Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.
Abstract
O sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq) é uma técnica molecular poderosa e amplamente utilizada para mapear locais inteiros do genoma de fatores de transcrição (TFs), reguladores de cromatina e modificações de histona, bem como detectar genomas inteiros para descobrir padrões de ligação TF e modificações pós-translationais de histona. Atividades modificadoras de cromatina, como a metilação de histona, são frequentemente recrutadas para sequências regulatórias genéticas específicas, causando alterações localizadas nas estruturas de cromatina e resultando em efeitos transcricionais específicos. A explosão de arroz é uma doença fúngica devastadora no arroz em todo o mundo e é um sistema modelo para estudar a interação fungo-planta. No entanto, os mecanismos moleculares em como as modificações de histona regulam seus genes de virulência em Magnaporthe oryzae permanecem evasivos. Mais pesquisadores precisam usar o ChIP-seq para estudar como a modificação epigenética histona regula seus genes-alvo. O ChIP-seq também é amplamente utilizado para estudar a interação entre proteína e DNA em animais e plantas, mas é menos utilizado no campo da patologia vegetal e não foi bem desenvolvido. Neste artigo, descrevemos o processo experimental e o método de operação do ChIP-seq para identificar a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3) que se liga aos genes-alvo funcionais em M. oryzae. Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.
Introduction
Epigenética é um ramo de pesquisa genética que se refere à mudança hereditária da expressão genética sem alterar a sequência nucleotídea dos genes. Um número crescente de estudos tem demonstrado que a regulação epigenética desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento de células eucarióticas, incluindo a cromatina que regula e afeta a expressão genética através do processo dinâmico de dobra e montagem em estruturas de altaordem 1,2. A remodelação da cromatina e a modificação da histona covalente afetam e regulam a função e a estrutura da cromatina através da variação dos polímeros de cromatina, alcançando assim a função de regular a expressão genética3,4,5,6. As modificações pós-transacionais da histona incluem acetilação, fosforilação, metilação, monoubiquização, sumôilação e ribossilação ADP7,8,9. A metilação histona H3K4, particularmente a trimetilação, foi mapeada para locais de início de transcrição onde está associada à replicação de transcrição, recombinação, reparo e processamento de RNA em eucariotes10,11.
A tecnologia ChIP-seq foi introduzida em 2007 e tornou-se o padrão experimental para a análise em todo o genoma da regulação transcricional e dos mecanismos epigenéticos12,13. Este método é adequado na escala genoma-em toda-genoma e para a obtenção de informações de interação de histona ou fator de transcrição, incluindo segmentos de DNA de proteínas de ligação de DNA. Qualquer sequência de DNA cruzada a proteínas de interesse coprecipitará como parte do complexo de cromatina. Técnicas de sequenciamento de nova geração também são usadas para sequenciar 36-100 bp de DNA, que são então combinadas com o genoma alvo correspondente.
Em fungos fitopatômicos, a pesquisa começou recentemente a estudar como modificações de metilação de histona regulam seus genes-alvo no processo de patogenicidade. Alguns estudos anteriores provaram que a regulação de genes relacionados à histona methylase é refletida principalmente no silenciamento genético e na catalisação da produção de Metabólitos Secundários (SM). MoSet1 é o metilase H3K4 em M. oryzae. O nocaute deste gene resulta na exclusão completa da modificação H3K4me314. Em comparação com a cepa do tipo selvagem, a expressão do gene MoCEL7C no mutante é inibida no estado induzido pelo CMC e no estado não induzido (glicose ou celobiose), a expressão de MoCEL7C aumentou15. Em Fusarium graminearum, KMT6 pode catalisar a modificação da metilação de H3K27me3, regular o desenvolvimento normal de fungos e ajudar a regular o "genoma enigmático" contendo o aglomerado genético SM16,17,18,19. Em 2013, Connolly relatou que a metilação H3K9 e H3K27 regula o processo patogênico de fungos através de metabólitos secundários e fatores efeitos que regulam a inibição dos genes-alvo20. Em Aspergillus,a modificação das histonas H3K4me2 e H3K4me3 está relacionada à ativação genética e desempenha um papel importante no controle da regulação do nível de cromatina dos aglomerados genéticos SM21. Em M. oryzae, Tig1 (homólogo de Tig1 em leveduras e mamíferos) é um HADC (histone deacetylase)22. Nocaute do gene Tig1 leva à perda completa da patogenicidade e capacidade de produção de esporos no mutante nulo. É mais sensível a um ambiente peroxígeno, que não pode produzir hifasinfecciosas 22.
