Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل التوزيع على نطاق الجينوم لتعديلات الهستون، والتي يمكن أن تحدد الجينات المستهدفة الجديدة في مسببات الأمراض من M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية.
Abstract
تسلسل كروماتين المناعي (ChIP-seq) هو تقنية جزيئية قوية وتستخدم على نطاق واسع لرسم خرائط مواقع الجينوم الكاملة لعوامل النسخ (TFs) ومنظمي الكروماتين وتعديلات الهستون ، بالإضافة إلى الكشف عن الجينوم بأكمله للكشف عن أنماط ربط TF والتعديلات اللاحقة للترانسان. وغالبا ما يتم توظيف أنشطة تعديل الكروماتين، مثل ميثيل الهستون، في تسلسلات تنظيمية جينية محددة، مما يسبب تغييرات موضعية في هياكل الكروماتين ويؤدي إلى آثار نسخ محددة. انفجار الأرز هو مرض فطري مدمر على الأرز في جميع أنحاء العالم وهو نظام نموذجي لدراسة التفاعل بين الفطريات والنبات. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية في كيفية تنظيم تعديلات الهستون جيناتها الفوعة في Magnaporthe oryzae لا تزال بعيدة المنال. يحتاج المزيد من الباحثين إلى استخدام ChIP-seq لدراسة كيفية تنظيم تعديل الهستون اللاجيني لجيناتهم المستهدفة. يستخدم ChIP-seq أيضا على نطاق واسع لدراسة التفاعل بين البروتين والحمض النووي في الحيوانات والنباتات ، ولكنه أقل استخداما في مجال علم الأمراض النباتية ولم يتم تطويره بشكل جيد. في هذه الورقة، نقوم بوصف العملية التجريبية وطريقة التشغيل ل ChIP-seq لتحديد التوزيع على نطاق الجينوم لمثيلة الهستون (مثل H3K4me3) الذي يرتبط بالجينات المستهدفة الوظيفية في M. oryzae. هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل التوزيع على نطاق الجينوم لتعديلات الهستون، والتي يمكن أن تحدد الجينات المستهدفة الجديدة في مسببات الأمراض من M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية.
Introduction
علم الوراثة اللاجينية هو فرع من البحوث الجينية التي تشير إلى التغيير الوراثي للتعبير الجيني دون تغيير تسلسل النيوكليوتيدات من الجينات. وقد أظهرت عدد متزايد من الدراسات أن التنظيم اللاجيني يلعب دورا هاما في نمو وتطور الخلايا eukaryotic، بما في ذلك الكروماتين الذي ينظم ويؤثر على التعبير الجيني من خلال العملية الديناميكية للطي والتجمع في هياكل أعلىترتيبا 1،2. الكروماتين إعادة عرض وتعديل الهستون التكافؤ تؤثر وتنظم وظيفة وهيكل الكروماتين من خلال الاختلاف من البوليمرات الكروماتين، وبالتالي تحقيق وظيفة تنظيم التعبير الجيني3،4،5،6. وتشمل التعديلات ما بعد النقل من الهستون أستيل، الفوسفور، الميثيل، أحادية الوجود، السومويل، وDP ريبوسيليشن7،8،9. وقد تم تعيين ميثيل H3K4 الهستون، وخاصة تريميثيليشن، إلى مواقع بدء النسخ حيث يرتبط مع النسخ المتماثل، وإعادة التركيب، وإصلاح، وتجهيز الحمض النووي الريبي في eukaryotes10،11.
تم تقديم تقنية ChIP-seq في عام 2007 وأصبحت المعيار التجريبي للتحليل على نطاق الجينوم للتنظيم النسخي والآليات اللاجينية12و13. هذه الطريقة مناسبة على نطاق الجينوم وللحصول على معلومات التفاعل بين الهستون أو معامل النسخ، بما في ذلك شرائح الحمض النووي من بروتينات الحمض النووي الملزمة. أي تسلسل الحمض النووي مترابطة إلى البروتينات ذات الفائدة سوف coprecipitate كجزء من مجمع الكروماتين. وتستخدم تقنيات تسلسل الجيل الجديد أيضا لتسلسل 36-100 نقطة أساس من الحمض النووي، والتي يتم مطابقتها بعد ذلك مع الجينوم المستهدف المقابل.
