Summary
여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
크로마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)은 전사 인자(TF), 크로마티안 레귤레이터 및 히스톤 수정의 전체 게놈 위치를 매핑하고 TF 결합 패턴 및 그의 톤 후번역 변형을 밝히기 위한 전체 게놈을 검출하기 위한 강력하고 널리 사용되는 분자 기술입니다. 히스톤 메틸화와 같은 크로마틴 수정 활동은 종종 특정 유전자 조절 서열에 채용되어 크로마틴 구조의 국소적 변화를 일으키고 특정 전사 효과를 초래합니다. 쌀 폭발은 전 세계적으로 쌀에 치명적인 곰팡이 질병이며 곰팡이 식물 상호 작용을 연구하기위한 모델 시스템입니다. 그러나, 히스톤 수정이 Magnaporthe oryzae에 있는 그들의 독성 유전자를 통제하는 방법에 있는 분자 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 더 많은 연구원은 그의 음색 후생유전학 수정이 그들의 표적 유전자를 통제하는 방법을 연구하기 위하여 ChIP-seq를 이용할 필요가 있습니다. ChIP-seq는 또한 동물과 식물에 있는 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 연구하기 위하여 널리 이용됩니다, 그러나 식물 병리학의 분야에서 적게 이용되고 잘 개발되지 않았습니다. 본 논문에서는, M. oryzae에서 기능적 표적 유전자에 결합하는 히스톤 메틸화(예: H3K4me3)의 게놈 전체 분포를 확인하기 위해 ChIP-seq의 실험 과정 및 작동 방법을 설명한다. 여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Introduction
후성 유전학은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않고 유전자 발현의 유전적 변화를 지칭하는 유전 연구의 한 가지이다. 후생유전학적 조절이 고차구조로접기 및 조립의 동적 과정을 통해 유전자 발현을 조절하고 영향을 미치는 크로마티닌을 포함한 진핵세포의 성장과 발달에 중요한 역할을 한다는 것을보여주었다. 크로마틴 리모델링 및 공유 히스톤 수정은 크로마틴 폴리머의 변이를 통해 크로마틴의 기능 및 구조를 조절하여 유전자 발현3,4,5,6을조절하는 기능을 달성한다. 히스톤의 번역 후 변형은 아세틸화, 인산화, 메틸화, 일축비퀴티니션, 스모틸화 및 ADP 리보실레이션7,8,9를포함한다. 히스톤 H3K4 메틸화, 특히 트리메틸화는, 진핵생물10,11에서전사 복제, 재조합, 수리 및 RNA 처리와 관련된 전사 시작 부위에 매핑되었다.
ChIP-seq 기술은 2007년에 도입되었으며, 전사 조절 및 후성유전학기전(12,13)의게놈 전체 분석을 위한 실험 표준이 되었다. 이 방법은 게놈 전체 규모와 DNA 결합 단백질의 DNA 세그먼트를 포함하는 히스톤 또는 전사 인자 상호 작용 정보를 얻기에 적합합니다. 관심 있는 단백질에 교차된 모든 DNA 순서는 크로마틴 복합체의 일부로 coprecipitate 것입니다. 차세대 염기서열 분석 기술은 또한 36-100 bp의 DNA를 서열화하는 데 사용되며, 이는 해당 표적 게놈과 일치한다.
