Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der genomweiten Verteilung von Histonmodifikationen vor, das neue Zielgene in der Pathogenese von M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifizieren kann.
Abstract
Die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq) ist eine leistungsstarke und weit verbreitete molekulare Technik zur Kartierung ganzer Genomstandorte von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatinregulatoren und Histonmodifikationen sowie zum Nachweis ganzer Genome zur Aufdeckung von TF-Bindungsmustern und histon-posttranslationalen Modifikationen. Chromatinmodifizierende Aktivitäten, wie die Histonmethylierung, werden oft für bestimmte genregulatorische Sequenzen rekrutiert, was zu lokalisierten Veränderungen in Chromatinstrukturen führt und zu spezifischen transkriptionellen Effekten führt. Die Reisexplosion ist eine verheerende Pilzkrankheit auf Reis auf der ganzen Welt und ist ein Modellsystem zur Untersuchung der Pilz-Pflanzen-Interaktion. Die molekularen Mechanismen, wie die Histonmodifikationen ihre Virulenzgene in Magnaporthe Oryzae regulieren, bleiben jedoch schwer fassbar. Mehr Forscher müssen ChIP-seq verwenden, um zu untersuchen, wie histone epigenetische Modifikationen ihre Zielgene regulieren. ChIP-seq wird auch häufig verwendet, um die Wechselwirkung zwischen Protein und DNA in Tieren und Pflanzen zu untersuchen, aber es wird weniger im Bereich der Pflanzenpathologie verwendet und ist nicht gut entwickelt. In diesem Artikel beschreiben wir den experimentellen Prozess und die Funktionsweise von ChIP-seq, um die genomweite Verteilung der Histonmethylierung (wie H3K4me3) zu identifizieren, die an die funktionellen Zielgene in M. oryzae bindet. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der genomweiten Verteilung von Histonmodifikationen vor, das neue Zielgene in der Pathogenese von M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifizieren kann.
Introduction
Die Epigenetik ist ein Zweig der Genforschung, der sich auf die vererbbare Veränderung der Genexpression bezieht, ohne die Nukleotidsequenz von Genen zu verändern. Eine zunehmende Anzahl von Studien hat gezeigt, dass die epigenetische Regulation eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung eukaryotischer Zellen spielt, einschließlich Chromatin, das die Genexpression durch den dynamischen Prozess der Faltung und Dessempfle in Strukturen höherer Ordnung reguliert und beeinflusst1,2. Chromatin-Remodeling und kovalente Histonmodifikation beeinflussen und regulieren die Funktion und Struktur von Chromatin durch die Variation von Chromatinpolymeren und erreichen dadurch die Funktion der Regulierung der Genexpression3,4,5,6. Posttranslationale Modifikationen des Histons umfassen Acetylierung, Phosphorylierung, Methylierung, Monoubiquitinierung, Sumoylierung und ADP-Ribosylierung7,8,9. Die Histon-H3K4-Methylierung, insbesondere die Trimethylierung, wurde an Transkriptionsstartstellen abgebildet, wo sie mit der Transkriptionsreplikation, Rekombination, Reparatur und RNA-Verarbeitung in Eukaryoten10,11assoziiert ist.
Die ChIP-seq-Technologie wurde 2007 eingeführt und hat sich zum experimentellen Standard für die genomweite Analyse der transkriptionellen Regulation und epigenetischen Mechanismen entwickelt12,13. Diese Methode eignet sich auf genomweiter Ebene und zur Gewinnung von Histon- oder Transkriptionsfaktor-Interaktionsinformationen, einschließlich DNA-Segmenten von DNA-bindenden Proteinen. Alle DNA-Sequenzen, die mit interessanten Proteinen vernetzt sind, werden als Teil des Chromatinkomplexes kopräzipitiert. Sequenzierungstechniken der neuen Generation werden auch verwendet, um 36-100 bp DNA zu sequenzieren, die dann mit dem entsprechenden Zielgenom abgeglichen werden.