في الفطريات النباتية ، بدأت الأبحاث مؤخرا في دراسة كيفية تنظيم تعديلات ميثيل الهستون جيناتها المستهدفة في عملية الإمراض. أثبتت بعض الدراسات السابقة أن تنظيم الجينات المرتبطة ميثيلاز الهستون ينعكس أساسا في إسكات الجينات وتحفيز إنتاج الأيض الثانوي (SM). MoSet1 هو ميثيلاز H3K4 في م. أوريزا. خروج المغلوب من هذا الجين النتائج في الحذف الكامل للتعديل H3K4me314. بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع, التعبير عن MoCEL7C الجينات في متحولة هو تثبيط في الحالة الناجمة عن CMC وفي حالة غير المستحثة (الجلوكوز أو cellobiose), التعبير عن MoCEL7C زيادة 15. في Fusarium graminearum، KMT6 يمكن أن تحفز تعديل الميثيل من H3K27me3 ، وتنظيم التطور الطبيعي للفطريات ، وتساعد على تنظيم "الجينوم خفي" التي تحتوي على مجموعة الجينات SM16،17،18،19. في عام 2013، أفاد كونولي أن الميثيل H3K9 و H3K27 ينظم العملية المسببة للأمراض من الفطريات من خلال الأيض الثانوي والعوامل المؤثرة التي تنظم تثبيط الجينات المستهدفة20. في أسبيرجيلوس، يرتبط تعديل الهستونات H3K4me2 و H3K4me3 بتنشيط الجينات ويلعب دورا هاما في التحكم في تنظيم مستوى الكروماتين لمجموعات الجينات SM21. في M. oryzae، Tig1 (متجانسة لTig1 في الخميرة والثدييات) هو HADC (الهستون deacetylase)22. خروج المغلوب من الجين Tig1 يؤدي إلى فقدان كامل للتسبب في المرض والقدرة على إنتاج بوغ في متحولة فارغة. هو أكثر حساسية لبيئة البيروكسيجين، والتي لا يمكن أن تنتج الهيفا المعدية22.
انفجار الأرز الناجم عن م. أوريزا هو واحد من أخطر أمراض الأرز في معظم مناطق زراعة الأرز في العالم19. نظرا لعملية العدوى التمثيلية ، يشبه M. oryzae عملية العدوى للعديد من الفطريات المسببة للأمراض الهامة. كما أنها يمكن أن تنفذ بسهولة العمليات الوراثية الجزيئية، أصبح الفطريات كائن حي نموذجي لدراسة التفاعلات الفطرية والنباتية23. قد يؤدي منع كل خطوة من عملية العدوى من M. oryzae في عدوى غير ناجحة. يتم تنظيم التغيرات المورفولوجية أثناء عملية العدوى بشكل صارم من خلال وظيفة الجينوم بأكملها ونسخ الجينات. من بينها ، تلعب التعديلات اللاجينية مثل ميثيل الهستون دورا أساسيا في التنظيم النسخي للجينات الوظيفية24،25. ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم إجراء سوى القليل من الدراسات على الآلية الجزيئية للتعديلات اللاجينية مثل ميثيل الهستون واستيل الهستون في نسخ جينات الإمراض في M. oryzae. ولذلك، فإن مواصلة تطوير آلية التنظيم اللاجينية لفطريات انفجار الأرز أثناء البحث في الشبكة التنظيمية في المنبع والمصب لهذه الجينات المسببة للأمراض ستساعد على تطوير استراتيجيات الوقاية من انفجار الأرز ومكافحته.
مع تطور علم الجينوم الوظيفي مثل ChIP-seq ، وخاصة في علم الوراثة اللاجينية ، أدت طريقة اكتساب البيانات عالية الإنتاجية هذه إلى تسريع الأبحاث على الكروموسومات. وباستخدام التكنولوجيا التجريبية ChIP-seq، يمكن تحديد التوزيع على نطاق الجينوم لمثيلة الهستون (مثل H3K4me3، H3K27me3، H3K9me3) في M. oryzae وغيرها من الفطريات الخيطية. لذلك ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء كيفية تنظيم التعديلات اللاجينية للجينات المستهدفة المرشحة أثناء الإمراض الفطري في علم الأمراض النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد بروتوبلاستس من م. oryzae
- إعداد أجار دقيق الشوفان الطماطم (OTA).
- تزن 30-50 غرام من دقيق الشوفان ويغلي في 800 مل من الماء (ddH2O) لمدة 20 دقيقة. تصفية من خلال طبقتين من الشاش واتخاذ filtrate.
- اختيار الطماطم الناضجة وقشر لهم. ضغط العصير، وتصفية من خلال طبقتين من الشاش لجمع 150 مل من عصير تصفيتها.