식물성 균류에서, 연구는 최근에 히스톤 메틸화 수정이 병원성 과정에서 그들의 표적 유전자를 통제하는 방법을 연구하기 시작했습니다. 몇몇 이전 연구 결과는 히스톤 메틸라제 관련 유전자의 규정이 주로 유전자 침묵과 이차 대사 산물 (SM)의 생산을 촉매에 반영한다는 것을 증명했습니다. MoSet1은 M. 오리자에 있는 H3K4 메틸라제입니다. 이 유전자의 녹아웃은 H3K4me3 수정14의완전한 삭제를 초래한다. 야생형 균주와 비교하여, 돌연변이체내의 MoCEL7C 유전자의 발현은 CMC 유도 상태 및 비유도 상태(포도당 또는 셀로바이오세)에서 억제되며, MoCEL7C의 발현은15증가하였다. 후사리움 에서,KMT6는 H3K27me3의 메틸화 변형을 촉매하고, 곰팡이의 정상적인 발달을 조절하고, SM 유전자클러스터(16, 17,18,19)를포함하는 "비밀게놈"을 조절하는 데 도움을 줄 수 있다. 2013년, 코놀리는 H3K9와 H3K27 메틸화가 표적유전자(20)의억제를 조절하는 이차 대사산물 및 이펙터 인자를 통해 곰팡이의 병원성 과정을 조절한다고 보고했다. 아스퍼길러스에서는,히스톤 H3K4me2 및 H3K4me3의 변형은 유전자 활성화와 관련이 있으며 SM 유전자클러스터(21)의크로마틴 수준 조절을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. M. oryzae에서,Tig1 (효모및 포유동물의 티그1에 동종)은 HADC (히스톤 디스티틸라제)22이다. Tig1 유전자의 녹아웃은 null 돌연변이체에서 병원성과 포자 생산 능력의 완전한 손실로 이어집니다. 감염성최해(22)를생성할 수 없는 peroxygen 환경에 더 민감하다.
M. oryzae.에 의한 쌀 폭발은 세계에서 가장 큰 쌀 재배 지역에서 가장 심각한 쌀 질환 중 하나입니다19. 그것의 대표적인 감염 과정 때문에, M. oryzae는 많은 중요한 병원성 균류의 감염 과정과 유사합니다. 분자 유전 적 작업을 쉽게 수행 할 수 있기 때문에 곰팡이식물 상호 작용(23)을연구하기위한 모델 유기체가되었습니다. M. oryzae의 감염 과정의 모든 단계를 차단하면 감염이 실패 할 수 있습니다. 감염 과정 동안 형태학적 변화는 전체 게놈 기능 및 유전자 전사에 의해 엄격하게 조절된다. 그 중에서도 히스톤 메틸화와 같은 후성유전학적 변형은 기능성유전자(24,25)의전사 조절에 필수적인 역할을 한다. 그러나, 지금까지, M. oryzae에 있는 병인 유전자의 전사에 있는 히스톤 메틸화 및 히스톤 아세틸화와 같은 후성 유전학 적 변형의 분자 기계장치에 몇몇 연구 결과가 행해졌습니다. 따라서, 이러한 병원성 관련 유전자의 상류 및 하류 규제 네트워크를 연구하면서 쌀 폭발 곰팡이의 후성유전학 적 조절 메커니즘을 더욱 개발하는 것은 쌀 폭발 예방 및 제어 전략을 개발하는 데 도움이 될 것이다.
ChIP-seq와 같은 기능성 유전체학의 발달, 특히 후성 유전학에서, 이 높은 처리량 데이터 수집 방법은 염색체에 대한 연구를 가속화했습니다. ChIP-seq 실험 기술을 사용하여, M. oryzae 및 기타 필라멘트 균류에서 히스톤 메틸레이션(예: H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3)의 게놈 전체 분포를 식별할 수 있다. 따라서,이 방법은 후성 유전학 수정이 식물 병리학에서 곰팡이 병인 동안 후보 대상 유전자를 조절하는 방법 의 밑에 분자 메커니즘을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Protocol
1. M. 오리자에서 프토플라스트 준비
- 오트밀 토마토 한천(OTA)을 준비합니다.
- 오트밀 30-50g의 무게와 20 분 동안 물 (ddH2O)의 800 mL로 끓입니다. 거즈의 두 층을 통해 필터링하고 여과를 가져 가라.
- 잘 익은 토마토를 고르고 껍질을 벗깁니다. 주스를 짜내고, 거즈 2층을 걸이면 여과주스 150mL를 수집합니다.
- 모든 토마토 주스와 준비된 귀리 여과를 완전히 섞고 ddH2O를 최대 1000mL까지 추가합니다.
- OTA 250mL, 500mL 원추형 플라스크에 2.5 g의 천가 분말을 넣고 20분 동안 오토클레이브를 넣습니다. 25 °C에 보관하십시오.