Bei phytopathogenen Pilzen hat die Forschung kürzlich begonnen, zu untersuchen, wie Histonmethylierungsmodifikationen ihre Zielgene im Prozess der Pathogenität regulieren. Einige frühere Studien haben gezeigt, dass sich die Regulation von Histonmethylase-verwandten Genen hauptsächlich in der Genschminken und Katalyse der Produktion von Sekundärmetaboliten (SM) widerspiegelt. MoSet1 ist die H3K4-Methylase in M. oryzae. Der Knockout dieses Gens führt zur vollständigen Deletion der H3K4me3-Modifikation14. Im Vergleich zum Wildtyp-Stamm wird die Expression des Gens MoCEL7C in der Mutante im CMC-induzierten Zustand gehemmt und im nicht induzierten Zustand (Glukose oder Cellobiose) erhöhte sich die Expression von MoCEL7C um 15. In Fusarium graminearumkann KMT6 die Methylierungsmodifikation von H3K27me3 katalysieren, die normale Entwicklung von Pilzen regulieren und helfen, das "kryptische Genom" zu regulieren, das den SM-Gencluster16,17,18,19 enthält. Im Jahr 2013 berichtete Connolly, dass die H3K9- und H3K27-Methylierung den pathogenen Prozess von Pilzen durch sekundäre Metaboliten und Effektorfaktoren reguliert, die die Hemmung von Zielgenen regulieren20. Bei Aspergillusist die Modifikation der Histone H3K4me2 und H3K4me3 mit der Genaktivierung verbunden und spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Chromatinspiegelregulation von SM-Genclustern21. In M. oryzaeist Tig1 (homolog zu Tig1 in Hefe und Säugetieren) eine HADC (Histon-Deacetylase)22. Der Knockout des Tig1-Gens führt zum vollständigen Verlust der Pathogenität und der Sporenproduktionsfähigkeit in der Nullmutante. Es ist empfindlicher gegenüber einer Persauerstoffumgebung, die keine infektiöse Hyphen produzieren kann22.
Die durch M. oryzae. verursachte Reisexplosion ist eine der schwersten Reiskrankheiten in den meisten Reisanbaugebieten der Welt19. Aufgrund seines repräsentativen Infektionsprozesses ähnelt M. oryzae dem Infektionsprozess vieler wichtiger pathogener Pilze. Da er leicht molekulargenetische Operationen durchführen kann, ist der Pilz zu einem Modellorganismus für die Untersuchung von Pilz-Pflanzen-Interaktionen geworden23. Das Blockieren jedes Schritts des Infektionsprozesses von M. oryzae kann zu einer erfolglosen Infektion führen. Die morphologischen Veränderungen während des Infektionsprozesses werden durch die gesamte Genomfunktion und Die Gentranskription streng reguliert. Unter ihnen spielen epigenetische Modifikationen wie die Histonmethylierung eine wesentliche Rolle bei der transkriptionellen Regulation funktioneller Gene24,25. Bisher wurden jedoch nur wenige Studien zum molekularen Mechanismus epigenetischer Modifikationen wie Histonmethylierung und Histonacetylierung bei der Transkription von Pathogenesegenen in M. oryzae durchgeführt. Daher wird die Weiterentwicklung des epigenetischen Regulationsmechanismus des Reisblastenpilzes während der Erforschung des vor- und nachgelagerten Regulatorischen Netzwerks dieser pathogen verwandten Gene dazu beitragen, Strategien zur Prävention und Bekämpfung von Reisexplosionen zu entwickeln.
Mit der Entwicklung funktioneller Genomik wie ChIP-seq, insbesondere in der Epigenetik, hat diese Hochdurchsatz-Datenerfassungsmethode die Chromosomenforschung beschleunigt. Mit der experimentellen Technologie ChIP-seq kann die genomweite Verteilung der Histonmethylierung (wie H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) in M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifiziert werden. Daher kann diese Methode helfen, die molekularen Mechanismen zu klären, die zugrunde liegen, wie epigenetische Modifikationen ihre Kandidaten-Zielgene während der Pilzpathogenese in der Pflanzenpathologie regulieren.
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Protocol
1. Herstellung von Protoplasten aus M. oryzae
- Bereiten Sie das Haferflocken-Tomaten-Agar (OTA) zu.
- Wiegen Sie 30-50 g Haferflocken und kochen Sie sie in 800 ml Wasser (ddH2O) für 20 min. Filtern Sie durch zwei Schichten Gaze und nehmen Sie das Filtrat.
- Reife Tomaten pflücken und schälen. Drücken Sie den Saft aus und filtern Sie durch zwei Schichten Gaze, um 150 ml des gefilterten Saftes zu sammeln.