- تخلط جميع عصير الطماطم والشوفان محضرة جيدا وإضافة ddH2O تصل إلى 1000 مل.
- أضف 250 مل من OTA و2.5 غرام من مسحوق أجار إلى قارورة مخروطية سعة 500 مل، و الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة. يخزن عند 25 درجة مئوية.
- صب 25 مل من OTA autoclaved في كوب 5 سم × 5 سم طبق بيتري. إعداد 10 من هذه الأطباق بيتري المجموع. بعد أن توطدت OTA على أطباق بيتري، قم بتخزين الأطباق رأسا على عقب عند 25 درجة مئوية.
- استخدام مسواك معقمة لحفر قطعة صغيرة من الميسيليوم من M. oryzae (سلالة البرية من نوع P131، سلالات خروج المغلوب Δmobre2، Δmospp1، و Δmoswd2)ووضعها على أطباق OTA المعدة. ثقافة لهم لمدة 4-6 أيام في 28 درجة مئوية في ظل ظروف الضوء.
ملاحظة: قم بتشغيل طبق بيتري رأسا على عقب لمنع التلوث. - إضافة 1000 ميكرولتر من السائل المتوسط الكامل (CM) (0.6٪ استخراج الخميرة، 0.3٪ التحلل المائي الأنزيمي، 0.3٪ حمضية كاسيين هيدروليكات، 1٪ الجلوكوز) إلى أطباق OTA باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
ملاحظة: نمت الهيفا على أطباق OTA لمدة 4-6 أيام. - كشط mycelia من سلالة البرية من نوع وسلالة خروج المغلوب مع حلقة التطعيم.
- جمع الحطام mycelia ونقلها إلى 250 مل من السائل المتوسط الكامل (CM).
- زراعة الحطام الفطري في قارورة مثلثة عند 28 درجة مئوية لمدة 36 ساعة مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة.
- استخدام قمع لتصفية وجمع hyphae الفطرية.
- غسل hyphae الفطرية مع 500 مل من محلول NaCl 0.7 M.
- جمع الميسيليوم الفطرية ووزنها.
ملاحظة: لا يحتاج الميسيليوم إلى تجفيفه قبل الوزن. - إضافة ~ 1 مل من محلول تتغلغل إنزيم التحلل لكل 1 غرام من الميسيليوم الفطري.
- إعداد 20 ملغم / مل تحلل إنزيم حل تتغلغل عن طريق حل انزيم التحلل من تريتشوديرما harzianum في 0.7 M NaCl.
- ضع الهيفا للسهر عند 28 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة.
- غسل hyphae lysed مع 50 مل من محلول NaCl 0.7 M.
- جمع البروتوبلاست والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2000 × ز و 4 درجة مئوية.
- بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant بعناية. Resuspend protoplasts في 20 مل من 0.7 M NaCI العازلة في 4 درجة مئوية.
2. في التشابك في الجسم الحي والصوتية
- إضافة 55 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد (إضافة انخفاض الفورمالديهايد عن طريق الانخفاض حتى التركيز النهائي هو 1٪) إلى 2 مل من المخزن المؤقت NaCI التي تحتوي على بروتوبلاست للربط المتبادل.
- احتضان البروتوبلاستات في 25 درجة مئوية ل 10 دقيقة.
- إضافة 20 ميكرولتر من 10x الجليسين إلى كل أنبوب لإرواء الفورمالديهايد غير المتفاعل.
- دوامة لخلط واحتضان في 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 2000 × ز و 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant بعناية. Resuspend بيليه في 1 مل من محلول NaCI 0.7 M.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2000 × ز و 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant بعناية. Resuspend بيليه في 750 ميكرولتر من العازلة RIPA (50 mM تريس-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1٪ NP-40, 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم, 0.1٪ SDS, ومثبطات البروتيز).
- إضافة 37.5 ميكرولتر من مثبط بروتياز 20x.
- نقل البروتوبلاست من الخطوة السابقة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
- أداء سونيكيشن (25٪ W، الإخراج 3 ق، وقف 5 ق، 4 درجة مئوية) على الفور مع سونيكاتور لمدة 10 دقيقة. الغرض من هذه الخطوة هو sonicate lysate عبر المرتبطة لفترة من الزمن لتحديد أفضل الظروف.
ملاحظة: يمكن تجميد lysate عند -80 درجة مئوية في هذه الخطوة. - إذا تم تحديد الظروف المثلى ل sonication بالفعل ، فانتقل إلى الخطوة التالية.