- 오토클레이브 OTA 25mL을 유리 5cm x 5cm 페트리 접시에 붓습니다. 페트리 요리 총 10가지를 준비합니다. OTA가 페트리 요리에 고화된 후 25°C에서 거꾸로 요리를 보관하십시오.
- 살균 된 이쑤시개를 사용하여 M. oryzae (야생 형 균주 P131, 녹아웃 균주 Δmobre2, Δmospp1 및 Δmoswd2)에서작은 균사체를 발굴하고 준비 된 OTA 접시에 배치하십시오. 빛 조건에서 28 °C에서 4-6 일 동안 배양하십시오.
참고: 페트리 접시를 거꾸로 뒤집어 오염을 방지합니다. - 1000 μL의 액체 완전 매체(CM) (효모 추출물 0.6%, 효소 카제인 가수 분해0.3%, 산성 카제인 가수 분해, 1% 포도당)를 1000 μL 파이펫을 사용하여 OTA 접시에 첨가합니다.
참고 : 최면은 4-6 일 동안 OTA 요리에서 성장했다. - 접종 루프로 야생 형 변형 및 녹아웃 변형의 균주를 긁어.
- 미셀리아 파편을 수집하고 액체 완전 매체 (CM)의 250mL로 전송합니다.
- 150 rpm에서 흔들림으로 36 시간 동안 28 °C에서 삼각형 플라스크에서 곰팡이 파편을 성장시면 됩니다.
- 깔때기를 사용하여 곰팡이 최면을 필터링하고 수집하십시오.
- 0.7 M NaCl 용액의 500mL로 곰팡이 최면을 씻으세요.
- 곰팡이 균사체를 수집하고 무게.
참고: 체질은 계량하기 전에 건조할 필요가 없습니다. - 곰팡이 균셀륨 의 1 g 당 용해 효소 투과 용액의 ~ 1 mL을 추가합니다.
- 트리코데르마 하르지아눔으로부터 용해 효소를 0.7M NaCl에서 용해시켜 20 mg/mL 용해 효소 투과용을 준비한다.
- 150 rpm에서 흔들림으로 3-4 h에 대해 28 °C에서 용하용 최해를 놓습니다.
- 용액 0.7m NaCl 용액50mL로 용액을 씻으시다.
- 2,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 프톱서와 원심분리기를 수집합니다.
- 원심 분리 후, 상체를 신중하게 폐기하십시오. 4°C에서 0.7M NaCI 버퍼의 20mL에서 프톱라스트를 다시 중단한다.
2. 생체 내 크로스링크 및 초음파 처리
- 37% 포름알데히드의 55 μL을 추가 (최종 농도가 1 될 때까지 드롭에 의해 포름 알데히드 드롭추가) 교차 연결에 대한 프로토프스트를 포함하는 NaCI 버퍼의 2 mL에.
- 10 분 에서 25 ° Cfor에서 프토플라스트를 배양합니다.
- 각 튜브에 10x 글리신 20μL을 추가하여 반응하지 않은 포름알데히드를 담금질합니다.
- 5 분 동안 25 °C에서 혼합하고 배양하려면 소용돌이.
- 2,000 x g 및 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 상체를 신중하게 폐기하십시오. 0.7 M NaCI 용액의 1mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 2,000 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 상체를 신중하게 폐기하십시오. RIPA 버퍼의 750 μL에서 펠릿을 재연 (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1 % NP-40, 0.5 % 나트륨 데옥시 콜린, 0.1 % SDS 및 프로테아제 억제제).
- 20배 프로테아제 억제제의 37.5 μL을 추가합니다.
- 프톱서스트를 이전 단계에서 1.5mL 원심분리기 튜브로 이송한다.
- 초음파 처리(25% W, 출력 3s, 정지 5s, 4°C)를 약 10분 동안 초음파 처리기로 즉시 수행합니다. 이 단계의 목적은 최상의 조건을 결정하기 위해 시간 동안 교차 연결된 용액을 초음파 처리하는 것입니다.
참고: 이 단계에서 는 -80°C에서 용액을 동결할 수 있습니다. - 초음파 처리에 대한 최적의 조건이 이미 결정된 경우 다음 단계로 진행하십시오.
