хромосомы 6.На рисунке показан случайный выбор результатов секвенирования, который представляет только распределение ДНК на хромосоме 6. Полные результаты последовательности были представлены в Генбанк. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ присоединение 649321) 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Порядковый номер | Пример имени | Серийный номер образца | Количество труб | Всего (мкг) | Распределение фрагментов | Тип базы данных | Замечания | ||||
| 1 | ввод | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Основной пик ниже 100 б.п., но существует распределение ДНК между 100 бп-500 бп. | ChIP-seq | Фрагмент слишком мал | ||||
| П131(2) | |||||||||||
| 2 | Ввод | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Основной пик ниже 100 б.п., но существует распределение ДНК между 100 бп-500 бп. | ChIP-seq | Фрагмент слишком мал | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | вход Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Основной пик ниже 100 б.п., но существует распределение ДНК между 100 бп-500 бп. | ChIP-seq | Фрагмент слишком мал | ||||
| 4 | вход Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Основной пик ниже 100 б.п., но существует распределение ДНК между 100 бп-500 бп. | ChIP-seq | Фрагмент слишком мал | ||||
| 5 | П131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Основной пик находится между 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Основной пик находится между 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Основной пик находится между 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Основной пик находится между 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Таблица 1. Общее количество ДНК в этом эксперименте. Общее количество входного P131(2) составляет 2,7948 мкг, общее количество Δmobre2(3) (вход) составляет 2,4748 мкг, общее количество Δmospp1(4) (вход) составляет 3,22 мкг, общее количество Δmoswd2 (5) (вход) составляет 3,97 мкг, а общее количество P131(2) составляет 0,0735 мкг, общее количество Δmobre2(3) составляет 0,0491 мкг, общее количество Δmospp1(4) составляет 0,0288 мкг, общее количество Δmoswd2(5) составляет 0,0527 мкг.
Рисунок 3. Электрофорезная детектизация ДНК после ультразвука. После ультразвуковой ультразвуковой работы ДНК подвергается эксперименту с 1% агарозным гелем для анализа длины фрагментов ДНК. Длина фрагмента ДНК, обжаиваемого ультразвуком, составляет от 200 до 500 bp, и эти фрагменты ДНК могут быть использованы для следующих этапов ChIP-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. След биоанализатора входных и CHIP образцов. На рисунке показано распределение фрагментов каждого образца, где абсцисса представляет размер фрагмента, а ордината представляет пиковый размер. Образцы, работающие на биоанализаторе, являются входными P131(2), Δmobre2(3) (вход), Δmospp1(4) (вход), Δmoswd2(5) (вход), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Среди них распределение входных P131(2), Δmobre2(3)(вход), Δmospp1(4)(вход), Δmoswd2(5)(вход) показывает, что основной пик ниже 100 bp, но есть распределение ДНК на уровне 100-500 bp. Истинное распределение P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) и Δmoswd2(5) составляет между 100-500 bp в качестве основного пика26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последнее время ChIP-seq стал широко используемым методом геномного анализа для определения сайтов связывания ТФ или сайтов обогащения, модифицированных специфическими гистонами. По сравнению с предыдущей технологией ChIP-seq, новая технология ChIP-seq является высокочувствительной и гибкой. Результаты предоставляются в высоком разрешении без негативных эффектов, таких как шумовой сигнал, вызванный неспецифической гибридизацией нуклеиновых кислот. Хотя это общий анализ экспрессии генов, многие вычислительные методы были проверены, и сложность данных ChIP-seq с точки зрения шума и изменчивости делает эту проблему особенно трудной для преодоления ChIP-seq. С точки зрения анализа данных, управление и анализ большого количества данных, генерируемых экспериментами ChIP-seq, также является проблемой, которую еще предстоит адекватно решить.
В эксперименте ChIP-seq есть несколько ключевых шагов. Прежде всего, очень важна подготовка протопластов. Необходимо контролировать время коллапса, чтобы можно было собрать качественные протопласты. УЗИ также очень важно, время УЗИ должно контролироваться, слишком долго или слишком коротко не получится. Во-вторых, количество добавленных антител должно быть достаточным, чтобы облегчить обогащение большего количества фрагментов ДНК, которые связываются с белком. При проверке качества и количества ДНК, осажденной в эксперименте ChIP-seq, использовался qubit Fluorometer. Agilent 2100 был использован для обнаружения массовой концентрации и распределения фрагментов ДНК, что дает основание для того, может ли образец быть использован для последующего создания библиотеки и экспериментов по секвенированию.
В целом, этот протокол улучшает понимание распространения эпигенетических модификаций, которые регулируют патогенные гены во время патогенной инфекции. Этот метод будет способствовать выявлению молекулярных механизмов эпигенетических модификаций и выявлению новых генов-мишеней при развитии грибов и патогенезе, вызванном патогенами, у M. oryzae и других нитевидных грибов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31871638), Специальным научно-исследовательским проектом Пекинского сельскохозяйственного университета (YQ201603), Научным проектом Пекинского комитета по образованию (KM201610020005), проектом научно-исследовательской культивации высокого уровня BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