- Den gesamten Tomatensaft und das zubereitete Haferfiltrat gründlich vermischen und ddH2O bis zu 1000 ml hinzufügen.
- 250 ml OTA und 2,5 g Agarpulver in einen 500 ml konischen Kolben geben und 20 min lang autoklavieren. Bei 25 °C lagern.
- Gießen Sie 25 ml des autoklavierten OTA in ein Glas 5 cm x 5 cm Petrischale. Bereiten Sie insgesamt 10 dieser Petrischalen zu. Nachdem sich das OTA auf den Petrischalen verfestigt hat, lagern Sie das Geschirr kopfüber bei 25 °C.
- Verwenden Sie einen sterilisierten Zahnstocher, um ein kleines Stück Myzel aus M. oryzae (der Wildtyp-Stamm P131, Knockout-Stämme Δmobre2, Δmospp1 und Δmoswd2)auszugraben und auf die zubereiteten OTA-Gerichte zu legen. Kulturieren Sie sie für 4-6 Tage bei 28 °C unter Lichtbedingungen.
HINWEIS: Drehen Sie die Petrischale auf den Kopf, um Verschmutzung zu vermeiden. - 1000 μL flüssiges Complete Medium (CM) (0,6% Hefeextrakt, 0,3% enzymatisches Caseinhydrolysat, 0,3% saures Caseinhydrolysat, 1% Glukose) mit einer 1000 μL Pipette in die OTA-Schalen geben.
HINWEIS: Die Hyphen wuchsen auf den OTA-Gerichten für 4-6 Tage. - Kratzen Sie die Myzelien des Wildtyp-Stammes und des Knockout-Stammes mit einer Impfschleife ab.
- Sammeln Sie die Myzelienablagerungen und übertragen Sie sie auf 250 ml flüssiges Complete Medium (CM).
- Züchte die Pilzreste in einem Dreieckskolben bei 28 °C für 36 h mit Schütteln bei 150 U/min.
- Verwenden Sie einen Trichter, um die Pilzhyphen zu filtern und zu sammeln.
- Waschen Sie die Pilzhyphen mit 500 ml 0,7 M NaCl-Lösung.
- Sammeln Sie das Pilzmyzel und wiegen Sie es.
HINWEIS: Das Myzel muss vor dem Wiegen nicht getrocknet werden. - Fügen Sie ~ 1 ml Lyseenzympermeationslösung pro 1 g des Pilzmyzels hinzu.
- Die 20 mg/ml Lyseenzympermeationslösung wird durch Auflösen des Lyseenzyms aus Trichoderma harzianum in 0,7 M NaCl vorbereitet.
- Legen Sie die Hyphen zum Lysieren bei 28 °C für 3-4 h mit Schütteln bei 150 U / min.
- Waschen Sie die lysierten Hyphen mit 50 ml 0,7 M NaCl-Lösung.
- Protoplasten und Zentrifuge 15 min bei 2.000 x g und 4 °C sammeln.
- Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig verwerfen. Resuspendieren Sie die Protoplasten in 20 mL 0,7 M NaCI-Puffer bei 4 °C.
2. In-vivo-Vernetzung und Beschallung
- Fügen Sie 55 μL 37% Formaldehyd hinzu (fügen Sie Formaldehyd tropfend für Tropfen hinzu, bis die Endkonzentration 1% beträgt) zu 2 ml NaCI-Puffer, der Protoplast zur Vernetzung enthält.
- Inkubieren Sie die Protoplasten bei 25 °Cfür 10 min.
- Fügen Sie 20 μL 10x Glycin zu jedem Röhrchen hinzu, um das nicht umgesetzte Formaldehyd abzuschrecken.
- Zum Mischen schwenken und bei 25 °C für 5 min inkubieren.
- Zentrifuge für 15 min bei 2.000 x g und 4 °C.
- Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig verwerfen. Das Pellet wird in 1 ml 0,7 M NaCI-Lösung resuspendiert.
- Zentrifuge für 10 min bei 2.000 x g und 4 °C.
- Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig verwerfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 750 μL RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren).
- Fügen Sie 37,5 μL 20x Proteaseinhibitor hinzu.
- Die Protoplasten aus dem vorherigen Schritt in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen überführen.