- إذا رغبت في ذلك، قم بإزالة 5 ميكرولتر من البروتوبلاست لتحليل هلام الآغاروز (الحمض النووي غير المشار).
- القص الكروماتين بواسطة سونيكيشن مع التجانس بالموجات فوق الصوتية لمدة 8 دقائق (25٪ W، الإخراج 3 ق، وقف 5 ق، 4 درجة مئوية).
- بعد كسر العينة بالموجات فوق الصوتية، أخرج جزءا من العينة ك "إدخال". الإدخال لا يؤدي تجربة ChIP ويحتوي على جميع الحمض النووي والبروتين الذي تم إطلاقه بعد سونيكاتيد العينة.
- بعد سونيكيشن، تشغيل 1٪ agarose هلام الكهربائي لتحليل طول شظايا الحمض النووي.
ملاحظة: تظهر نتائج الكهروفورسيس هلام agarose أن طول جزء الحمض النووي هو 200-500 نقطة أساس(الشكل 4). - ضع الأنبوب الصوتي على الثلج لمنع تدهور البروتين.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 10,000 x g و 4 °C.
- بعد الطرد المركزي، قم بنقل الناطور المطرد المركزي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل وتخزينه عند -80 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا. يمكن استخدام محلول الكروماتين الذي تم الحصول عليه في هذه الخطوة للملكية الفكرية اللاحقة.
- قبل إجراء تجربة IP، قم بتخفيف كل عينة كروماتين إلى نسبة 1:10 مع حاجز RIPA 1x (على سبيل المثال، أضف 10 ميكرولتر من عينة الكروماتين إلى 1 ميكرولتر من 1×مخزنة RIPA).
3. الملكية الفكرية من البروتين عبر الارتباط / الحمض النووي
- ماصة 50 ميكرولتر من حبات البروتين المغناطيسي الفائق في أنبوب الطرد المركزي 2 مل. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي. دع الخرز المغناطيسي يترسب أزل الناتنات الفائق.
- إضافة 1 مل من العازلة ريبا 1x (تبريد مسبق على الجليد) إلى الأنبوب وغسل حبات البروتين المغناطيسي الفائق ثلاث مرات. بعد الغسيل، ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي وأزل الناسخة الفائقة. إضافة 100 ميكرولتر من 1x RIPA المخزن المؤقت لكل أنبوب.
- إضافة 300 ميكرولتر من عينة تشورماتين (2 ×10 7 استخدمت الخلايا), 100 ميكرولتر من حبات البروتين المغناطيسي الفائق و 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة H3K4me3 إلى الأنبوب.
- استخدام عينات مع الماوس IgG كما عنصر التحكم السلبي.
ملاحظة: يحتوي الماوس IgG المستخدمة في هذا البروتوكول على 0.01 M الفوسفات المخزن المؤقت و 0.15 M NaCl، وسيظل مجمدا تحت 20 درجة مئوية(انظر جدول المواد ). - بعد خلط جيدا، ضع العينات على شاكر دوار واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، 30 × ز.
ملاحظة: قد يكون من الممكن تقليل وقت حضانة النقص المناعي (IP). يعتمد وقت الحضانة على عوامل مختلفة (على سبيل المثال، الجسم المضاد، الهدف الجيني، نوع الخلية، إلخ) وسيحتاج إلى اختبار تجريبي.
4. جمع وشطف منتجات الملكية الفكرية
- بيليه حبات البروتين المغناطيسي الفائق عن طريق وضعها على موقف المغناطيسي. أسبيرات وتجاهل العملاق.
- غسل البروتين الفائق المغناطيسي حبة الأجسام المضادة / مجمع الكروماتين عن طريق إعادة تعليق الخرز في 1 مل من العازلة ريبا 1x.
- شطف الأنبوب على شاكر دوار لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant في 30 × ز.
- إضافة 1 مل من الملح المنخفض العازلة غسل مجمع الملح (0.1٪ SDS, 1٪ تريتون X-100, 2 mM EDTA, 20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.1, و 150 mM NaCl).
- شطف الأنبوب على شاكر دوارة لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant.
- إضافة 1 مل من الملح العالي العازلة غسل مجمع (0.1٪ SDS, 1٪ تريتون X-100, 2 mM EDTA, 20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.1, و 500 mM NaCl) إلى أنبوب الطرد المركزي.
- ضع الأنبوب على شاكر دوار لمدة 5 دقائق وأزل الناسخة الفائقة.