- 원하는 경우 아가로즈 젤 분석(비세어드 DNA)을 위해 5μL의 프토프러스트를 제거하십시오.
- 8 분 동안 초음파 균질화로 초음파 처리하여 크로마틴을 전단하십시오 (25 % W, 출력 3 s, 정지 5 s, 4 °C).
- 샘플이 초음파로 파손된 후 샘플의 일부를 "입력"으로 꺼낸다. 입력은 ChIP 실험을 수행하지 않으며 시료가 초음파 처리된 후에 방출된 모든 DNA 및 단백질을 포함합니다.
- 초음파 처리 후, DNA 단편의 길이를 분석하기 위해 1 % 아가로즈 젤 전기 포이를 실행합니다.
참고: 아가로즈 겔 전기포고증 결과는 DNA 단편의 길이가 200-500bp(도 4)임을보여준다. - 단백질 분해를 방지하기 위해 초음파 튜브를 얼음에 놓습니다.
- 원심분리기는 10,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 가능합니다.
- 원심분리 후 원심분리형 서퍼네티드를 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮기고 나중에 사용하기 위해 -80°C에 저장한다. 이 단계에서 얻은 크로마틴 용액은 후속 IP에 사용될 수 있다.
- IP 실험을 수행하기 전에 각 크로마틴 샘플을 1:10의 비율로 1x RIPA 버퍼(예: 1μL의 1μL에 1×RIPA 버퍼)로 희석합니다.
3. 교차 연결 단백질 /DNA의 IP
- 2mL 원심분리기 튜브에 초파라자성 단백질 구슬의 파이펫 50 μL. 튜브를 자기 스탠드에 놓습니다. 마그네틱 비즈가 침전하게 됩니다. 상부체를 제거합니다.
- 튜브에 1x RIPA 버퍼(얼음 위에서 미리 냉각)의 1mL을 추가하고 초파라자성 단백질 비드를 세 번 세척합니다. 세척 후, 자기 스탠드에 튜브를 배치하고 상체를 제거합니다. 각 튜브에 1x RIPA 버퍼 100 μL을 추가합니다.
- 코르마틴 시료 300μL(2 x 107세포 사용), 초파라자성 단백질 비드 100 μL, H3K4me3 항체 4μL을 튜브에 첨가하였다.
- 마우스 IgG가 있는 샘플을 음수 컨트롤로 사용합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스 IgG에는 0.01 M 인산염 버퍼와 0.15 M NaCl이 포함되어 있으며 20°C 이하로 고정된 상태로 유지됩니다(재료 표참조). - 잘 혼합 한 후, 로터리 셰이커에 샘플을 놓고 4 ° C, 30 x g에서하룻밤 배양한다.
참고: 면역침전(IP)의 인큐베이션 시간을 줄일 수 있다. 잠복기는 다른 요인(예를 들어, 항체, 유전자 표적, 세포 모형 등)에 달려 있으며 경험적으로 시험될 필요가 있을 것이다.
4. IP 제품 수집 및 헹도
- 펠트는 자기 스탠드에 배치하여 초파라자성 단백질 구슬을 배치합니다. 상체를 속이고 폐기하십시오.
- 1x RIPA 버퍼의 1mL에서 구슬을 재연하여 초파라자성 단백질 비드 항체/크로마틴 복합체를 세척한다.
- 회전 셰이커에 튜브를 5분 간 헹구고 30 x g에서 상퍼를 제거합니다.
- 저염 면역 복합 세척 버퍼 (0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X-100, 2mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1, 150 mM NaCl)의 1 mL을 추가합니다.
- 회전 셰이커에 튜브를 5분 동안 헹구고 상체를 제거합니다.
- 고염 면역 복합 세척 버퍼(0.1% SDS, 트리톤 X-100 1%, 2mM EDTA, 20m Tris-HCl pH 8.1, 500mM NaCl)를 원심분리관에 1mL를 추가한다.
- 튜브를 회전 셰이커에 5분 동안 놓고 상퍼를 제거합니다.