- Beschallung (25% W, Ausgang 3 s, Stopp 5 s, 4 °C) sofort mit einem Ultraschallator für ca. 10 min durchführen. Der Zweck dieses Schrittes besteht darin, das vernetzte Lysat für einen bestimmten Zeitraum zu beschallen, um die besten Bedingungen zu bestimmen.
HINWEIS: Das Lysat kann in diesem Schritt bei -80 °C eingefroren werden. - Wenn bereits optimale Bedingungen für die Beschallung ermittelt wurden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Falls gewünscht, entfernen Sie 5 μL Protoplasten für die Agarosegelanalyse (unerhörte DNA).
- Scheren Sie das Chromatin durch Beschallung mit einem Ultraschallhomogenisator für 8 min (25% W, Ausgang 3 s, Stopp 5 s, 4 °C).
- Nachdem die Probe mit Ultraschall gebrochen wurde, nehmen Sie einen Teil der Probe als "Eingang" heraus. Die Eingabe führt das ChIP-Experiment nicht durch und enthält die gesamte DNA und das Protein, die nach der Beschallung der Probe freigesetzt werden.
- Führen Sie nach der Beschallung eine 1% ige Agarosegelelektrophorese durch, um die Länge der DNA-Fragmente zu analysieren.
HINWEIS: Die Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese zeigen, dass die Länge des DNA-Fragments 200-500 bp beträgt (Abbildung 4). - Legen Sie das beschallte Rohr auf Eis, um den Proteinabbau zu verhindern.
- Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g und 4 °C.
- Nach der Zentrifugation den zentrifugierten Überstand in ein neues 1,5 mL Zentrifugenrohr geben und bei -80 °C für die spätere Verwendung lagern. Die in diesem Schritt erhaltene Chromatinlösung kann für nachfolgende IP verwendet werden.
- Bevor Sie das IP-Experiment durchführen, verdünnen Sie jede Chromatinprobe mit 1x RIPA-Puffer auf ein Verhältnis von 1:10 (z. B. 10 μL Chromatinprobe zu 1 μL 1×RIPA-Puffer hinzufügen).
3. IP des vernetzten Proteins/der DNA
- 50 μL superparamagnetische Proteinperlen in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen pipetten. Legen Sie die Röhren auf einen Magnetischen Ständer. Lassen Sie die magnetischen Perlen ausfällen. Entfernen Sie den Überstand.
- 1 ml 1x RIPA-Puffer (auf Eis vorgekühlt) in das Röhrchen geben und superparamagnetische Proteinperlen dreimal waschen. Nach dem Waschen legen Sie die Schläuche auf einen Magnetständer und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 100 μL 1x RIPA-Puffer zu jedem Röhrchen hinzu.
- 300 μL Chormatinprobe (2 x 107 Zellen wurden verwendet), 100 μL superparamagnetische Proteinperlen und 4 μL H3K4me3-Antikörper in das Röhrchen gegeben.
- Verwenden Sie Proben mit Maus-IgG als Negativkontrolle.
HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete Maus-IgG enthält 0,01 M Phosphatpuffer und 0,15 M NaCl und bleibt unter 20 °C eingefroren (siehe Materialtabelle). - Nach dem mischen die Proben auf einen Rotationsschüttler legen und über Nacht bei 4 °C, 30 x ginkubieren.
HINWEIS: Es kann möglich sein, die Inkubationszeit der Immunpräzipitation (IP) zu verkürzen. Die Inkubationszeit hängt von verschiedenen Faktoren ab (z. B. Antikörper, Genziel, Zelltyp usw.) und muss empirisch getestet werden.
4. Sammeln und Spülen der IP-Produkte
- Pelletieren Sie die superparamagnetischen Proteinperlen, indem Sie sie auf einen magnetischen Ständer legen. Saugen Sie den Überstand an und verwerfen Sie ihn.
- Waschen Sie den superparamagnetischen Proteinperlen-Antikörper/Chromatin-Komplex, indem Sie die Perlen in 1 ml 1x RIPA-Puffer resusparieren.
- Spülen Sie das Röhrchen auf einem Rotationsschüttler für 5 min und entfernen Sie den Überstand bei 30 x g.
- Fügen Sie 1 ml waschpuffer mit niedrigem Salzimmunkomplex hinzu (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 und 150 mM NaCl).
