Summary
Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.
Abstract
Le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) est une technique moléculaire puissante et largement utilisée pour cartographier les emplacements du génome entier des facteurs de transcription (TF), des régulateurs de chromatine et des modifications des histones, ainsi que pour détecter des génomes entiers pour découvrir des modèles de liaison TF et des modifications post-traductionnelles des histones. Les activités modifiant la chromatine, telles que la méthylation des histones, sont souvent recrutées dans des séquences de régulation géniques spécifiques, provoquant des changements localisés dans les structures de la chromatine et entraînant des effets transcriptionnels spécifiques. L’explosion de riz est une maladie fongique dévastatrice sur le riz dans le monde entier et est un système modèle pour l’étude de l’interaction champignon-plante. Cependant, les mécanismes moléculaires dans la façon dont les modifications des histones régulent leurs gènes de virulence dans Magnaporthe oryzae restent insaisissables. Plus de chercheurs doivent utiliser ChIP-seq pour étudier comment la modification épigénétique des histones régule leurs gènes cibles. ChIP-seq est également largement utilisé pour étudier l’interaction entre les protéines et l’ADN chez les animaux et les plantes, mais il est moins utilisé dans le domaine de la pathologie végétale et n’a pas été bien développé. Dans cet article, nous décrivons le processus expérimental et la méthode de fonctionnement de ChIP-seq pour identifier la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (comme H3K4me3) qui se lie aux gènes cibles fonctionnels de M. oryzae. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.
Introduction
L’épigénétique est une branche de la recherche génétique qui fait référence au changement héréditaire de l’expression des gènes sans modifier la séquence nucléotidique des gènes. Un nombre croissant d’études ont montré que la régulation épigénétique joue un rôle important dans la croissance et le développement des cellules eucaryotes, y compris la chromatine qui régule et affecte l’expression des gènes par le processus dynamique de repliement et d’assemblage dans des structures d’ordre supérieur1,2. Le remodelage de la chromatine et la modification covalente des histones affectent et régulent la fonction et la structure de la chromatine par la variation des polymères de chromatine, atteignant ainsi la fonction de régulation del’expressiondes gènes3,4,5,6. Les modifications post-traductionnelles de l’histone comprennent l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation, la monoubiquitination, la sumoylation et la ribosylation ADP7,8,9. La méthylation de l’histone H3K4, en particulier la triméthylation, a été mappée aux sites de départ de la transcription où elle est associée à la réplication de la transcription, à la recombinaison, à la réparation et au traitement de l’ARN chez les eucaryotes10,11.
La technologie ChIP-seq a été introduite en 2007 et est devenue la norme expérimentale pour l’analyse à l’échelle du génome de la régulation transcriptionnelle et des mécanismes épigénétiques12,13. Cette méthode convient à l’échelle du génome et permet d’obtenir des informations sur l’interaction des histones ou des facteurs de transcription, y compris des segments d’ADN de protéines de liaison à l’ADN. Toute séquence d’ADN réticulée à des protéines d’intérêt coprécipitera dans le cadre du complexe chromatine. Des techniques de séquençage de nouvelle génération sont également utilisées pour séquencer 36 à 100 bp d’ADN, qui sont ensuite appariés au génome cible correspondant.
Chez les champignons phytopathogènes, la recherche a récemment commencé à étudier comment les modifications de la méthylation des histones régulent leurs gènes cibles dans le processus de pathogénicité. Certaines études antérieures ont prouvé que la régulation des gènes liés à l’histone méthylase se reflète principalement dans le silençage génique et la catalyse de la production de métabolites secondaires (SM). MoSet1 est la méthylase H3K4 dans M. oryzae. L’élimination de ce gène entraîne la délétion complète de la modification H3K4me314. Par rapport à la souche de type sauvage, l’expression du gène MoCEL7C dans le mutant est inhibée à l’état induit par le CMC et à l’état non induit (glucose ou cellobiose), l’expression du MoCEL7C augmentéede 15. Dans Fusarium graminearum,KMT6 peut catalyser la modification de la méthylation de H3K27me3, réguler le développement normal des champignons et aider à réguler le « génome cryptique » contenant le groupe de gènes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly a rapporté que la méthylation H3K9 et H3K27 régule le processus pathogène des champignons par le biais de métabolites secondaires et de facteurs effecteurs qui régulent l’inhibition des gènes cibles20. Chez Aspergillus,la modification des histones H3K4me2 et H3K4me3 est liée à l’activation des gènes et joue un rôle important dans le contrôle de la régulation du niveau de chromatine des groupes de gènes SM21. Chez M. oryzae,Tig1 (homologue à Tig1 chez les levures et les mammifères) est un HADC (histone désacétylase)22. L’élimination du gène Tig1 entraîne la perte complète de la pathogénicité et de la capacité de production de spores chez le mutant nul. Il est plus sensible à un environnement peroxygénique, qui ne peut pas produire d’hyphes infectieux22.