A explosão de arroz causada por M. oryzae. é uma das doenças de arroz mais graves na maioria das áreas de cultivo de arroz no mundo19. Devido ao seu processo de infecção representativa, M. oryzae é semelhante ao processo de infecção de muitos fungos patogênicos importantes. Como pode facilmente realizar operações genéticas moleculares, o fungo tornou-se um organismo modelo para estudar as interações fúngicos-vegetais23. Bloquear cada etapa do processo de infecção de M. oryzae pode resultar em infecção mal sucedida. As alterações morfológicas durante o processo de infecção são estritamente reguladas por toda a função do genoma e transcrição genética. Entre elas, modificações epigenéticas como a metilação de histona desempenham um papel essencial na regulação transcricional dos genes funcionais24,25. No entanto, até agora, poucos estudos foram feitos sobre o mecanismo molecular de modificações epigenéticas como a metilação de histona e acetilação de histona na transcrição de genes de patogênese em M. oryzae. Portanto, desenvolver ainda mais o mecanismo de regulação epigenética do fungo da explosão de arroz, enquanto pesquisa a rede reguladora a montante e a jusante desses genes relacionados à patogenicidade ajudará a desenvolver estratégias de prevenção e controle da explosão de arroz.
Com o desenvolvimento de genômicas funcionais como o ChIP-seq, especialmente na epigenética, este método de aquisição de dados de alto rendimento acelerou a pesquisa sobre cromossomos. Usando a tecnologia experimental ChIP-seq, a distribuição em todo o genoma da metilação de histona (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) em M. oryzae e outros fungos filamentosos pode ser identificada. Portanto, este método pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à forma como modificações epigenéticas regulam seus genes alvos candidatos durante a patogênese fúngica na patologia vegetal.
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Protocol
1. Preparação de protoplastos de M. oryzae
- Prepare o ágar de aveia-tomate (OTA).
- Pese 30-50 g de aveia e ferva-a em 800 mL de água (ddH2O) por 20 min. Filtre duas camadas de gaze e pegue a filtrada.
- Pegue tomates maduros e descasque-os. Esprema o suco e filtre duas camadas de gaze para coletar 150 mL do suco filtrado.
- Misture todo o suco de tomate e a aveia preparada filtrar bem e adicione ddH2O até 1000 mL.
- Adicione 250 mL do OTA e 2,5 g de ágar em pó a um frasco cônico de 500 mL e autoclave por 20 min. Armazenar a 25 °C.
- Despeje 25 mL da OTA autoclavada em uma placa de vidro de 5 cm x 5 cm de Petri. Prepare 10 desses pratos petri no total. Depois que o OTA se solidificar nas placas de Petri, armazene os pratos de cabeça para baixo a 25 °C.
- Use um palito esterilizado para cavar um pequeno pedaço de micélio de M. oryzae (a cepa selvagem P131, as cepas de nocaute Δmobre2, Δmospp1 e Δmoswd2) e colocá-los nos pratos OTA preparados. Cultuá-los por 4-6 dias a 28 °C em condições de luz.
NOTA: Vire a placa de Petri de cabeça para baixo para evitar a poluição. - Adicione 1000 μL de líquido Meio Completo (CM) (extrato de levedura de 0,6%, 0,3% hidrolise enzimática de caseína, 0,3% hidrolise de caixa ácida, 1% glicose) aos pratos OTA utilizando uma pipeta de 1000 μL.
NOTA: A hifa cresceu nos pratos OTA por 4-6 dias. - Raspe a micélia da cepa tipo selvagem e a tensão de nocaute com um laço de inoculação.
