Summary
在这里，我们详细介绍了骨髓外植体方法，从样品制备到显微载玻片分析，以评估在其生理环境中分化的巨核细胞形成丙酸盐的能力。
Abstract
巨核生成术的最后阶段导致成熟巨核细胞的细胞质延伸，即所谓的丙酸盐。关于使用 体外分化的巨核细胞形成丙酸盐的很多知识;然而，越来越多的证据表明，传统的培养系统并不能忠实地概括骨髓内部发生的分化/成熟过程。在这份手稿中，我们提出了一种最初由Thierry和Bessis于1956年描述的外植体方法，以可视化在其原生环境中成熟的巨核细胞，从而规避潜在的伪影和误解。通过冲洗小鼠的股骨收集新鲜的骨髓，切成0.5mm横截面，并置于含有生理缓冲液的37°C孵育室中。巨核细胞在外植体外围逐渐可见，并在与摄像机耦合的倒置显微镜下观察长达6小时。随着时间的推移，巨核细胞改变其形状，一些细胞具有球形，而另一些细胞则发展出厚的延伸或延伸许多具有广泛分支的薄丙酸盐。进行定性和定量调查。该方法具有简单，可重复和快速的优点，因为存在许多巨核细胞，并且通常其中一半在6小时内形成丙酸盐，而培养的小鼠巨核细胞为4天。除了对突变小鼠的研究外，该方法的一个有趣的应用是直接评估丙酸盐延伸过程中的药理学药物，而不会干扰培养物中可能发生的分化过程。
Introduction
骨髓外植体技术最初由Thiéry和Bessis于1956年开发，用于将大鼠巨核细胞细胞质延伸的形成描述为血小板形成的初始事件1。使用相差和电影摄影技术，这些作者表征了成熟的圆形巨核细胞转化为"鱿鱼状"血小板细胞，其细胞质延伸显示出伸长和收缩的动态运动。这些手臂逐渐变薄，直到它们变成丝状，沿着手臂和尖端有小肿胀。这些典型的巨核细胞伸长，在体外和液体介质中获得，与固定骨髓中观察到的血小板有一定的相似性，其中巨核细胞通过正弦壁突出长延伸进入血液循环2，3。1994年TPO的发现和克隆，允许在培养物中区分巨核细胞，能够形成类似于骨髓外植体4，5，6中描述的丙酸盐延伸。然而，巨核细胞成熟在培养条件下的效率要低得多，特别是骨髓成熟的巨核细胞的广泛内部膜网络在培养的巨核细胞中发育不足，阻碍了对血小板生物发生机制的研究7，8。
我们在这里详细介绍了基于Thierry和Bessis的骨髓外植体模型，以实时跟踪小鼠巨核细胞的丙酸盐形成，这些巨核细胞在其原生环境中已经完全成熟，从而避免了可能的 体外 伪影和误解。在野生型成年小鼠中获得的结果被提出来说明巨核细胞扩展丙酸盐的能力，它们的形态和丙酸盐的复杂性。我们还引入了一种快速量化策略进行质量验证，以确保巨核细胞记录过程中的数据准确性和稳健性。这里介绍的协议是该方法的最新版本，作为书籍章节9发布。
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Protocol
所有动物实验均按照欧洲标准2010/63 / EU和斯特拉斯堡大学动物实验伦理委员会（斯特拉斯堡动物实验管理局）进行。
1. 试剂的制备
- 按 表1所述制备试剂。
- 对于库存I，分别溶解每种粉末。确保制剂的渗透压高于295 mOsm/L。该溶液可以在4°C下储存一年。
- 对于Tyrode的缓冲液制备，按照 表1所述制作溶液，用蒸馏水调节体积至100mL，并加入0.1g无水D（+）蔗糖。根据需要使用1 N HCl调节至pH 7.3，渗透压至295 mOsm / L。为防止细菌生长，在 10 U/mL 终浓度下加入青霉素 G，在终浓度下加入硫酸链霉素，终浓度为 0.29 mg/mL。通过0.22μm孔过滤最终溶液。
2. 实验装置的准备
- 在实验当天，将Tyrode的缓冲液加热到37°C，然后打开显微镜的加热室，将温度提高到37°C。
- 准备所有必要的工具，例如计时器，孵育室，5 mL注射器，21 G，镊子，剃须刀片，巴斯德移液器，载玻片和15 mL离心管（图1A）。
3. 分离小鼠骨髓
- 通过CO 2窒息和宫颈脱位对8-12周龄的C57BL /6 小鼠实施安乐死。这应该由一个称职和合格的人迅速完成。
- 为了避免微生物污染，在除去股骨之前，将小鼠体浸泡在70%（v / v）乙醇中。使用用70%乙醇消毒的器械进行解剖。收集两个股骨，并通过去除任何粘附组织来清洁它们。快速浸入乙醇后，将它们置于含有2 mL Tyrode缓冲液的15 mL离心管中。