L’explosion de riz causée par M. oryzae. est l’une des maladies du riz les plus graves dans la plupart des régions rizicoles du monde19. En raison de son processus d’infection représentatif, M. oryzae est similaire au processus d’infection de nombreux champignons pathogènes importants. Comme il peut facilement effectuer des opérations de génétique moléculaire, le champignon est devenu un organisme modèle pour l’étude des interactions fongiques-végétales23. Le blocage de chaque étape du processus d’infection de M. oryzae peut entraîner une infection infructueuse. Les changements morphologiques au cours du processus d’infection sont strictement régulés par l’ensemble de la fonction du génome et la transcription des gènes. Parmi eux, les modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones jouent un rôle essentiel dans la régulation transcriptionnelle des gènes fonctionnels24,25. Cependant, jusqu’à présent, peu d’études ont été réalisées sur le mécanisme moléculaire des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et l’acétylation des histones dans la transcription des gènes de pathogenèse chez M. oryzae. Par conséquent, le développement du mécanisme de régulation épigénétique du champignon de l’explosion du riz tout en recherchant le réseau de régulation en amont et en aval de ces gènes pathogènes aidera à développer des stratégies de prévention et de contrôle de l’explosion du riz.
Avec le développement de la génomique fonctionnelle telle que ChIP-seq, en particulier en épigénétique, cette méthode d’acquisition de données à haut débit a accéléré la recherche sur les chromosomes. En utilisant la technologie expérimentale ChIP-seq, la distribution à l’échelle du génome de la méthylation des histones (telles que H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) chez M. oryzae et d’autres champignons filamenteux peut être identifiée. Par conséquent, cette méthode peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à la façon dont les modifications épigénétiques régulent leurs gènes cibles candidats au cours de la pathogenèse fongique en pathologie végétale.
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Protocol
1. Préparation de protoplastes de M. oryzae
- Préparez la gélose à l’avoine-tomate (OTA).
- Peser 30-50 g de flocons d’avoine et les faire bouillir dans 800 mL d’eau (ddH2O) pendant 20 min. Filtrer à travers deux couches de gaze et prendre le filtrat.
- Cueillez des tomates mûres et pelez-les. Presser le jus et filtrer à travers deux couches de gaze pour recueillir 150 mL du jus filtré.
- Mélanger soigneusement tout le jus de tomate et le filtrat d’avoine préparé et ajouter ddH2O jusqu’à 1000 mL.
- Ajouter 250 mL d’OTA et 2,5 g de poudre de gélose dans une fiole conique de 500 mL et autoclaver pendant 20 min. Conserver à 25 °C.
- Versez 25 mL de l’OTA autoclavé dans une boîte de Petri en verre de 5 cm x 5 cm. Préparez 10 de ces boîtes de Petri au total. Une fois que l’OTA s’est solidifié sur les boîtes de Pétri, conservez les plats à l’envers à 25 °C.
- Utilisez un cure-dent stérilisé pour extraire un petit morceau de mycélium de M. oryzae (la souche de type sauvage P131, les souches knockout Δmobre2, Δmospp1 et Δmoswd2)et placez-les sur les plats OTA préparés. Culturez-les pendant 4 à 6 jours à 28 °C dans des conditions de lumière.
REMARQUE: Tournez la boîte de Petri à l’envers pour éviter la pollution. - Ajouter 1000 μL de milieu complet liquide (CM) (0,6% d’extrait de levure, 0,3% d’hydrolysat de caséine enzymatique, 0,3% d’hydrolysat de caséine acide, 1% de glucose) aux plats OTA à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
REMARQUE: Les hyphes ont poussé sur les plats OTA pendant 4-6 jours. - Gratter le mycélium de la souche de type sauvage et knockout avec une boucle d’inoculation.
- Recueillir les débris de mycélium et les transférer dans 250 mL de liquide En milieu complet (CM).