- 원심분리기 튜브의 LiCl 1mL(0.25M LiCl, NP-40 1%, 탈옥초산 1%, mM EDTA 10mMM) 및 10mM Tris-HCl pH 8.1mL로 헹구고 있습니다.
- 튜브를 회전 셰이커에 5분 동안 놓고 상퍼를 제거합니다.
- 0.25 M LiCI 버퍼의 1mL로 테스트 튜브를 다시 헹구고 파이펫으로 상체를 제거한 다음 상체를 폐기합니다.
- TE 버퍼 1mL(10m Tris-HCl pH 8.1, 1mM EDTA)를 추가합니다.
- 튜브를 회전 셰이커에 30 x g에서 5 분 동안 놓습니다.
- 1mL TE 버퍼로 튜브를 다시 씻고 파이펫으로 상체를 제거합니다.
- 구슬을 수집합니다.
5. 단백질/DNA 복합체의 용출
- 모든 IP 및 입력 튜브에 대해 용출 버퍼(20% SDS의 10μL, 1M NaHCO3의20 μL, 멸균 증류 H2O170 μL)를 준비합니다.
- 각 원심분리기 튜브에 100 μL의 용출 버퍼를 추가합니다.
- 15 분 동안 65 °C에서 용출.
- 원심분리기는 10,000 x g 및 4°C에서 1분 동안 상체를 새로운 원심분리기 튜브로 수집합니다.
- 단계 5.2 - 5.4를 반복하고 용해를 결합합니다. 입력 DNA의 10 μL에 190 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. (총 부피 = 200 μL).
6. 단백질/DNA 복합체의 역교차연결
- 모든 튜브에 5M NaCl의 8 μL을 추가하고 DNA 단백질 크로스링크를 반전시키기 위해 65°C에서 4-5h 또는 하룻밤 사이에 배양합니다.
참고: 이 단계 후 샘플을 -20°C로 저장하고 필요한 경우 다음 날 프로토콜을 계속합니다. - RNase A의 1 μL을 추가하고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- Proteinase K4 μL(20 mg/mL에서 H2O로용해되고 -20°C)에 저장하여 각 튜브에 넣고 45°C에서 1-2h로 배양합니다.
7. DNA의 정화 및 회복
- 페놀/클로로폼/이소아밀 알코올 혼합물(25:24:1의 비율)을 원심분리기 튜브에 550 μL을 추가합니다.
- 혼합물을 1분 동안 철저히 소용돌이시다.
- 원심 분리기는 10,000 x g에서 15 분 동안 슈퍼 나티얼을 흡인합니다.
- 추출된 상체를 이전 단계에서 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
- 3M 나트륨 아세테이트 용액의 1/10 부피, 절대 에탄올 2.5부, 글리코겐 3μL(20 mg/mL)을 튜브에 첨가합니다.
- 샘플을 냉장고에 넣고 -20°C의 냉장고에 하룻밤 동안 강수량을 제공합니다.
- 원심분리기는 10,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 가능합니다.
- 원심 분리 후 상체를 폐기하십시오. 펠릿을 75% 에탄올 1mL로 3회 세척하여 10,000 x g로 씻어주세요(신선하게 준비해야 함).
- 세척된 침전을 깨끗한 벤치에 놓고 알코올을 건조시합니다.
- 침전을 충분히 용해시키기 위해 멸균 된 H2O의 50 μL을 추가합니다.
- 시퀀싱 어댑터를 DNA 단편으로 리게이트하고 고처리량 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 DNA를 시퀀싱합니다.
8. DNA 수리 및 솔렉사 도서관 건설
- DNA 최종 수리 키트(1-34 μL DNA, 10x 엔드 수리 버퍼의 5 μL, 각 dNTP의 5 μL, 10mM ATP의 5 μL, 최종 수리 효소 믹스 1μL, H2O)를사용하여 무딘 DNA를 생성하도록 DNA 끝을 수리하십시오.
- PCR 정제 키트 또는 페놀을 사용하소서 클로로폼 추출을 사용하여 DNA를 정화합니다. Elute 또는 1x TE pH 7.4의 30 μL에서 DNA를 재중단합니다.