- Spülen Sie das Röhrchen 5 min auf einem Rotationsschüttler aus und entfernen Sie den Überstand.
- 1 ml Waschpuffer mit hohem Salzimmunkomplex (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 und 500 mM NaCl) werden in das Zentrifugenröhrchen gegeben.
- Legen Sie das Rohr für 5 min auf einen Rotationsschüttler und entfernen Sie den Überstand.
- Mit 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% Desoxycholsäure, 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl pH 8,1) im Zentrifugenröhrchen abspülen.
- Legen Sie das Rohr für 5 min auf einen Rotationsschüttler und entfernen Sie den Überstand.
- Spülen Sie das Reagenzglas erneut mit 1 ml 0,25 M LiCI-Puffer aus, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und verwerfen Sie dann den Überstand.
- Fügen Sie 1 ml TE-Puffer hinzu (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
- Legen Sie das Rohr für 5 min bei 30 x gauf einen Rotationsschüttler.
- Waschen Sie das Röhrchen erneut mit 1 mL TE-Puffer und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Sammle die Perlen.
5. Elution von Protein/DNA-Komplexen
- Bereiten Sie den Elutionspuffer (10 μL von 20% SDS, 20 μL von 1 M NaHCO3,170 μL steril destilliertesH2O) für alle IP- und Eingangsröhrchen vor.
- Fügen Sie jedem Zentrifugenröhrchen 100 μL Elutionspuffer hinzu.
- Elution bei 65 °C für 15 min.
- Zentrifuge für 1 min bei 10.000 x g und 4 °C und sammelt den Überstand in neuen Zentrifugenröhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2 - 5.4 und kombinieren Sie die Eluate. Zu den 10 μL der Eingangs-DNA werden 190 μL Elutionspuffer hinzugefügt. (Gesamtvolumen = 200 μL).
6. Umgekehrte Vernetzung von Protein/DNA-Komplexen
- 8 μL 5 M NaCl in alle Röhrchen geben und bei 65 °C für 4-5 h oder über Nacht inkubieren, um die DNA-Protein-Vernetzung umzukehren.
HINWEIS: Nach diesem Schritt lagern Sie die Proben bei -20 °C und setzen das Protokoll bei Bedarf am nächsten Tag fort. - 1 μL RNase A zuweisen und 30 min bei 37 °C inkubieren.
- 4 μL Proteinase K (gelöst in H2 O bei20mg/ml und gelagert bei -20 °C) in jedes Röhrchen geben und bei 45 °C für 1-2 h inkubieren.
7. Reinigung und Rückgewinnung von DNA
- 550 μL Phenol/Chloroform/Isoamylalkoholgemisch (Verhältnis 25:24:1) in das Zentrifugenröhrchen geben.
- Die Mischung gründlich für 1 min durchwirbeln.
- Zentrifugieren Sie für 15 min bei 10.000 x g und saugen Sie den Überstand an.
- Übertragen Sie den entnommenen Überstand aus dem vorherigen Schritt in ein neues 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
- 1/10 Volumen 3 M Natriumacetatlösung, 2,5 Volumen absolutes Ethanol und 3 μL Glykogen (20 mg/ml) in das Röhrchen geben.
- Legen Sie die Probe über Nacht zur Niederschlagung in einen Kühlschrank bei -20 °C.
- Zentrifuge für 15 min bei 10.000 x g und 4 °C.
- Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation. Waschen Sie das Pellet dreimal mit 1 ml 75% Ethanol (muss frisch zubereitet werden) bei 10.000 x g.
- Legen Sie den gewaschenen Niederschlag auf eine saubere Bank, um den Alkohol trocknen zu lassen.
- Fügen Sie 50 μL steriles entionisiertesH2Ohinzu, um den Niederschlag ausreichend aufzulösen.
- Ligatieren Sie den Sequenzierungsadapter an das DNA-Fragment und verwenden Sie eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform, um die DNA zu sequenzieren.
8. DNA-Reparatur und Bau der Solexa-Bibliothek
- Reparieren Sie die DNA-Enden, um stumpfe DNA mit einem DNA-Endreparaturkit zu erzeugen (1-34 μL DNA, 5 μL 10x Endreparaturpuffer, 5 μL von 2,5 mM pro dNTP, 5 μL von 10 mM ATP, 1 μL Endreparaturenzymmischung und H2O, um das Reaktionsvolumen auf 49 μL einzustellen).
