इंजीनियर एचईके कोशिकाओं का उपयोग करके एमआरजीपीआरएक्स 2 को सक्रिय करने वाले पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग
Summary
एमआरजीपीआरएक्स 2 रिसेप्टर के माध्यम से मस्तूल कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं कि छोटे पेप्टाइड्स की एक पुस्तकालय पैदा करने के लिए तकनीक वर्णित हैं। संबद्ध तकनीकें आसान, सस्ती हैं, और अन्य सेल रिसेप्टर्स में विस्तारित की जा सकती हैं।
Abstract
चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण सेल रिसेप्टर्स के लिए विशिष्ट लिगांड की पहचान करना कई अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें नए चिकित्सीय के डिजाइन और विकास शामिल हैं। मास से संबंधित जी-प्रोटीन रिसेप्टर-X2 (MRGPRX2) एक महत्वपूर्ण रिसेप्टर है जो मस्तूल सेल सक्रियण को नियंत्रित करता है और इस प्रकार, सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को निर्देशित करता है। एमआरजीपीआरएक्स2 के लिए कई लिगामेंट्स की पहचान की गई है और इसमें पाम्स, डिवेंसिन, एलएल-37 और अन्य प्रोटीन टुकड़े (यानी, अपमानित एल्बुमिन) जैसे अंतर्जात पेप्टाइड्स शामिल हैं। एमआरजीपीआरएक्स 2 विशिष्ट लिगामेंट्स की आगे की पहचान के लिए बड़ी संख्या में पेप्टाइड्स (यानी पेप्टाइड लाइब्रेरी) की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है; हालांकि, मस्त कोशिकाओं को इन विट्रो बनाए रखने के लिए मुश्किल और महंगा है और इसलिए, बड़ी संख्या में अणुओं की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए किफायती नहीं है। वर्तमान कागज एचईपीपीएक्स 2 को व्यक्त करते हुए एचईपीपीएक्स 2 का उपयोग करके छोटे पेप्टाइड अणुओं के पुस्तकालय को डिजाइन, विकसित करने और स्क्रीन करने की एक विधि को दर्शाता है। यह सेल लाइन बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत आसान और सस्ती है और इन विट्रो हाई-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। सक्रियण पर इंट्रासेलुलर कैल्शियम फ्लक्स को चिह्नित करने के लिए कैल्शियम संवेदनशील फ्यूरा-2 फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग सक्रियण की निगरानी के लिए किया गया था। कैल्शियम एकाग्रता की गणना के लिए 340 और 380 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के खिलाफ 510 एनएम पर फ्यूरा-2 की फ्लोरेसेंस तीव्रता के अनुपात का उपयोग किया गया था। इस प्रणाली को सत्यापित करने के लिए उपयोग की जाने वाली पेप्टाइड लाइब्रेरी अंतर्जात प्रोड्रेनोमेदुललिन एन-टर्मिनल 12 (पीएएमपी-12) स्रावगोग पर आधारित थी, जिसे उच्च विशिष्टता और आत्मीयता के साथ एमआरजीपीआरएक्स2 को बांधने के लिए जाना जाता है। इसके बाद पेप्टाइड्स अमीनो एसिड ट्रंकेशन और पीएएमपी-12 पर लागू एलनिन स्कैनिंग तकनीकों के माध्यम से उत्पन्न हुए थे। यहां वर्णित विधि बाध्यकारी डोमेन और अन्य महत्वपूर्ण मापदंडों की पहचान करने के लिए यौगिकों की एक बड़ी लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग के लिए सरल और सस्ती अभी तक मजबूत है जो रिसेप्टर सक्रियण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
Introduction