- "A"를 3'엔드에 추가합니다 (단계 2에서 DNA30 μL, H2O의 2 μL, 10x Taq 버퍼의 5 μL, 1mM dATP의 10 μL, Taq DNA 폴리머라제 3 μL). 시약을 0.2mL PCR 원심분리기 튜브에 넣고 잘 섞어 PCR 기계에서 10분 동안 반응한다.
- DNA 10 μL, H2O의 9.9 μL, T4 DNA 리구아제 버퍼의 2.5 μL, 어댑터 올리고 믹스의 0.1 μL, T4 DNA 리게아제의 2.5 μL을 혼합하여 링커 결찰을 수행합니다. 시약을 0.2 mL PCR 원심분리기 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 4 시간 동안 16 °C에서 배양하십시오.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다. 용출 버퍼의 20-25 μL을 가진 엘ute.
- DNA 라이브러리가 확립되기 전에, 후속 시퀀싱 실험에 대한 사용을 확인하기 위해 정제 된 DNA의 농도를 식별합니다.
- 형광계를 사용하여 DNA 농도를 감지합니다. 얼음에 샘플을 녹인 후, 철저하게 혼합하고 원심 분리기는 1000 x g와 4 °C에서 30 초 동안 섞는다. 그런 다음 적절한 양의 시료를 가지고 260 nm의 파장을 가진 불소계로 측정합니다.
- 시퀀싱을 위해 일루미나 염기서열분석 플랫폼에 자격을 갖춘 품질과 농도가 있는 DNA 샘플을 배치합니다.
- 시퀀싱 전에 PCR 프라이머, PE1.0 및 PE2.0 및 2배 고충실도 마스터 믹스(DNA 10.5 μL, 2배 고충실도 마스터 믹스의 12.5 μL, PCR 프라이머 PE1.0의 1 μL, PCR 프라이머 PE2.0)의 1 μL을 사용하여 DNA를 증폭시합니다. 시약을 0.2 mL PCR 원심분리기 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
- PCR 기계에서 PCR 반응을 실행 : 2 분 동안 95 °C 전변; 이어서 10s에 대한 95°C 의 35사이클, 15s에 대해 60°C에서 어닐링, 5s에 대한 72°C에서 연장; 5 분 동안 72 °C에서 최종 연장. 마지막으로, 4°C에서 반응을 배양한다.
- 클러스터 생성을 위해 DNA를 사용하고 일루미나 히세크 2000에서 시퀀싱별 합성을 수행한다.
참고: 이 프로토콜에서는 일루미나 유동 셀이 클러스터 생성에 사용되었습니다. 시퀀싱-합성은 제조업체의 지시에 따라 일루미나 게놈 분석기에서 수행되었다.
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Representative Results
ChIP-seq 메서드의 전체 흐름 차트는 도 1에표시됩니다. ChIP-seq 실험은 야생형 균주 P131 및 모폭2, 모스프1및 moswd2 유전자가 없는 3개의 null 돌연변이 균주에서 H3K4me3에 대한 항체를 사용하여 M. oryzae에서히스톤 H3K4me3 분포의 전체 게놈 전체 프로파일을 검증하였다. 야생형 스트레인, Δmobre2,Δmospp1및 Δmoswd2의 프톱서스트는 25% W, 출력 3s, 정지 5s, 4°C에서 제조 및 초음파 처리되었다. 또한, 크로마틴은 H3K4me3 항체 및 다이나비즈 단백질 A/G로 면역정제되었다. 이어서, DNA 단편은 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 페놀 클로로폼 방법을 사용하여 추출되었고, 고처리량 시퀀싱 플랫폼에서 단 단단으로 시퀀싱하였다.