- Verwenden Sie ein PCR-Reinigungskit oder Phenol: Chloroform-Extraktion, um die DNA zu reinigen. Eluieren oder resuspendieren Sie die DNA in 30 μL von 1x TE pH 7,4.
- Fügen Sie "A" zu 3' Enden hinzu (30 μL DNA aus Schritt 2, 2 μLH2O,5 μL 10x Taq-Puffer, 10 μL 1 mM dATP und 3 μL Taq-DNA-Polymerase). Die Reagenzien werden in ein 0,2 ml PCR-Zentrifugenröhrchen gegeben, gut vermischt und in einer PCR-Maschine bei 72 °C für 10 min reagiert.
- Führen Sie eine Linkerligatur durch Mischen von 10 μL DNA, 9,9 μLH2O,2,5 μL T4-DNA-Ligasepuffer, 0,1 μL Adapter-Oligo-Mix und 2,5 μL T4-DNA-Ligase durch. Die Reagenzien in ein 0,2 ml PCR-Zentrifugenröhrchen geben und gut mischen. Inkubieren Sie sie bei 16 °C für 4 h.
- Reinigen Sie die DNA mit einem PCR-Reinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Elute mit 20-25 μL Elutionspuffer.
- Bevor die DNA-Bibliothek eingerichtet wird, identifizieren Sie die Konzentration der gereinigten DNA, um ihre Verwendung für die nachfolgenden Sequenzierungsexperimente zu bestätigen.
- Erkennen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Nachdem Sie die Probe auf Eis schmelzen, gründlich mischen und 30 s bei 1000 x g und 4 °C zentrifugieren. Nehmen Sie dann eine angemessene Menge an Probe und messen Sie sie in einem Fluorometer mit einer Wellenlänge von 260 nm.
- Platzieren Sie DNA-Proben mit qualifizierter Qualität und Konzentration auf der Illumina-Sequenzierungsplattform für die Sequenzierung.
- Vor der Sequenzierung amplifizieren Sie die DNA mit PCR-Primern, PE1.0 und PE2.0 und 2x High-Fidelity-Master-Mix (10,5 μL DNA, 12,5 μL 2x High-Fidelity-Master-Mix, 1 μL PCR-Primer PE1.0 und 1 μL PCR-Primer PE2.0). Die Reagenzien in ein 0,2 ml PCR-Zentrifugenröhrchen geben und gut mischen.
- Führen Sie die PCR-Reaktion in der PCR-Maschine durch: 95 °C Vordenaturierung für 2 min; dann 35 Zyklen mit 95 °C Denaturierung für 10 s, Glühen bei 60 °C für 15 s, Verlängerung bei 72 °C für 5 s; eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Abschließend wird die Reaktion bei 4 °C inkubiert.
- Verwenden Sie die DNA für die Clustergenerierung und führen Sie eine Sequenzierung durch Synthese auf einer Illumina Hiseq 2000 durch.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Illumina-Durchflusszellen für die Clustergenerierung verwendet. Die Sequenzierung durch Synthese wurde auf einem Illumina Genome Analyzer nach herstellereigenen Anweisungen durchgeführt.
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Representative Results
Das gesamte Flussdiagramm der ChIP-seq-Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. ChIP-seq-Experimente wurden mit Antikörpern gegen H3K4me3 im Wildtyp-Stamm P131 und drei Nullmutantenstämmen, die frei von Mobre2, mospp1und moswd2-Gen waren, durchgeführt, um das gesamte genomweite Profil der Histon-H3K4me3-Verteilung in M. oryzaezu überprüfen. Die Protoplasten des Wildtypstamms Δmobre2,Δmospp1und Δmoswd2 wurden bei 25% W, Ausgang 3 s, Stop 5 s, bei 4 °C präpariert und beschallt. Darüber hinaus wurde das Chromatin mit dem H3K4me3-Antikörper und dem Dynabeads-Protein A / G immungereinigt. Anschließend wurden DNA-Fragmente mit der Phenol-Chloroform-Methode zum Aufbau einer Sequenzierungsbibliothek extrahiert und mit einzelnen Enden auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform sequenziert.