- Recolhe os detritos de micécânia e transfira-os para 250 mL de meio completo líquido (CM).
- Cresça os detritos fúngicos em um frasco triangular a 28 °C por 36 h com agitação a 150 rpm.
- Use um funil para filtrar e coletar a hifa fúngica.
- Lave a hifa fúngica com 500 mL de solução nacl de 0,7 M.
- Pegue o micélio fúngico e pese-o.
NOTA: O micélio não precisa ser seco antes da pesagem. - Adicione ~1 mL de solução de permeação de enzimas de lise por 1 g do micélio fúngico.
- Prepare a solução de permeação de enzima de 20 mg/mL dissolvendo a enzima de lise de Trichoderma harzianum em 0,7 M NaCl.
- Coloque a hifa para lise a 28 °C durante 3-4 h com agitação a 150 rpm.
- Lave a hifa lícida com 50 mL de solução nacl de 0,7 M.
- Colete os protoplastas e centrífugas por 15 minutos a 2.000 x g e 4 °C.
- Após a centrifugação, descarte o supernatante cuidadosamente. Resuspenda os protoplastos em 20 mL de tampão NaCI de 0,7 M a 4 °C.
2. In vivo crosslinking e sonication
- Adicione 55 μL de formaldeído de 37% (adicione formaldeído gota por gota até que a concentração final seja de 1%) a 2 mL de tampão NaCI contendo protoplastia para crosslinking.
- Incubar os protoplastas a 25 °Cfor 10 min.
- Adicione 20 μL de glicina de 10x a cada tubo para saciar o formaldeído não redigido.
- Redemoinho para misturar e incubar a 25 °C por 5 min.
- Centrifugar por 15 min a 2.000 x g e 4 °C.
- Após a centrifugação, descarte o supernatante cuidadosamente. Resuspense a pelota em 1 mL de solução NaCI de 0,7 M.
- Centrifugar por 10 min a 2.000 x g e 4 °C.
- Após a centrifugação, descarte o supernatante cuidadosamente. Resuspense a pelota em 750 μL de tampão RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% SDS e inibidores de protease).
- Adicione 37,5 μL de inibidor de protease 20x.
- Transfira os protoplastos da etapa anterior para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Realize a sonicação (25% W, saída 3 s, parada 5 s, 4 °C) imediatamente com um sonicator por cerca de 10 min. O objetivo desta etapa é sonicar o lise transversal por um período de tempo para determinar as melhores condições.
NOTA: O lise pode ser congelado a -80 °C nesta etapa. - Se as condições ideais para a sônica já foram determinadas, proceda para o próximo passo.
- Se desejar, remova 5 μL de protoplastos para análise de gel de agarose (DNA nãosheared).
- Tesourar a cromatina por sonicação com um homogeneizador ultrassônico por 8 min (25% W, saída 3 s, stop 5 s, 4 °C).
- Depois que a amostra estiver ultrasonicamente quebrada, tire uma parte da amostra como "entrada".. A entrada não realiza o experimento ChIP e contém todo o DNA e proteína liberados após a amostra ser sônica.
- Após a sônica, execute uma eletroforese de gel de 1% para analisar o comprimento dos fragmentos de DNA.
NOTA: Os resultados da eletroforese do gel agarose mostram que o comprimento do fragmento de DNA é de 200-500 bp(Figura 4). - Coloque o tubo sonicado no gelo para evitar a degradação da proteína.
- Centrifugar por 10 min a 10.000 x g e 4 °C.
- Após a centrifugação, transfira o supernanato centrífufado para um novo tubo de centrífugas de 1,5 mL e armazene-o a -80 °C para uso posterior. A solução de cromatina obtida nesta etapa pode ser usada para IP subsequente.
- Antes de realizar o experimento IP, dilua cada amostra de cromatina para uma razão de 1:10 com tampão RIPA 1x (por exemplo, adicione 10 μL de amostra de cromatina a 1 μL de tampão 1×RIPA).
3. IP de proteína/DNA interligado
- Pipeta 50 μL de contas de proteína superparammagnética em um tubo de centrífuga de 2 mL. Coloque os tubos em um suporte magnético. Deixe as contas magnéticas precipitarem. Remova o supernatante.