- شطف مع 1 مل من LiCl (0.25 م LiCl، 1٪ NP-40، 1٪ حمض ديوكسيكوليك، 1 mM EDTA، و 10 mM تريس-HCl درجة الحموضة 8.1) في أنبوب الطرد المركزي.
- ضع الأنبوب على شاكر دوار لمدة 5 دقائق وأزل الناسخة الفائقة.
- شطف أنبوب الاختبار مرة أخرى مع 1 مل من 0.25 M LiCI العازلة، وإزالة supernatant مع ماصة، ومن ثم تجاهل supernatant.
- إضافة 1 مل من المخزن المؤقت TE (10 mM تريس-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA).
- ضع الأنبوب على شاكر دوار لمدة 5 دقائق عند 30 × ز.
- اغسل الأنبوب مرة أخرى مع 1 مل من العازلة TE وإزالة supernatant مع ماصة.
- جمع الخرز.
5. Elution من مجمعات البروتين / الحمض النووي
- إعداد العازلة elution (10 ميكرولتر من 20٪ SDS، 20 ميكرولتر من 1 M NaHCO3، 170 ميكرولتر من المقطر العقيم H2O) لجميع أنابيب IP والمدخلات.
- أضف 100 ميكرولتر من العازلة elution إلى كل أنبوب الطرد المركزي.
- Elution عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 10،000 × ز و 4 درجة مئوية وجمع supernatant في أنابيب الطرد المركزي الجديدة.
- كرر الخطوات 5.2 - 5.4 والجمع بين eluates. أضف 190 ميكرولتر من العازلة elution إلى 10 ميكرولتر من الحمض النووي الإدخال. (إجمالي الحجم = 200 ميكرولتر).
6. عكس الربط بين مجمعات البروتين / الحمض النووي
- إضافة 8 ميكرولتر من 5 M NaCl إلى جميع الأنابيب واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 4-5 ساعة أو بين عشية وضحاها لعكس الروابط المتقاطعة بروتين الحمض النووي.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، تخزين العينات في -20 درجة مئوية، ومتابعة البروتوكول في اليوم التالي، إذا لزم الأمر. - أضف 1 ميكرولتر من RNase A واحتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- أضف 4 ميكرولتر من بروتيناز K (تم حله في H2O عند 20 ملغم /مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية) إلى كل أنبوب واحتضانه عند 45 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
7. تنقية واستعادة الحمض النووي
- أضف 550 ميكرولتر من خليط الكحول الفينول/الكلوروفورم/الإيزاميل (نسبة 25:24:1) إلى أنبوب الطرد المركزي.
- دوامة تماما الخليط لمدة 1 دقيقة.
- الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 10،000 x ز و يستنشق supernatant.
- نقل supernatant المستخرجة من الخطوة السابقة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل جديدة.
- إضافة حجم 1/10 من محلول خلات الصوديوم 3 M, 2.5 مجلدات من الإيثانول المطلق, و 3 ميكرولتر من الجليكوجين (20 ملغم / مل) إلى الأنبوب.
- ضع العينة في ثلاجة عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهطول الأمطار.
- جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 10,000 × ز و 4 °C.
- تجاهل supernatant بعد الطرد المركزي. غسل بيليه ثلاث مرات مع 1 مل من الإيثانول 75٪ (يحتاج إلى أن تكون مستعدة طازجة) في 10،000 × ز.
- ضع الرواسب المغسولة على مقعد نظيف للسماح للكحول بالجفاف.
- إضافة 50 ميكرولتر من تعقيم deionized H2O لإذابة ما يكفي من الترسب.
- Ligate محول التسلسل إلى جزء الحمض النووي واستخدام منصة تسلسل عالية الإنتاجية لتسلسل الحمض النووي.
8. إصلاح الحمض النووي وبناء مكتبة سوليكا
- إصلاح ينتهي الحمض النووي لتوليد الحمض النووي حادة النهاية باستخدام مجموعة إصلاح نهاية الحمض النووي (1-34 ميكرولتر الحمض النووي، 5 ميكرولتر من 10x نهاية إصلاح العازلة، 5 ميكرولتر من 2.5 mM كل dNTP، 5 ميكرولتر من 10 MM ATP، 1 ميكرولتر من مزيج إنزيم نهاية الإصلاح، وH2O لضبط حجم التفاعل إلى 49 ميكرولتر).
- استخدام عدة تنقية PCR أو الفينول: استخراج الكلوروفورم لتنقية الحمض النووي. Elute أو إعادة إنفاق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من 1x TE درجة الحموضة 7.4.