Die repräsentativen Ergebnisse der Wildtyp-, Δmobre2-, Δmospp1-und Δmoswd2-Stämme mit ChIP-seq-Methode unter Verwendung des H3K4me3-Antikörpers sind in Abbildung 2 dargestellt. Die H3K4me3-Signale der Deletionsmutanten Δmobre2, Δmospp1und Δmoswd2 waren in ihren funktionellen Zielregionen signifikant verringert. Wie in Abbildung 2gezeigt, wurden einige ausgewählte Kandidatenzielgene, darunter MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 und MGG_04235, für die H3K4me3-Verteilung kartiert. Im Vergleich zum Wildtypstamm P131 waren die Signale angereicherter H3K4me3-ChIP-seq-Lesevorgänge in den Δmobre2-, Δmospp1-und Δmoswd2-Deletionsmutanten weitgehend verringert ( Abbildung2)26. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die H3K4me3-Modifikation eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zielgenexpression in M. oryzae spielt.
Abbildung 1. Das Flussdiagramm der ChIP-seq-Methode in M. oryzae. (A) Die genomische DNA von M. oryzae wurde mit 1% Formaldehydvernetzt. (B) Lysed-Blastenpilzzellen, gebrochene DNA, freie DNA und Histonbindungs-DNA wurden anschließend erhalten. (C) DNA-Fragmente, die an Histone gebunden sind und durch spezifische Bindung an den H3K4me3-Antikörper extrahiert wurden. (D) Durch umgekehrte Vernetzung erhielt gereinigte DNA anschließend DNA-Fragmente, die durch H3K4me3-Histone modifiziert wurden. (E-F) DNA-Fragmente wurden sequenziert, die Sequenzierungsergebnisse verglichen und Sequenzen in der M. oryzae DNA-Gruppe identifiziert. (G) Spezifische Gene und Loci von H3K4me3-Histonen in M. oryzae wurden entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Die Deletionsmutanten Δmobre2, Δmospp1und Δmoswd2 verringerten die H3K4me3-Profile in ihren Zielregionen signifikant. Die H3K4me3-ChIP-seq-Verteilung angereicherter Peaks um die kodierenden Regionen überlappender Gene in Δmobre2, Δmospp1und Δmoswd2 Deletionsmutanten ist im Vergleich zum Wildtypstamm in den MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 und MGG_04235 Genen26dezersiert. Die Zahl in WT (Input), die als [0-2074] markiert ist, bedeutet die Ergebnisse von ChIP im Bereich der genomischen DNA [0-2074]. [0-2074] bezieht sich auf 0-2074bp von Chromosom 6.Die Abbildung zeigt eine zufällige Auswahl der Sequenzierungsergebnisse, die nur die DNA-Verteilung auf Chromosom 6 darstellt. Die vollständigen Sequenzierungsergebnisse wurden bei Genbank eingereicht. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ accession 649321) 26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Seriennummer | Beispielname | Seriennummer des Musters | Anzahl der Röhren | Gesamt (μg) | Fragmentverteilung | Datenbanktyp | Bemerkungen | ||||
| 1 | Eingabe | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Der Hauptpeak liegt unter 100bp, aber es gibt eine DNA-Verteilung zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment ist zu klein | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Eingabe | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Der Hauptpeak liegt unter 100bp, aber es gibt eine DNA-Verteilung zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment ist zu klein | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | Eingang Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Der Hauptpeak liegt unter 100bp, aber es gibt eine DNA-Verteilung zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment ist zu klein | ||||
| 4 | Eingang Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Der Hauptpeak liegt unter 100bp, aber es gibt eine DNA-Verteilung zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragment ist zu klein | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Der Hauptgipfel liegt zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Der Hauptgipfel liegt zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Der Hauptgipfel liegt zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Der Hauptgipfel liegt zwischen 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Tabelle 1. Die Gesamtmenge an DNA in diesem Experiment. Die Gesamtmenge des Eingangs P131(2) beträgt 2,7948 μg, die Gesamtmenge an Δmobre2(3) (Eingang) beträgt 2,4748 μg, die Gesamtmenge an Δmospp1(4) (Eingang) beträgt 3,22 μg, die Gesamtmenge an Δmoswd2 (5) (Eingang) beträgt 3,97 μg und die Gesamtmenge an P131(2) beträgt 0,0735 μg, die Gesamtmenge an Δmobre2(3) beträgt 0,0491 μg, die Gesamtmenge an Δmospp1(4) beträgt 0,0288 μg, die Gesamtmenge an Δmoswd2(5) 0,0527 μg.