मस्त कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अभिन्न हिस्सा हैं और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। मस्तूल कोशिकाओं को मुख्य रूप से इम्यूनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) के लिए एंटीजन के बंधन से सक्रिय किया जाता है – एफसीεआरआई रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स, या हाल ही में खोजे गए मास संबंधित जी-प्रोटीन रिसेप्टर-X2 (एमआरजीपीआरएक्स2) 1द्वारा। MRGPRX2 सक्रियण को कई प्रतिरक्षा और भड़काऊ रोगों से जोड़ा गया है, और इसलिए, रिसेप्टर के बाध्यकारी तंत्र को इसके लिगांड2से समझना महत्वपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, एचईसी कोशिकाओं में अतिव्यक्त किए गए एमआरजीपीआरएक्स 2 रिसेप्टर्स के खिलाफ छोटे पेप्टाइड अणुओं की एक लाइब्रेरी विकसित और जांच की गई। अध्ययन में, पेप्टाइड लाइब्रेरी का निर्माण एलेनिन स्कैनिंग और अमीनो एसिड ट्रंकेशन की सरल और बहुमुखी तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। एलनिन स्कैनिंग में एक एलेनिन अवशेषों के साथ विशिष्ट अमीनो एसिड की जगह शामिल है। एलनिन छोटा और तटस्थ होने के नाते, प्रतिस्थापित अवशेषों द्वारा प्रदत्त विशिष्ट गुणों के पेप्टाइड को स्ट्रिप्स करता है और लगातार रिसेप्टर इंटरैक्शन में अमीनो एसिड के संबंधित फिजियोकेमिकल गुणों के महत्व पर प्रकाश डालता है। इसके विपरीत, अमीनो एसिड ट्रंकेशन में, पेप्टाइड दृश्यों को इस तरह डिज़ाइन किया गया है कि एन-टर्मिनल, सी टर्मिनल या दोनों से एक या अधिक अमीनो एसिड अवशेषों का अभाव है। पेप्टाइड्स के इस सेट का उपयोग एमआरजीपीआरएक्स 2 बाध्यकारी के लिए महत्वपूर्ण अमीनो एसिड दृश्यों की पहचान करने के लिए किया गया था।
मानव मस्तूल कोशिकाओं लाइनों (बालक-2) के साथ अनुभव से पता चला है कि इन कोशिकाओं को संस्कृति और विट्रो मेंबनाए रखने के लिए मुश्किल है: दो सप्ताह के एक दोहरीकरण समय, महंगी मध्यम की खुराक, और सीधे ध्यान 3 passagingके दौरानआवश्यक है । ये गुण कोशिकाओं को संभावित लिगामेंट्स की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुपयुक्त बनाते हैं। इसके साथ ही, एमआरजीपीआरएक्स2 रिसेप्टर (एचईके-एक्स2) को व्यक्त करने वाली हेक कोशिकाओं का उपयोग पेप्टाइड लाइब्रेरी1को स्क्रीन करने के लिए किया गया था। HEK-293 कोशिकाओं का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और उनके उच्च ट्रांसफैक्शन दक्षता, तेजी से दोहरीकरण दर, और प्रयोगशाला 4 में सुसंस्कृत होने के लिए गैर-महंगे मध्यम पूरक की आवश्यकता के कारण सतह रिसेप्टर्स की विषम अभिव्यक्ति के लिए अध्ययन कियाजाताहै। HEK-293 सेल लाइन को स्थानांतरित करने के प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया है और यह अच्छी तरह सेस्थापित है 5। एचईके-293 कोशिकाओं ने एमजेपीपीआरएक्स2 रिसेप्टर (मार्ग 13-19) को एन-ट्रंकेशन, सी-ट्रंकेशन, एन + सी-ट्रंकेशन और एलनिन स्कैनिंग1के माध्यम से उत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ सक्रिय किया गया था। जंगली प्रकार HEK कोशिकाओं (HEK-WT) (मार्ग 16-21) नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । सक्रियण पर इंट्रासेलुलर कैल्शियम रिलीज एमआरजीपीआरएक्स 2 आधारित सक्रियण का अध्ययन करने के लिए निगरानी की गई थी।