- Faire pousser les débris fongiques dans une fiole triangulaire à 28 °C pendant 36 h en agitant à 150 tr/min.
- Utilisez un entonnoir pour filtrer et collecter les hyphes fongiques.
- Laver les hyphes fongiques avec 500 mL de solution de NaCl de 0,7 M.
- Recueillez le mycélium fongique et pesez-le.
REMARQUE: Le mycélium n’a pas besoin d’être séché avant la pesée. - Ajouter ~1 mL de solution de perméation enzymatique de lyse pour 1 g de mycélium fongique.
- Préparer la solution de perméation enzymatique de lyse à 20 mg/mL en dissolvant l’enzyme de lyse de Trichoderma harzianum dans 0,7 M de NaCl.
- Placer les hyphes pour les lyser à 28 °C pendant 3-4 h en agitant à 150 tr/min.
- Laver les hyphes lysés avec 50 mL de solution de NaCl de 0,7 M.
- Recueillir les protoplastes et centrifuger pendant 15 min à 2 000 x g et 4 °C.
- Après centrifugation, jeter soigneusement le surnageant. Resuspendez les protoplastes dans 20 mL de tampon NaCI de 0,7 M à 4 °C.
2. Réticulation et sonication in vivo
- Ajouter 55 μL de formaldéhyde à 37 % (ajouter le formaldéhyde goutte à goutte jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1 %) à 2 mL de tampon NaCI contenant du protoplaste pour la réticulation.
- Incuber les protoplastes à 25 °C pendant 10 min.
- Ajouter 20 μL de 10x glycine à chaque tube pour éteindre le formaldéhyde non réagi.
- Faire tourbillonner pour mélanger et incuber à 25 °C pendant 5 min.
- Centrifuger pendant 15 min à 2 000 x g et 4 °C.
- Après centrifugation, jeter soigneusement le surnageant. Resuspendez la pastille dans 1 mL de solution naci de 0,7 M.
- Centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g et 4 °C.
- Après centrifugation, jeter soigneusement le surnageant. Resuspendez la pastille dans 750 μL de tampon RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS et inhibiteurs de la protéase).
- Ajouter 37,5 μL d’inhibiteur de protéase 20x.
- Transférer les protoplastes de l’étape précédente dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
- Effectuer la sonication (25% W, sortie 3 s, arrêt 5 s, 4 °C) immédiatement avec un sonicateur pendant environ 10 min. Le but de cette étape est de soniquer le lysate réticulé pendant un certain temps afin de déterminer les meilleures conditions.
REMARQUE: Le lysate peut être congelé à -80 ° C à cette étape. - Si les conditions optimales de sonication ont déjà été déterminées, passez à l’étape suivante.
- Si vous le souhaitez, retirez 5 μL de protoplastes pour l’analyse du gel d’agarose (ADN non râlé).
- Cisaillez la chromatine par sonication avec un homogénéisateur à ultrasons pendant 8 min (25% W, sortie 3 s, arrêt 5 s, 4 °C).
- Une fois que l’échantillon est brisé par ultrasons, retirez une partie de l’échantillon en tant qu'"entrée ». L’entrée n’effectue pas l’expérience ChIP et contient tout l’ADN et les protéines libérés après la sonique de l’échantillon.
- Après la sonication, exécutez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1% pour analyser la longueur des fragments d’ADN.
REMARQUE: Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose montrent que la longueur du fragment d’ADN est de 200 à 500 bp(Figure 4). - Placez le tube sonique sur la glace pour éviter la dégradation des protéines.
- Centrifuger pendant 10 min à 10 000 x g et 4 °C.
- Après centrifugation, transférer le surnageant centrifugé dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 mL et le stocker à -80 °C pour une utilisation ultérieure. La solution de chromatine obtenue dans cette étape peut être utilisée pour la PI ultérieure.
- Avant d’effectuer l’expérience IP, diluez chaque échantillon de chromatine dans un rapport de 1:10 avec 1x tampon RIPA (par exemple, ajoutez 10 μL d’échantillon de chromatine à 1 μL de tampon 1×RIPA).
3. IP de la protéine/ADN réticulé
- Pipeter 50 μL de billes de protéines superparamagnétiques dans un tube de centrifugeuse de 2 mL. Placez les tubes sur un support magnétique. Laissez les perles magnétiques précipiter. Retirez le surnageant.