H3K4me3 항체를 이용한 ChIP-seq 방법을 이용한 야생형, Δmobre2,Δmospp1및 Δmoswd2 균주의 대표적인 결과가 도 2에도시된다. Δmobre2,Δmospp1및 Δmoswd2 삭제 돌연변이의 H3K4me3 신호는 기능적 표적 영역에서 현저히 감소하였다. 도 2에도시된 바와 같이, MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 및 MGG_04235 포함한 일부 선택된 후보 표적 유전자는 H3K4me3 분포를 위해 매핑되었다. 야생형 균주 P131에 비해, Δmobre2, Δmospp1및 Δmoswd2 삭제 돌연변이체에서 풍부한 H3K4me3-ChIP-seq의 신호가 크게 감소하였다(그림2)26. 이러한 결과는 H3K4me3 수정이 M. oryzae에서 표적 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
그림 1. M. 오리자에 있는 ChIP-seq 방법의 플로우 차트. (A) M. 오리자의 게놈 DNA는 1% 포름알데히드와교차연결되었다. (B) 분해 된 폭발 곰팡이 세포, 깨진 DNA, 무료 DNA 및 히스톤 결합 DNA가 이후에 수득되었다. (C) DNA 단편은 히스톤에 결합되어 H3K4me3 항체에 대한 특정 결합에 의해 추출되었다. (D) 역교차를 통해 정제된 DNA는 H3K4me3 히스톤에 의해 변형된 DNA 단편을 이후에 얻었다. (E-F) DNA 단편은 시퀀싱되었고, 시퀀싱 결과를 비교하고, 서열은 M. oryzae DNA 단에서 확인되었다. (G) M. 오리자에서 H3K4me3 히스톤의 특이적 유전자 및 loci가 회수되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. Δmobre2,Δmospp1및 Δmoswd2 삭제 돌연변이는 대상 영역에서 H3K4me3 프로파일을 현저히 감소시켰습니다. Δmobre2,Δmospp1및 Δmoswd2 삭제 돌연변이제에서 겹치는 유전자의 코딩 영역 주위의 농축 피크의 H3K4me3-ChIP-seq 분포는 MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 및 MGG_04235 유전자26의야생형 균주에 비해 감소된다. [0-2074]로 표시된 WT(입력)의 숫자는 게놈 DNA의 범위에서 ChIP의 결과를 의미한다[0-2074]. [0-2074]는 염색체 6.이 염색체 6.의 0-2074bp를 지칭하며, 이는 염색체 6의 DNA 분포만을 나타낸다. 전체 시퀀싱 결과는 젠뱅크에 제출되었습니다. (https/www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/가입 649321) 26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 일련 번호 | 샘플 이름 | 샘플 일련 번호 | 튜브 수 | 합계(μg) | 조각 분포 | 데이터베이스 유형 | 발언 | ||||
| 1 | 입력 | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | 주요 피크는 100bp 이하이지만 100bp-500bp 사이에 DNA 분포가 있습니다. | ChIP-세크 | 조각이 너무 작습니다. | ||||
| P131 (2) | |||||||||||
| 2 | 입력 | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | 주요 피크는 100bp 이하이지만 100bp-500bp 사이에 DNA 분포가 있습니다. | ChIP-세크 | 조각이 너무 작습니다. | ||||
| Δmobre2 (3) | |||||||||||
| 3 | 입력 Δmospp1 (4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | 주요 피크는 100bp 이하이지만 100bp-500bp 사이에 DNA 분포가 있습니다. | ChIP-세크 | 조각이 너무 작습니다. | ||||
| 4 | 입력 Δmoswd (5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | 주요 피크는 100bp 이하이지만 100bp-500bp 사이에 DNA 분포가 있습니다. | ChIP-세크 | 조각이 너무 작습니다. | ||||
| 5 | P131 (2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | 주요 피크는 100bp-500bp 사이입니다. | ChIP-세크 | |||||
| 6 | Δmobre2 (3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | 주요 피크는 100bp-500bp 사이입니다. | ChIP-세크 | |||||
| 7 | Δmospp1 (4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | 주요 피크는 100bp-500bp 사이입니다. | ChIP-세크 | |||||
| 8 | Δmoswd (5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | 주요 피크는 100bp-500bp 사이입니다. | ChIP-세크 | |||||
표 1. 이 실험에서 DNA의 총 양. 입력 P131(2)의 총 량은 2.7948 μg이며, Δ mobre2(3)(입력)의 총 량은 2.4748 μg이며, Δmospp1(4)의총 량은 3.22 μg이고, Δmoswd2(5) (입력)의 총 양은 3.97 μg이며, P131(2)의 총 양은 0.0735 μg이며, 총 계량의 Δmobre2(3)는0.0491μg, Δmospp1(4)의총 양은 0.0288 μg이며, Δmoswd2(5)의총 양은 0.0527 μg이다.