- أضف "A" إلى 3' ينتهي (30 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 2، 2 ميكرولتر من H2O، 5 ميكرولتر من 10x Taq العازلة، 10 ميكرولتر من 1 mM dATP، و 3 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي تاك). أضف الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.2 مل من PCR، واخلط جيدا، وتفاعل في جهاز PCR عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- أداء ربط الرابط عن طريق خلط 10 ميكرولتر من الحمض النووي، 9.9 ميكرولتر من H2O، 2.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغانز العازلة، 0.1 ميكرولتر من مزيج أوليغو محول، و 2.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغانيس. أضف الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.2 مل من PCR واخلط جيدا. احتضنهم عند 16 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
- تنقية الحمض النووي باستخدام عدة تنقية PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. Elute مع 20-25 ميكرولتر من العازلة elution.
- قبل إنشاء مكتبة الحمض النووي، حدد تركيز الحمض النووي المنقى لتأكيد استخدامه لتجارب التسلسل اللاحقة.
- الكشف عن تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور. بعد ذوبان العينة على الجليد، اخلطيها جيدا واخلطيها بالطرد المركزي لمدة 30 s عند 1000 × ز و4 درجات مئوية. ثم تأخذ كمية مناسبة من العينة وقياسه في الفلورومتر مع الطول الموجي من 260 نانومتر.
- ضع عينات الحمض النووي بجودة وتركيز مؤهلين على منصة تسلسل Illumina للتسلسل.
- قبل التسلسل، تضخيم الحمض النووي باستخدام التمهيديات PCR، PE1.0 و PE2.0، و2x مزيج رئيسي عالية الدقة (10.5 ميكرولتر من الحمض النووي، 12.5 ميكرولتر من 2x عالية الدقة مزيج رئيسي، 1 ميكرولتر من PCR التمهيدي PE1.0، و 1 ميكرولتر من PCR التمهيدي PE2.0). أضف الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.2 مل من PCR واخلط جيدا.
- تشغيل تفاعل PCR في جهاز PCR: 95 درجة مئوية قبل التشبع لمدة 2 دقيقة؛ ثم 35 دورات من 95 درجة مئوية التشبع لمدة 10 ق، تملين في 60 درجة مئوية لمدة 15 s، تمديد في 72 درجة مئوية لمدة 5 ق؛ تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وأخيرا، احتضان رد الفعل عند 4 درجة مئوية.
- استخدام الحمض النووي لتوليد الكتلة وأداء التسلسل عن طريق التوليف على هسيك Illumina 2000.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام خلايا تدفق Illumina لإنشاء نظام المجموعة. تم إجراء التسلسل عن طريق التوليف على محلل الجينوم Illumina بعد تعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر مخطط التدفق الكامل لطريقة ChIP-seq في الشكل 1. تم إجراء تجارب ChIP-seq باستخدام أجسام مضادة ضد H3K4me3 في سلالة P131 البرية وثلاث سلالات متحولة فارغة كانت خالية من mobre2، mospp1، وجين moswd2 للتحقق من الملف الشخصي الكامل على نطاق الجينوم لتوزيع H3K4me3 الهستون في M. oryzae. تم إعداد البروتوبلاستات من سلالة البرية من نوع، Δmobre2، Δmospp1، و Δmoswd2، و sonicated في 25٪ W، والإخراج 3 ق، ووقف 5 ق، في 4 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، تم مناعة الكروماتين مع الأجسام المضادة H3K4me3 وبروتين ديناباز A/G. وفي وقت لاحق، استخرجت شظايا الحمض النووي باستخدام طريقة الفينول - الكلوروفورم لبناء مكتبة تسلسل وتسلسل بنهايات واحدة على منصة تسلسل عالية الإنتاجية.
تظهر النتائج التمثيلية للنوع البري، Δmobre2، Δmospp1، وسلالاتΔ moswd2 مع طريقة ChIP-seq باستخدام الأجسام المضادة H3K4me3 في الشكل 2. وانخفضت إشارات H3K4me3 منmobre2Δ ، Δmospp1، و Δ طفرات حذفmoswd2 بشكل كبير في المناطق المستهدفة وظيفية. وكما هو مبين في الشكل 2،تم تعيين بعض الجينات المستهدفة المرشحة المختارة، بما في ذلك MGG_14897 MGG_04237 MGG_04236 MGG_04235، لتوزيع H3K4me3. بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع P131، إشارات المخصب H3K4me3-ChIP-seq يقرأ فيmobre2 Δ، Δmospp1،وانخفضت إلى حد كبير المسوخ حذفmoswd2 Δ (الشكل 2)26. وتشير هذه النتائج إلى أن تعديل H3K4me3 يلعب أدوارا هامة في تنظيم التعبير الجيني المستهدف في M. oryzae.