- Ajouter 1 mL de 1x tampon RIPA (pré-refroidi sur glace) au tube et laver trois fois les billes de protéines superparamagnétiques. Après le lavage, placez les tubes sur un support magnétique et retirez le surnageant. Ajouter 100 μL de tampon RIPA 1x à chaque tube.
- Ajouter 300 μL d’échantillon de chormatine (2 x 107 cellules ont été utilisées), 100 μL de billes de protéines superparamagnétiques et 4 μL d’anticorps H3K4me3 au tube.
- Utilisez des échantillons avec des IgG de souris comme témoin négatif.
REMARQUE: Les IgG de souris utilisées dans ce protocole contiennent 0,01 M de tampon phosphate et 0,15 M de NaCl, et resteront congelées en dessous de 20 ° C (voir tableau des matériaux). - Après avoir bien mélangé, placer les échantillons sur un agitateur rotatif et incuber pendant la nuit à 4 °C, 30 x g.
REMARQUE: Il peut être possible de réduire le temps d’incubation de l’immunoprécipitation (IP). Le temps d’incubation dépend de différents facteurs (par exemple, l’anticorps, la cible du gène, le type de cellule, etc.) et devra être testé empiriquement.
4. Collecte et rinçage des produits IP
- Arquez les billes de protéines superparamagnétiques en les plaçant sur un support magnétique. Aspirer et jeter le surnageant.
- Laver le complexe perle-anticorps/chromatine de protéine superparamagnétique en réutilisant les billes dans 1 mL de tampon RIPA 1x.
- Rincez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant à 30 x g.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage complexe immunitaire faible en sel (0,1 % de FDS, 1 % de Triton X-100, 2 mM d’EDTA, 20 mM de Tris-HCl pH 8,1 et 150 mM de NaCl).
- Rincez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage complexe immunisé à haute teneur en sel (0,1 % de FDS, 1 % de Triton X-100, 2 mM d’EDTA, 20 mM de Tris-HCl pH 8,1 et 500 mM de NaCl) au tube de centrifugeuse.
- Placez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant.
- Rincer avec 1 mL de LiCl (0,25 M LiCl, 1 % de NP-40, 1 % d’acide désoxycholique, 1 mM d’EDTA et 10 mM de Tris-HCl pH 8,1) dans le tube de centrifugeuse.
- Placez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min et retirez le surnageant.
- Rincez à nouveau le tube à essai avec 1 mL de tampon LiCI de 0,25 M, retirez le surnageant avec une pipette, puis jetez le surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
- Placez le tube sur un agitateur rotatif pendant 5 min à 30 x g.
- Lavez à nouveau le tube avec un tampon TE de 1 mL et retirez le surnageant avec une pipette.
- Ramassez les perles.
5. Élution des complexes protéine/ADN
- Préparer le tampon d’élution (10 μL de FDS à 20 %, 20 μL de 1 MNaHCO3,170 μL deH2O distillé stérile) pour tous les tubes IP et d’entrée.
- Ajouter 100 μL de tampon d’élution à chaque tube de centrifugeuse.
- Élution à 65 °C pendant 15 min.
- Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g et 4 °C et recueillir le surnageant dans de nouveaux tubes centrifuges.
- Répétez les étapes 5.2 à 5.4 et combinez les éluats. Ajouter 190 μL de tampon d’élution aux 10 μL de l’ADN d’entrée. (volume total = 200 μL).
6. Réticulation inverse des complexes protéine/ADN
- Ajouter 8 μL de 5 M NaCl à tous les tubes et incuber à 65 °C pendant 4-5 h ou pendant la nuit pour inverser les liaisons croisées ADN-protéine.
REMARQUE: Après cette étape, stockez les échantillons à -20 °C et continuez le protocole le lendemain, si nécessaire. - Ajouter 1 μL de RNase A et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Ajouter 4 μL de protéinase K (dissoute dansH2Oà 20 mg/mL et conservée à -20 °C) dans chaque tube et incuber à 45 °C pendant 1-2 h.
7. Purification et récupération de l’ADN
- Ajouter 550 μL de mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (rapport 25:24:1) au tube de centrifugeuse.
- Bien tourbillonnant le mélange pendant 1 min.
- Centrifuger pendant 15 min à 10 000 x g et aspirer le surnageant.
- Transférer le surnageant extrait de l’étape précédente dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
- Ajouter 1/10 volume de solution d’acétate de sodium 3 M, 2,5 volumes d’éthanol absolu et 3 μL de glycogène (20 mg/mL) dans le tube.