- Adicione 1 mL de tampão RIPA 1x (pré-resfriado no gelo) ao tubo e lave as contas de proteína superparammagnética três vezes. Após a lavagem, coloque os tubos em um suporte magnético e remova o sobrenatante. Adicione 100 μL de 1x tampão RIPA a cada tubo.
- Adicione 300 μL de amostra de chormatin (2 x 107 células foram utilizadas), 100 μL de contas de proteína superparamagnetica e 4 μL de anticorpo H3K4me3 ao tubo.
- Use amostras com Mouse IgG como controle negativo.
NOTA: O Mouse IgG usado neste protocolo contém tampão fosfato de 0,01 M e 0,15 M NaCl, e permanecerá congelado abaixo de 20 °C (ver Tabela de Materiais). - Depois de misturar bem, coloque as amostras em um agitador rotativo e incubar durante a noite a 4 °C, 30 x g.
NOTA: Pode ser possível reduzir o tempo de incubação da imunoprecipitação (IP). O tempo de incubação depende de diferentes fatores (por exemplo, o anticorpo, alvo genético, tipo celular, etc.) e precisará ser testado empiricamente.
4. Coleta e lavagem dos produtos IP
- Pelota as contas de proteína superparamagnetica colocando-as em um suporte magnético. Aspire e descarte o supernaspe.
- Lave o complexo de proteína superparamagnetica de anticorpos/cromatina, reutilizando as contas em 1 mL de tampão RIPA 1x.
- Enxágüe o tubo em um agitador rotativo por 5 min e remova o sobrenatante a 30 x g.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem do complexo imunológico de baixo sal (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 e 150 mM NaCl).
- Enxágüe o tubo em um agitador rotativo por 5 minutos e remova o sobrenatante.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem complexo imunológico de sal alto (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 e 500 mM NaCl) ao tubo centrífuga.
- Coloque o tubo em um agitador rotativo por 5 minutos e remova o sobrenatante.
- Enxágüe com 1 mL de LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% ácido desoxicólico, 1 mM EDTA e 10 mM Tris-HCl pH 8.1) no tubo centrífuga.
- Coloque o tubo em um agitador rotativo por 5 minutos e remova o sobrenatante.
- Enxágüe novamente o tubo de ensaio com 1 mL de tampão LiCI de 0,25 M, remova o supernasciante com uma pipeta e, em seguida, descarte o supernatante.
- Adicione 1 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA).
- Coloque o tubo em um agitador rotativo por 5 min a 30 x g.
- Lave o tubo novamente com 1 mL de tampão TE e remova o supernatante com uma pipeta.
- Pegue as contas.
5. Eluição de complexos de proteína/DNA
- Prepare o tampão de eluição (10 μL de 20% SDS, 20 μL de 1 M NaHCO3, 170 μL de H2O destilado estéril) para todos os tubos IP e de entrada.
- Adicione 100 μL de tampão de eluição a cada tubo de centrífuga.
- Elução a 65 °C por 15 min.
- Centrífuga por 1 min a 10.000 x g e 4 °C e colete o sobrenante em novos tubos de centrífuga.
- Repita as etapas 5.2 - 5.4 e misture os elunatos. Adicione 190 μL de tampão de eluição aos 10 μL do DNA de entrada. (volume total = 200 μL).
6. Crosslinking reverso de complexos de proteína/DNA
- Adicione 8 μL de 5 M NaCl a todos os tubos e incubar a 65 °C por 4-5 h ou durante a noite para reverter os crosslinks de proteína de DNA.
NOTA: Após esta etapa, armazene as amostras a -20 °C e continue o protocolo no dia seguinte, se necessário. - Adicione 1 μL de RNase A e incubar por 30 min a 37 °C.
- Adicione 4 μL de Proteinase K (dissolvido em H2O a 20 mg/mL e armazenado a -20 °C) a cada tubo e incubar a 45 °C por 1-2 h.
7. Purificação e recuperação do DNA
- Adicione 550 μL de mistura de fenol/clorofórmio/isoamílico (razão de 25:24:1) ao tubo de centrífuga.