एमआरजीपीआरएक्स2 द्वारा सेल एक्टिवेशन के बाद साइटोसोलिक कैल्शियम जुटाने का काम किया जाता है। मस्त कोशिकाओं में यह विनियमित इंट्रासेलुलर कैल्शियम रिलीज स्टोर संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (एसओसीई) द्वारा विनियमित किया जाता है, जो स्ट्रोमल इंटरैक्शन अणु 1 (STIM1) द्वारा समन्वित है; और इम्यून रिस्पांस कैस्केड6,7के लिए केंद्रीय है . इंट्रासेलुलर कैल्शियम एकाग्रता का पता लगाने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है, जिसमें पैच-क्लैंप और फ्लोरोसेंट रंग8शामिल हैं। उपलब्ध सभी तकनीकों में से, विभिन्न पता लगाने की तकनीकों के साथ संग्राम में फ्लोरोमेट्रिक कैल्शियम रंगों का व्यापक रूप से उपयोग किया जा रहा है9। दो प्रकार के फ्लोरोमेट्रिक रंग जो रुचियों को प्राप्त कर चुके हैं, नामत फ्लोरो-4 जैसे एकल तरंगदैर्ध्य रंग, और दोहरी तरंगदैर्ध्य अनुपात इंडो-1 और फुरा-2 जैसे मितेंद्र रंग। दोहरी तरंगदैर्ध्य अनुपात मित्रिक रंगों से एकल तरंगदैर्ध्य रंगों को लाने का लाभ यह है कि डाई लोडिंग, फोटो ब्लीचिंग और10,11पर ध्यान केंद्रित करने जैसी प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए अनुपातमेट्रिक रंग सही होते हैं।
फ्यूरा-2 एसीटॉक्सीमिथाइल एस्टर (फ्यूरा-2 एएम) एक कोशिका रिस रही है, हरी-फ्लोरोसेंट डाई जिसका उत्तेजन कैल्शियम-बाइंडिंग पर कम तरंगदैर्ध्य में बदल जाता है। प्रायोगिक तौर पर फुरका-2 340 और 380 एनएम पर उत्साहित है, जबकि उत्सर्जन 510 एनएम दर्ज किया गया है। कैल्शियम बाइंडिंग पर, 340 एनएम पर फ्लोरोसेंट तीव्रता बढ़ जाती है जबकि 380 एनएम की कमी हो जाती है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। डेटा को 340 एनएम (F340) पर उत्तेजन के बाद फ्लोरेसेंस तीव्रता के अनुपात के रूप में दर्शाया गया है, जो 380 एनएम (F380) यानी एफ 340/F380 पर उत्तेजन के बाद तीव्रता के लिए है। F340/F380 अनुपात इंट्रासेलुलर कैल्शियम के आनुपातिक है, जिसके मूल्य की गणना Grynkiewicz समीकरण12द्वारा की जा सकती है । चूंकि फ्लोरेसेंस सिग्नल दो तरंगदैर्ध्य (340 एनएम और 380 एनएम) पर डाई के उत्तेजन से प्राप्त होता है, इसलिए फ्लोरेसेंस सिग्नल का अनुपात डाई लोडिंग, डाई रिसाव, फोटोब्लाचिंग और सेल घनत्व जैसे प्रायोगिक कारकों के लिए सही होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैल्शियम सिग्नलिंग मास्ट सेल डेग्रेशन के लिए केंद्रीय है और रिसेप्टर-लिगांड इंटरैक्शन, लिगांड पहचान और दवा खोज14के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। MRGPRX2 हाल ही में खोजे गए मस्तूल सेल ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसआर और एलडीयू इस परियोजना के लिए अलबर्टा इनोवेट्स स्ट्रैटेजिक रिसर्च प्रोजेक्ट, एनआरसी और एनएसईआरसी-डिस्कवरी ग्रांट को स्वीकार करना चाहेंगे ।
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
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