- Placer l’échantillon au réfrigérateur à -20 °C pendant la nuit pour la précipitation.
- Centrifuger pendant 15 min à 10 000 x g et 4 °C.
- Jeter le surnageant après centrifugation. Lavez la pastille trois fois avec 1 mL d’éthanol à 75 % (doit être préparé frais) à 10 000 x g.
- Placez le précipité lavé sur un banc propre pour laisser sécher l’alcool.
- Ajouter 50 μL deH2O stérile désionisé pour dissoudre suffisamment le précipité.
- Ligaturez l’adaptateur de séquençage au fragment d’ADN et utilisez une plate-forme de séquençage à haut débit pour séquencer l’ADN.
8. Réparation de l’ADN et construction de la bibliothèque Solexa
- Réparez les extrémités de l’ADN pour générer de l’ADN émoussé à l’aide d’un kit de réparation finale de l’ADN (1 à 34 μL d’ADN, 5 μL de tampon de réparation finale 10x, 5 μL de 2,5 mM chacun dNTP, 5 μL de 10 mM d’ATP, 1 μL de mélange d’enzymes de réparation finale et H2O pour ajuster le volume de réaction à 49 μL).
- Utilisez un kit de purification par PCR ou phénol : extraction de chloroforme pour purifier l’ADN. Éluer ou resuspend l’ADN dans 30 μL de 1x TE pH 7,4.
- Ajouter « A » aux extrémités 3' (30 μL d’ADN de l’étape 2, 2 μL deH2O, 5 μL de tampon Taq 10x, 10 μL de 1 mM dATP et 3 μL d’ADN polymérase Taq). Ajouter les réactifs dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 mL, bien mélanger et réagir dans une machine PCR à 72 °C pendant 10 min.
- Effectuer la ligature de liaison en mélangeant 10 μL d’ADN, 9,9 μL deH2O, 2,5 μL de tampon d’ADN ligase T4, 0,1 μL de mélange oligo adaptateur et 2,5 μL d’ADN ligase T4. Ajouter les réactifs dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 mL et bien mélanger. Les incuber à 16 °C pendant 4 h.
- Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de purification par PCR selon le protocole du fabricant. Éluez avec 20-25 μL de tampon d’élution.
- Avant que la bibliothèque d’ADN ne soit établie, identifiez la concentration de l’ADN purifié pour confirmer son utilisation pour les expériences de séquençage ultérieures.
- Détectez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluoromètre. Après avoir fait fondre l’échantillon sur de la glace, bien mélanger et centrifuger pendant 30 s à 1000 x g et 4 °C. Ensuite, prenez une quantité appropriée d’échantillon et mesurez-la dans un fluoromètre d’une longueur d’onde de 260 nm.
- Placez des échantillons d’ADN de qualité et de concentration qualifiées sur la plate-forme de séquençage Illumina pour le séquençage.
- Avant le séquençage, amplifiez l’ADN à l’aide d’amorces PCR, PE1.0 et PE2.0, et 2x mélange maître haute fidélité (10,5 μL d’ADN, 12,5 μL de 2x mélange maître haute fidélité, 1 μL d’apprêt PCR PE1.0 et 1 μL d’apprêt PCR PE2.0). Ajouter les réactifs dans un tube de centrifugeuse PCR de 0,2 mL et bien mélanger.
- Exécuter la réaction PCR dans la machine PCR: prédénaturation à 95 °C pendant 2 min; puis 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, recuit à 60 °C pendant 15 s, extension à 72 °C pendant 5 s ; une dernière prolongation à 72 °C pendant 5 min. Enfin, incuber la réaction à 4 °C.
- Utilisez l’ADN pour la génération de grappes et effectuez le séquençage par synthèse sur un Illumina Hiseq 2000.
REMARQUE: Dans ce protocole, les cellules d’écoulement Illumina ont été utilisées pour la génération de clusters. Le séquençage par synthèse a été effectué sur un analyseur de génome Illumina en suivant les instructions du fabricant.