Abbildung 3. Elektrophorese-Nachweis von DNA nach Ultraschall. Nach der Ultraschallbeschallung wird die DNA einem 1% igen Agarosegelexperiment unterzogen, um die Länge von DNA-Fragmenten zu analysieren. Die beschallte DNA-Fragmentlänge beträgt 200-500 bp, und diese DNA-Fragmente können für die folgenden Schritte von ChIP-seq verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Bioanalytik-Spur von Input- und ChIP-Proben. Die Abbildung zeigt die Fragmentverteilung jeder Probe, wobei die Abszisse die Fragmentgröße und die Ordinate die Spitzengröße darstellt. Die auf dem Bioanalysator laufenden Proben sind Eingang P131(2), Δmobre2(3) (Eingang), Δmospp1(4) (Eingang), Δmoswd2(5) (Eingang), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Unter ihnen zeigt die Verteilung von Input P131(2), Δmobre2(3) (Input), Δmospp1(4) (Input), Δmoswd2(5) (Input) den Hauptpeak unter 100 bp, aber es gibt DNA-Verteilung bei 100-500 bp. Die wahre Verteilung von P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) und Δmoswd2(5) liegt zwischen 100-500 bp als Hauptpeak26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In jüngster Zeit hat sich ChIP-seq zu einer weit verbreiteten genomischen Analysemethode zur Bestimmung der Bindungsstellen von TFs oder Anreicherungsstellen, die durch bestimmte Histone modifiziert wurden, zu einem weit verbreiteten. Im Vergleich zur bisherigen ChIP-seq-Technologie ist die neue ChIP-seq-Technologie hochsensibel und flexibel. Die Ergebnisse werden in hoher Auflösung ohne negative Auswirkungen geliefert, wie z.B. das Rauschsignal, das durch die unspezifische Hybridisierung von Nukleinsäuren verursacht wird. Obwohl es sich um eine gängige Genexpressionsanalyse handelt, wurden viele Berechnungsmethoden validiert, und die Komplexität der ChIP-seq-Daten in Bezug auf Rauschen und Variabilität macht es für ChIP-seq besonders schwierig, dieses Problem zu überwinden. In Bezug auf die Datenanalyse ist die Verwaltung und Analyse der großen Datenmenge, die durch ChIP-seq-Experimente generiert wird, ebenfalls eine Herausforderung, die noch nicht angemessen angegangen wurde.
Es gibt mehrere wichtige Schritte im ChIP-seq-Experiment. Zunächst einmal ist die Vorbereitung der Protoplasten sehr wichtig. Es ist notwendig, die Kollapszeit zu kontrollieren, damit hochwertige Protoplasten gesammelt werden können. Ultraschall ist auch sehr wichtig, die Ultraschallzeit sollte kontrolliert werden, zu lang oder zu kurz wird nicht funktionieren. Zweitens sollte die Menge der zugesetzten Antikörper ausreichen, um die Anreicherung von mehr DNA-Fragmenten zu erleichtern, die an das Protein binden. Bei der Überprüfung der Qualität und Quantität der im ChIP-seq-Experiment ausfällten DNA wurde Qubit Fluorometer verwendet. Agilent 2100 wurde verwendet, um die Massenkonzentration und Fragmentverteilung der DNA nachzuweisen, was eine Grundlage dafür liefert, ob die Probe für nachfolgende Bibliotheksaufbau- und Sequenzierungsexperimente verwendet werden kann.
Insgesamt verbessert dieses Protokoll das Verständnis der gesamten genomweiten Verteilung epigenetischer Modifikationen, die pathogene Gene während der Pathogeninfektion regulieren. Diese Methode wird dazu beitragen, molekulare Mechanismen epigenetischer Modifikationen zu identifizieren und neue Zielgene während der Pilzentwicklung und pathogeninduzierten Pathogenese in M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen zu identifizieren.
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Disclosures
Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen 31871638), dem Special Scientific Research Project der Beijing Agriculture University (YQ201603), dem Scientific Project des Beijing Educational Committee (KM201610020005), dem High-level scientific research cultivation project der BUA (GJB2021005) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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