الشكل 1. مخطط تدفق الأسلوب ChIP-seq في M. oryzae. (أ) تم ربط الحمض النووي الجينومي ل M. oryzae بنسبة 1٪ من الفورمالديهايد. (ب) تم الحصول على خلايا الفطريات انفجار ليس، الحمض النووي المكسور، الحمض النووي مجانا، والحمض النووي ملزمة الهستون في وقت لاحق. (ج) شظايا الحمض النووي المرتبطة الهستونات وتم استخراجها عن طريق ربط محدد للأجسام المضادة H3K4me3. (د) من خلال الربط العكسي، حصل الحمض النووي المنقى فيما بعد على شظايا الحمض النووي المعدلة بواسطة هستونات H3K4me3. (E-F) تم تسلسل شظايا الحمض النووي، ومقارنة نتائج التسلسل، وتم تحديد التسلسلات في مجموعة الحمض النووي M. oryzae. (ز) تم استرجاع جينات محددة و loci من الهستونات H3K4me3 في M. oryzae. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. وMobire2Δ ، Δmospp1، و Δmoswd2 حذف المسوخ انخفض بشكل ملحوظ H3K4me3 ملامح في المناطق المستهدفة. توزيع H3K4me3-ChIP-seq من القمم المخصبة حول مناطق الترميز من الجينات المتراكبة في Δmobre2، Δmospp1، ويتم تفكيك المسوخ حذفmoswd2 Δ بالمقارنة مع سلالة من النوع البري في MGG_14897MGG_04237 وجينات MGG_04236 MGG_0423526. الرقم في WT (الإدخال) المسمى [0-2074] يعني نتائج ChIP في نطاق الحمض النووي الجينومي [0-2074]. [0-2074] يشير إلى 0-2074bp من الكروموسوم 6.The الشكل يظهر اختيار عشوائي من نتائج التسلسل، والذي يمثل فقط توزيع الحمض النووي على كروموسوم 6. وقد قدمت النتائج الكاملة للتسلسل إلى مصرف جينبانك. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/المشروع الحيوي/الانضمام 649321) 26. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الرقم التسلسلي | اسم نموذج | نموذج الرقم التسلسلي | عدد الأنابيب | المجموع (ميكروغرام) | توزيع الأجزاء | نوع قاعدة البيانات | ملاحظات | ||||
| 1 | الادخال | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | الذروة الرئيسية هي أقل من 100bp، ولكن هناك توزيع الحمض النووي بين 100bp-500bp | ChIP-seq | جزء صغير جدا | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | الادخال | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | الذروة الرئيسية هي أقل من 100bp، ولكن هناك توزيع الحمض النووي بين 100bp-500bp | ChIP-seq | جزء صغير جدا | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | الإدخال Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | الذروة الرئيسية هي أقل من 100bp، ولكن هناك توزيع الحمض النووي بين 100bp-500bp | ChIP-seq | جزء صغير جدا | ||||
| 4 | إدخال Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | الذروة الرئيسية هي أقل من 100bp، ولكن هناك توزيع الحمض النووي بين 100bp-500bp | ChIP-seq | جزء صغير جدا | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | الذروة الرئيسية بين 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | الذروة الرئيسية بين 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | الذروة الرئيسية بين 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | الذروة الرئيسية بين 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
الجدول 1 - الجداول الكمية الإجمالية للحمض النووي في هذه التجربة. المبلغ الإجمالي للمدخلات P131(2) هو 2.7948 ميكروغرام، والمبلغ الإجمالي ل Δmobre2(3) (الإدخال) هو 2.4748 ميكروغرام، المبلغ الإجمالي ل Δmospp1(4) (الإدخال) هو 3.22 ميكروغرام، والمبلغ الإجمالي ل Δmoswd2 (5) (الإدخال) هو 3.97 ميكروغرام، والمبلغ الإجمالي ل P131(2) هو 0.0735 ميكروغرام، والمبلغ الإجمالي ل Δmobre2(3) هو 0.0491μg، المبلغ الإجمالي ل Δmospp1(4) هو 0.0288 ميكروغرام، والمبلغ الإجمالي لΔ moswd2(5) هو 0.0527 ميكروغرام.