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Representative Results
L’organigramme complet de la méthode ChIP-seq est illustré à la figure 1. Des expériences ChIP-seq ont été réalisées en utilisant des anticorps contre H3K4me3 dans la souche de type sauvage P131 et trois souches mutantes nulles dépourvues du gène mobre2, mospp1et moswd2 pour vérifier le profil pangénomique de la distribution de l’histone H3K4me3 chez M. oryzae. Les protoplastes de la souche de type sauvage, Δmobre2, Δmospp1et Δmoswd2, ont été préparés et soniqués à 25% W, sortie 3 s, arrêt 5 s, à 4 °C. De plus, la chromatine a été immunopurifiée avec l’anticorps H3K4me3 et la protéine A/G de Dynabeads. Par la suite, des fragments d’ADN ont été extraits à l’aide de la méthode phénol-chloroforme pour construire une bibliothèque de séquençage et séquencés avec des extrémités uniques sur une plate-forme de séquençage à haut débit.
Les résultats représentatifs des souches de type sauvage, Δmobre2,Δmospp1et Δmoswd2 avec la méthode ChIP-seq utilisant l’anticorps H3K4me3 sont présentés à la figure 2. Les signaux H3K4me3 des mutants de délétion Δmobre2,Δmospp1et Δmoswd2 ont été significativement diminués dans ses régions cibles fonctionnelles. Comme le montre la figure 2,certains gènes cibles candidats sélectionnés, notamment MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 et MGG_04235, ont été cartographiés pour la distribution de H3K4me3. Par rapport à la souche de type sauvage P131, les signaux des lectures enrichies de H3K4me3-ChIP-seq dans les mutants de délétion Δmobre2, Δmospp1et Δmoswd2 ont été largement diminués(Figure 2)26. Ces résultats suggèrent que la modification H3K4me3 joue un rôle important dans la régulation de l’expression du gène cible chez M. oryzae.
Graphique 1. Organigramme de la méthode ChIP-seq dans M. oryzae. (A) L’ADN génomique de M. oryzae a étéréticulé avec 1% de formaldéhyde. (B) Des cellules de champignon de blaste lysées, de l’ADN cassé, de l’ADN libre et de l’ADN liant les histones ont ensuite été obtenus. (C) Des fragments d’ADN liés aux histones et ont été extraits par liaison spécifique à l’anticorps H3K4me3. (D) Grâce à la réticulation inverse, l’ADN purifié a ensuite obtenu des fragments d’ADN modifiés par les histones H3K4me3. (E-F) Des fragments d’ADN ont été séquencés, les résultats du séquençage ont été comparés et des séquences ont été identifiées dans le groupe ADN de M. oryzae. (G) Des gènes et des loci spécifiques des histones H3K4me3 chez M. oryzae ont été récupérés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Les mutants de délétion Δmobre2,Δmospp1et Δmoswd2 ont significativement diminué les profils H3K4me3 dans leurs régions cibles. La distribution H3K4me3-ChIP-seq des pics enrichis autour des régions codantes des gènes superposés chez les mutants de délétion Δmobre2,Δmospp1et Δmoswd2 est décrésasée par rapport à la souche de type sauvage dans lesgènes MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 et MGG_0423526. Le nombre en WT (entrée) étiqueté comme [0-2074] signifie signifie les résultats de ChIP dans la gamme de l’ADN génomique [0-2074]. [0-2074] fait référence à 0-2074bp du chromosome 6.La figure montre une sélection aléatoire des résultats du séquençage, qui ne représente que la distribution de l’ADN sur le chromosome 6. Les résultats complets du séquençage ont été soumis à Genbank. (https/www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ accession 649321) 26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Matricule | Nom de l’exemple | Numéro de série de l’échantillon | Nombre de tubes | Total (μg) | Distribution des fragments | Type de base de données | Remarques | ||||
| 1 | entrée | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Le pic principal est inférieur à 100 pb, mais il y a une distribution de l’ADN entre 100 pb et 500 pb | ChIP-seq | Le fragment est trop petit | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Entrée | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Le pic principal est inférieur à 100 pb, mais il y a une distribution de l’ADN entre 100 pb et 500 pb | ChIP-seq | Le fragment est trop petit | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | entrée Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Le pic principal est inférieur à 100 pb, mais il y a une distribution de l’ADN entre 100 pb et 500 pb | ChIP-seq | Le fragment est trop petit | ||||
| 4 | entrée Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Le pic principal est inférieur à 100 pb, mais il y a une distribution de l’ADN entre 100 pb et 500 pb | ChIP-seq | Le fragment est trop petit | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Le pic principal se situe entre 100 bp et 500 bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Le pic principal se situe entre 100 bp et 500 bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Le pic principal se situe entre 100 bp et 500 bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Le pic principal se situe entre 100 bp et 500 bp | ChIP-seq | |||||
Tableau 1. La quantité totale d’ADN dans cette expérience. La quantité totale d’entrée P131(2) est de 2,7948 μg, la quantité totale de Δmobre2(3) (entrée) est de 2,4748 μg, la quantité totale de Δmospp1(4) (entrée) est de 3,22 μg, la quantité totale de Δmoswd2 (5) (entrée) est de 3,97 μg, et la quantité totale de P131(2) est de 0,0735 μg, la quantité totale de Δmobre2(3) est de 0,0491μg, la quantité totale de Δmospp1(4) est de 0,0288 μg, la quantité totale de Δmoswd2(5) est de 0,0527 μg.