- O vórtice da mistura por 1 min.
- Centrifugar por 15 min a 10.000 x g e aspirar o supernante.
- Transfira o supernatante extraído da etapa anterior para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 1/10 de volume de solução de acetato de sódio de 3 M, 2,5 volumes de etanol absoluto e 3 μL de glicogênio (20 mg/mL) ao tubo.
- Coloque a amostra em uma geladeira a -20 °C durante a noite para precipitação.
- Centrifugar por 15 min a 10.000 x g e 4 °C.
- Descarte o supernatante após a centrifugação. Lave a pelota três vezes com 1 mL de 75% de etanol (precisa ser preparado fresco) a 10.000 x g.
- Coloque o precipitado lavado em um banco limpo para deixar o álcool secar.
- Adicione 50 μL de H2O desionizado estéril para dissolver suficientemente o precipitado.
- Ligate o adaptador de sequência ao fragmento de DNA e use uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento para sequenciar o DNA.
8. Reparo de DNA e construção da biblioteca Solexa
- Repare as extremidades do DNA para gerar DNA sem corte usando um kit de reparação final de DNA (1-34 μL DE DNA, 5 μL de tampão de reparação final de 10x, 5 μL de 2,5 mM cada dNTP, 5 μL de 10 mM ATP, 1 μL de mistura de enzima de reparação final e H2O para ajustar a reação de volume para 49 ΜL).
- Use um kit de purificação PCR ou fenol: extração de clorofórmio para purificar o DNA. Elute ou resuspense o DNA em 30 μL de 1x TE pH 7.4.
- Adicione "A" a 3' (30 μL de DNA da etapa 2, 2 μL de H2O, 5 μL de tampão Taq 10x, 10 μL de 1 mM dATP e 3 μL de polimerase de DNA Taq). Adicione os reagentes a um tubo de centrífugo PCR de 0,2 mL, misture bem e reaja em uma máquina PCR a 72 °C por 10 min.
- Realize a ligadura de linker misturando 10 μL de DNA, 9,9 μL de H2O, 2,5 μL de tampão de ligase de DNA T4, 0,1 μL de mistura de oligo adaptador e 2,5 μL de ligase de DNA T4. Adicione os reagentes a um tubo de centrífuga PCR de 0,2 mL e misture bem. Incubar a 16 °C por 4 h.
- Purificar o DNA usando um kit de purificação pcr de acordo com o protocolo do fabricante. Elute com 20-25 μL de tampão de eluição.
- Antes que a biblioteca de DNA seja estabelecida, identifique a concentração do DNA purificado para confirmar seu uso para os experimentos subsequentes de sequenciamento.
- Detecte a concentração de DNA usando um fluorômetro. Depois de derreter a amostra no gelo, misture-a bem e centrífuga para 30 s a 1000 x g e 4 °C. Em seguida, pegue uma quantidade apropriada de amostra e meça-a em um fluorômetro com um comprimento de onda de 260 nm.
- Coloque amostras de DNA com qualidade e concentração qualificadas na plataforma de sequenciamento de Illumina para sequenciamento.
- Antes do sequenciamento, amplie o DNA usando primers PCR, PE1.0 e PE2.0, e 2x high fidelity master mix (10,5 μL de DNA, 12,5 μL de 2x high fidelity master mix, 1 μL de PCR primer PE1.0 e 1 μL de PCR primer PE2.0). Adicione os reagentes a um tubo de centrífuga PCR de 0,2 mL e misture bem.
- Execute a reação pcr na máquina PCR: 95 °C de predenaturação por 2 min; em seguida, 35 ciclos de denaturação de 95 °C para 10 s, ressarando a 60 °C para 15 s, extensão a 72 °C para 5 s; uma extensão final a 72 °C por 5 min. Por fim, incubar a reação a 4 °C.
- Use o DNA para geração de cluster e realize sequenciamento por síntese em um Illumina Hiseq 2000.
NOTA: Neste protocolo, as células de fluxo de illumina foram utilizadas para a geração de clusters. O sequenciamento por síntese foi realizado em um Analisador de Genoma de Illumina seguindo as instruções do fabricante.