그림 3. 초음파 후 DNA의 전기 전도 검출. 초음파 초음파 처리 후, DNA는 DNA 단편의 길이를 분석하기 위해 1 % 아가로즈 젤 실험을 실시한다. 초음파 처리된 DNA 단편 길이는 200-500 bp로부터이며, 이러한 DNA 단편은 ChIP-seq의 다음 단계에 사용될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 입력 및 ChIP 샘플의 바이오 분석기 추적. 그림은 각 샘플의 조각 분포를 나타내며, 여기서 abscissa는 조각 크기를 나타내고, 좌표는 피크 크기를 나타낸다. 바이오 분석기에서 실행되는 샘플은 입력 P131(2), Δmobre2(3) (입력), Δmospp1(4) (입력), Δmoswd2(5) (입력), P131 (2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(4), Δ moswd (5)입니다. 그 중에서도 입력 P131(2), Δmobre2(3)(입력), Δmospp1(4) (입력), Δmoswd2(5) (입력)의 분포는 주요 피크가 100 bp 미만이지만 DNA 분포가 100-500 bp로 나타난다. P131(2), Δmobre2(3),Δmospp1(4),Δmoswd2(5)의실제 분포는 주피크(26)로서100-500bp 사이이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근에는 ChIP-seq가 특정 히스톤에 의해 변형된 TF 또는 농축 부위의 결합 부위를 결정하는 데 널리 사용되는 게놈 분석 방법이 되고 있다. 이전 ChIP-seq 기술과 비교하여 새로운 ChIP-seq 기술은 매우 민감하고 유연합니다. 결과는 핵산의 비특이적 혼성화에 의한 잡음 신호와 같은 부정적인 영향 없이 고해상도로 제공된다. 이것은 일반적인 유전자 발현 분석이지만, 많은 계산 방법이 검증되었으며, 소음과 가변성 측면에서 ChIP-seq 데이터의 복잡성으로 인해 ChIP-seq가 이 문제를 극복하기가 특히 어려워졌습니다. 데이터 분석 측면에서 ChIP-seq 실험에서 생성된 대량의 데이터를 관리하고 분석하는 것도 아직 적절히 해결되지 않은 과제입니다.
ChIP-seq 실험에는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 우선, 프톱서스트의 준비는 매우 중요합니다. 고품질 프토플라스트를 수집할 수 있도록 붕괴 시간을 제어할 필요가 있습니다. 초음파는 또한 매우 중요하며 초음파 시간은 너무 오래 또는 너무 짧아서 작동하지 않습니다. 둘째, 첨가된 항체의 양은 단백질에 결합되는 더 많은 DNA 단편의 농축을 용이하게 하기에 충분해야 한다. ChIP-seq 실험에서 침전된 DNA의 품질 및 양을 확인할 때 Qubit Fluorometer가 사용되었다. 민첩성 2100은 DNA의 질량 농도 및 단편 분포를 검출하는 데 사용되었으며, 이는 시료가 후속 라이브러리 설립 및 시퀀싱 실험에 사용될 수 있는지 여부에 대한 기초를 제공한다.
전반적으로, 이 프로토콜은 병원체 감염 도중 병원성 유전자를 통제하는 후성 유전학 수정의 전체 게놈 전체 분포의 이해를 향상합니다. 이 방법은 후성 유전학 수정의 분자 기계장치를 확인하는 데 기여하고 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류에 있는 곰팡이 발달 및 병원체 유도한 병원체 인발생 도중 새로운 표적 유전자를 확인하는 데 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 존재하지 않는다고 선언했다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31871638 보조금 제1호), 베이징농업대학교 특별과학연구프로젝트(YQ201603), 베이징교육위원회 과학프로젝트(KM201610020005), BUA(GJB2021005)의 고도과학연구육성사업으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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