Graphique 3. Détection par électrophorèse de l’ADN après échographie. Après la sonication par ultrasons, l’ADN est soumis à une expérience de gel d’agarose à 1% pour analyser la longueur des fragments d’ADN. La longueur du fragment d’ADN sonique est de 200 à 500 bp, et ces fragments d’ADN peuvent être utilisés pour les étapes suivantes de ChIP-seq. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Trace de bioanalyseur d’échantillons Input et ChIP. La figure montre la distribution des fragments de chaque échantillon, où l’abscisse représente la taille du fragment et l’ordonnée représente la taille maximale. Les échantillons exécutés sur le bioanalyseur sont l’entrée P131(2), Δmobre2(3) (entrée), Δmospp1(4) (entrée), Δmoswd2(5) (entrée), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Parmi eux, la distribution de l’entrée P131 (2), Δmobre2(3) (entrée), Δmospp1(4) (entrée), Δmoswd2(5) (entrée) montre que le pic principal est inférieur à 100 pb, mais il y a une distribution de l’ADN à 100-500 pb. La distribution réelle de P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) et Δmoswd2(5) est comprise entre 100-500 bp comme pic principal26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Récemment, ChIP-seq est devenu une méthode d’analyse génomique largement utilisée pour déterminer les sites de liaison des TF ou des sites d’enrichissement modifiés par des histones spécifiques. Par rapport à la technologie ChIP-seq précédente, la nouvelle technologie ChIP-seq est très sensible et flexible. Les résultats sont fournis en haute résolution sans effets négatifs, tels que le signal de bruit causé par l’hybridation non spécifique des acides nucléiques. Bien qu’il s’agit d’une analyse courante de l’expression génique, de nombreuses méthodes de calcul ont été validées, et la complexité des données ChIP-seq en termes de bruit et de variabilité rend ce problème particulièrement difficile à surmonter pour ChIP-seq. En termes d’analyse de données, la gestion et l’analyse de la grande quantité de données générées par les expériences ChIP-seq est également un défi qui n’a pas encore été relevé de manière adéquate.
Il y a plusieurs étapes clés dans l’expérience ChIP-seq. Tout d’abord, la préparation des protoplastes est très importante. Il est nécessaire de contrôler le temps d’effondrement afin que des protoplastes de haute qualité puissent être collectés. L’échographie est également très importante, le temps d’échographie doit être contrôlé, trop long ou trop court ne fonctionnera pas. Deuxièmement, la quantité d’anticorps ajoutée devrait être suffisante pour faciliter l’enrichissement de plus de fragments d’ADN qui se lient à la protéine. Lors de la vérification de la qualité et de la quantité d’ADN précipitée dans l’expérience ChIP-seq, le fluoromètre Qubit a été utilisé. Agilent 2100 a été utilisé pour détecter la concentration massique et la distribution des fragments d’ADN, ce qui fournit une base pour savoir si l’échantillon peut être utilisé pour des expériences ultérieures d’établissement et de séquençage de la bibliothèque.
Dans l’ensemble, ce protocole améliore la compréhension de la distribution à l’échelle du génome entier des modifications épigénétiques qui régulent les gènes pathogènes pendant l’infection pathogène. Cette méthode contribuera à identifier les mécanismes moléculaires des modifications épigénétiques et à identifier de nouveaux gènes cibles au cours du développement de champignons et de la pathogenèse induite chez M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré qu’il n’existait pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 31871638), le projet spécial de recherche scientifique de l’Université d’agriculture de Beijing (YQ201603), le projet scientifique du Comité éducatif de Beijing (KM201610020005), le projet de culture de recherche scientifique de haut niveau de BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