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Representative Results
Todo o fluxograma do método ChIP-seq é mostrado na Figura 1. Os experimentos chIP-seq foram realizados usando anticorpos contra H3K4me3 na cepa de tipo selvagem P131 e três cepas mutantes nulas que eram desprovidas de mobre2, mospp1e gene moswd2 para verificar todo o perfil genoma da distribuição histone H3K4me3 em M. oryzae. Os protoplastos da cepa do tipo selvagem, Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2, foram preparados e sonicados a 25% W, saída 3 s, parada 5 s, a 4 °C. Além disso, a cromatina foi imunopurizada com anticorpo H3K4me3 e proteína Dynabeads A/G. Posteriormente, fragmentos de DNA foram extraídos usando o método fenol-clorofórmio para a construção de uma biblioteca de sequenciamento e sequenciados com extremidades únicas em uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento.
Os resultados representativos das cepas de tipo selvagem, Δmobre2,Δmospp1eΔ moswd2 com método ChIP-seq utilizando o anticorpo H3K4me3 são mostrados na Figura 2. Os sinais de H3K4me3 dos mutantes de deleção Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 foram significativamente diminuídos em suas regiões-alvo funcionais. Como mostrado na Figura 2, alguns genes-alvo selecionados, incluindo MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 e MGG_04235, foram mapeados para distribuição H3K4me3. Em comparação com a cepa selvagem P131, os sinais de leituras enriquecidas de H3K4me3-ChIP-seq nomobre2 Δ, Δmospp1e Δmoswd2 foram largamente diminuídos(Figura 2)26. Esses resultados sugerem que a modificação do H3K4me3 desempenha papéis importantes na regulação da expressão genética-alvo em M. oryzae.
Figura 1. O fluxograma do método ChIP-seq em M. oryzae. (A) O DNA genômico de M. oryzae foicruzado com 1% de formaldeído. (B) Células de fungos de explosão lysed, DNA quebrado, DNA livre e DNA de ligação de histona foram posteriormente obtidos. (C) Fragmentos de DNA ligados às histonas e foram extraídos por ligação específica ao anticorpo H3K4me3. (D) Através do crosslinking reverso, o DNA purificado obteve posteriormente fragmentos de DNA modificados por histones H3K4me3. (E-F) Fragmentos de DNA foram sequenciados, os resultados de sequenciamento foram comparados, e sequências foram identificadas no grupo de DNA M. oryzae. (G) Genes específicos e loci de histonas H3K4me3 em M. oryzae foram recuperados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os mutantes de Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 diminuíram significativamente os perfis de H3K4me3 em suas regiões-alvo. A distribuição H3K4me3-ChIP-seq de picos enriquecidos ao redor das regiões de codificação de genes sobrepostos em Δmobre2, Δmospp1e Δmoswd2 desmotos são decresased em comparação com a cepa do tipo selvagem nosgenes MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 e MGG_0423526. O número em WT (entrada) rotulado como [0-2074] significa os resultados de ChIP na gama de DNA genômico [0-2074]. [0-2074] refere-se a 0-2074bp de Cromossomo 6.A figura mostra uma seleção aleatória dos resultados de sequenciamento, que representa apenas a distribuição de DNA no Cromossomo 6. Os resultados completos de sequenciamento foram submetidos ao Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ accession 649321) 26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número de série | Nome da amostra | Número de série da amostra | Número de tubos | Total (μg) | Distribuição de fragmentos | Tipo de banco de dados | Observações | ||||
| 1 | entrada | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | O pico principal é abaixo de 100bp, mas há distribuição de DNA entre 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmento é muito pequeno | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Entrada | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | O pico principal é abaixo de 100bp, mas há distribuição de DNA entre 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmento é muito pequeno | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | entrada Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | O pico principal é abaixo de 100bp, mas há distribuição de DNA entre 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmento é muito pequeno | ||||
| 4 | entrada Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | O pico principal é abaixo de 100bp, mas há distribuição de DNA entre 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmento é muito pequeno | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | O pico principal é entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | O pico principal é entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | O pico principal é entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | O pico principal é entre 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Mesa 1. A quantidade total de DNA neste experimento. A quantidade total de entrada P131(2) é de 2,7948 μg, a quantidade total de Δmobre2(3) (entrada) é de 2,4748 μg, o valor total de Δmospp1(4) (entrada) é de 3,22 μg, a quantidade total de Δmoswd2 (5) (entrada) é de 3,97 μg, e a quantidade total de P131(2) é de 0,0735 μg, a quantidade total de Δmobre2(3) é de 0,0491g, o valor total de Δmospp1(4) é de 0,0288 μg, a quantidade total de Δmoswd2(5) é de 0,0527 μg.