الشكل 3. الكشف الكهربائي للحمض النووي بعد الموجات فوق الصوتية. بعد سونيكيشن الموجات فوق الصوتية، ويخضع الحمض النووي لتجربة هلام agarose 1٪ لتحليل طول شظايا الحمض النووي. طول جزء الحمض النووي سونيكاتيد هو من 200-500 نقطة أساس، ويمكن استخدام هذه شظايا الحمض النووي للخطوات التالية من ChIP-seq. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. Bioanalyzer تتبع مدخلات وChIP عينات. يظهر الشكل توزيع جزء من كل عينة، حيث يمثل abscissa حجم جزء، ويمثل تنسيق حجم الذروة. العينات التي تعمل على bioanalyzer هي مدخلات P131(2)، Δmobre2(3) (الإدخال)، Δmospp1(4) (إدخال)، Δmoswd2(5) (إدخال)، P131(2)، Δmobre2(3)، Δmospp1(4)، Δmoswd(5). من بينها، وتوزيع المدخلات P131(2)، Δmobre2(3) (المدخلات)، Δmospp1(4) (مدخلات)، Δmoswd2(5) (مدخلات) يظهر الذروة الرئيسية أقل من 100 نقطة أساس، ولكن هناك توزيع الحمض النووي في 100-500 نقطة أساس. التوزيع الحقيقي ل P131(2)، Δmobre2(3)، Δmospp1(4)، و Δmoswd2(5) هو بين 100-500 نقطة أساس كالقمة الرئيسية26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفي الآونة الأخيرة، أصبح ChIP-seq طريقة تحليل جينومية تستخدم على نطاق واسع لتحديد المواقع الملزمة لصناديق الاستثمار التقليدية أو مواقع التخصيب المعدلة بواسطة هستونات محددة. بالمقارنة مع التكنولوجيا السابقة ChIP-seq، تكنولوجيا ChIP-seq الجديدة حساسة للغاية ومرنة. وتقدم النتائج بدقة عالية دون آثار سلبية، مثل إشارة الضوضاء الناجمة عن التهجين غير محددة من الأحماض النووية. على الرغم من أن هذا هو تحليل التعبير الجيني المشترك، وقد تم التحقق من صحة العديد من الأساليب الحسابية، وتعقيد البيانات ChIP-seq من حيث الضوضاء والتباين يجعل هذه المشكلة صعبة بشكل خاص لChIP-seq للتغلب عليها. وفيما يتعلق بتحليل البيانات، فإن إدارة وتحليل الكم الكبير من البيانات التي تولدها تجارب ChIP-seq يشكل أيضا تحديا لم يعالج بعد على النحو الكافي.
هناك العديد من الخطوات الرئيسية في تجربة ChIP-seq. أولا وقبل كل شيء ، وإعداد protoplasts مهم جدا. من الضروري التحكم في وقت الانهيار بحيث يمكن جمع البروتوبلاست عالي الجودة. الموجات فوق الصوتية هو أيضا مهم جدا، وينبغي التحكم في وقت الموجات فوق الصوتية، طويلة جدا أو قصيرة جدا لن تعمل. ثانيا، يجب أن تكون كمية الأجسام المضادة المضافة كافية لتسهيل إثراء المزيد من شظايا الحمض النووي التي ترتبط بالبروتين. عند التحقق من نوعية وكمية الحمض النووي عجلت في تجربة ChIP-seq تم استخدام Qubit Fluorometer. تم استخدام Agilent 2100 للكشف عن التركيز الجماعي وتوزيع جزء من الحمض النووي ، والذي يوفر أساسا لما إذا كان يمكن استخدام العينة لإنشاء المكتبة اللاحقة وتجارب التسلسل.
وعموما، يعزز هذا البروتوكول فهم التوزيع الكامل على نطاق الجينوم للتعديلات اللاجينية التي تنظم الجينات المسببة للأمراض أثناء العدوى بمسببات الأمراض. وستسهم هذه الطريقة في تحديد الآليات الجزيئية للتعديلات اللاجينية وتحديد الجينات المستهدفة الجديدة أثناء تطوير الفطريات ومسببات الأمراض الناجمة عن مسببات الأمراض في م. أوريزا وغيرها من الفطريات الخيطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31871638)، ومشروع البحث العلمي الخاص لجامعة بكين الزراعية (YQ201603)، والمشروع العلمي للجنة التعليم في بكين (KM201610020005)، ومشروع زراعة البحوث العلمية رفيع المستوى التابع ل BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