Figura 3. Detecção de eletroforese de DNA após ultrassom. Após a sônica do ultrassom, o DNA é submetido a um experimento de gel de 1% de agarose para analisar o comprimento dos fragmentos de DNA. O comprimento do fragmento de DNA sonicado é de 200-500 bp, e esses fragmentos de DNA podem ser usados para as seguintes etapas de ChIP-seq. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Traço bioanalyzer de amostras de Insumo e ChIP. A figura mostra a distribuição de fragmentos de cada amostra, onde a abscissa representa o tamanho do fragmento, e a ordinada representa o tamanho do pico. As amostras em execução no bioanalílise são entrada P131(2), Δmobre2(3) (entrada), Δmospp1(4) (entrada), Δmoswd2(5) (entrada), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Entre eles, a distribuição de entrada P131(2), Δmobre2(3) (entrada), Δmospp1(4) (entrada), Δmoswd2(5) (entrada) mostra que o pico principal é inferior a 100 bp, mas há distribuição de DNA em 100-500 bp. A verdadeira distribuição de P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) e Δmoswd2(5) está entre 100-500 bp como o pico principal26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Recentemente, o ChIP-seq tornou-se um método de análise genômica amplamente utilizado para determinar os locais de vinculação de TFs ou locais de enriquecimento modificados por histones específicos. Em comparação com a tecnologia ChIP-seq anterior, a nova tecnologia ChIP-seq é altamente sensível e flexível. Os resultados são fornecidos em alta resolução sem efeitos negativos, como o sinal de ruído causado pela hibridização não específica dos ácidos nucleicos. Embora esta seja uma análise comum de expressão genética, muitos métodos computacionais foram validados, e a complexidade dos dados chip-seq em termos de ruído e variabilidade torna este problema particularmente difícil para o ChIP-seq superar. Em termos de análise de dados, gerenciar e analisar a grande quantidade de dados gerados pelos experimentos chip-seq também é um desafio que ainda não foi adequadamente abordado.
Existem vários passos-chave no experimento ChIP-seq. Em primeiro lugar, a preparação dos protoplastos é muito importante. É necessário controlar o tempo de colapso para que protoplastos de alta qualidade possam ser coletados. O ultrassom também é muito importante, o tempo de ultrassom deve ser controlado, muito longo ou muito curto não vai funcionar. Em segundo lugar, a quantidade de anticorpos adicionados deve ser suficiente para facilitar o enriquecimento de mais fragmentos de DNA que se ligam à proteína. Ao verificar a qualidade e quantidade de DNA precipitados no experimento ChIP-seq Qubit Fluorometer foi usado. O Agilent 2100 foi utilizado para detectar a concentração de massa e a distribuição de fragmentos do DNA, o que fornece uma base para saber se a amostra pode ser usada para experimentos subsequentes de estabelecimento de bibliotecas e sequenciamento.
No geral, este protocolo aumenta a compreensão de toda a distribuição em todo o genoma de modificações epigenéticas que regulam genes patogênicos durante a infecção por patógenos. Este método contribuirá para identificar mecanismos moleculares de modificações epigenéticas e identificar novos genes-alvo durante o desenvolvimento de fungos e patogênese induzida por patógenos em M. oryzae e outros fungos filamentosos.
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Disclosures
Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), pelo Special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), pelo Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM20161002005), o projeto de cultivo de pesquisa científica de alto nível da BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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