- 使用锋利的剃须刀片切除骨骺，并使用充满2 mL Tyrdode缓冲液的5 mL注射器冲洗骨髓。为此，将21 G针引入股骨开口（膝盖侧），然后缓慢按压柱塞以取回完整的骨髓圆柱体（图1B，C）。保持骨髓收集过程尽可能简短（少于10分钟）。
4. 骨髓切片并放入孵育室
- 使用 3 mL 塑料移液器小心轻柔地将完整的骨髓转移到载玻片上。重要的是，样品要用缓冲液覆盖以防止变干（图1D）。
注意：避免流动回流，以尽量减少可能解离组织的剪切。 - 在立体显微镜（10x）下，切掉在冲洗时可能被压缩的骨髓末端。然后用锋利的剃须刀片切开横向切片。切片应足够薄，以便进行详细观察，但要确保巨核细胞不会因压缩而受损（通常厚度约为0.5毫米）（图1E，F）。
注：这些部分由锋利的剃须刀片制成，并在放大镜下将其厚度调整为约0.5毫米。仅选择厚度均匀的截面。这个过程并不复杂，但其标准化需要一些经验。 - 使用塑料移液器，将10个切片收集到含有Tyrode缓冲液的1 mL管中（图1G）。
- 小心地将切片转移到直径为13mm的孵育室（图1H）。
- 吸出缓冲液并将体积调节至30μL补充5%小鼠血清的Tyrode缓冲液。
注意：在这个阶段，可以添加药理学药物来评估它们对丙酸盐形成的影响。 - 将截面放置在远处。用尺寸为 22 x 55 mm 的盖玻片密封自粘室。在粘贴时倾斜盖玻片以避免形成气泡（图1I）。
- 将腔室置于37°C的加热室中。 从这一刻起，天文台表启动（T = 0小时）。实验在37°C（T = 6小时）下运行6小时。
5. 骨髓外植体的实时观察
- 使用倒置相差显微镜（40倍镜头用于放大倍率）与摄像机耦合以观察骨髓外植体。让细胞在开始观察之前孵育30分钟。在观察时，有必要调整焦点，因为巨核细胞正在移动。
注意：其他观察模式是可能的（例如，DIC，使用其巨核细胞表达内源性荧光标记物的小鼠的荧光），但相差显微镜是清晰地可视化长而薄的巨核细胞延伸的最佳选择，允许精确定量。30分钟后，骨髓细胞逐渐迁移到外植体的外围，形成单层。孵育1小时后，可以通过它们的大尺寸和多叶核来鉴定巨核细胞（图1J，K）。孵育3小时后，巨核细胞的数量增加，有些具有较长的延伸。 - 制作视频以记录巨核细胞的转化。
6. 延伸丙酸盐的巨核细胞的定量
- 绘制地图以定位孵育室中的每个部分（图1K）。
- 1小时后，识别每个部分外围可见的巨核细胞（即巨型多叶细胞），并在图纸上绘制它们的位置。3小时和6小时后重复此过程。
注：在图纸的基础上，每个巨核细胞可以很容易地随着时间的推移进行定位，并分析其形态的演变（例如，大小，变形，丙酸盐延伸等）。另一种可能性是使用特定的导航软件。
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Representative Results
定性结果。 在实验开始时，所有细胞都压实在骨髓部分。细胞在外植体的外围需要30分钟才能变得清晰可见。然后可以通过它们的大尺寸识别巨核细胞，然后可以随着时间的推移（大小，形状，动态，丙酸盐延伸和血小板释放）研究它们的进化（图2A）。小巨核细胞的直径在20至30μm之间，其细胞核是多叶的，而成熟的圆形巨核细胞较大（直径>30μm），具有扩大的细胞质。可以观察到一些深色巨核细胞（图2C）。这些代表其比例不应超过0.5%的死细胞。高于此值的比例表示样品制备问题。通过改变焦点可以很容易地可视化细胞核的形态。
定量结果.巨核细胞按照6.2中所述手动计数。并在培养箱密封后3小时和6小时根据其形态进行分类。图2A总结了四个基本的巨核细胞类别：（1）小MK，（2）大MK，（3）具有厚延伸的MK，（4）具有薄，细长和分支延伸的MK。这些后来是典型的丙酸盐形成巨核细胞，具有沿丙酸盐肿胀的突出特征和四肢存在屈光芽。在映射的帮助下（图1K），它们可以随着时间的推移而演变。结果表示为在每个观察时间每个类的百分比。传统上，对于野生型C57BL / 6小鼠骨髓，在外围可见的巨核细胞中有一半在6小时时延伸丙酸盐（图2B）。
可以通过捕获随时间推移的顺序图像来跟踪圆形MK的命运，以成像它们如何形成 proplatelet（视频1）。有趣的是，当在3小时内监测具有厚延伸的MK时，观察到厚的延伸可以从细胞体中分离并分支成丙酸盐或缩回以重整大圆形MK。
| 试剂 | H2O | ||||
| 股票 I* | 16 克 | 0.4克 | 2 克 | 0.116克 | |
| 氯化钠 | 氯化钾 | 纳赫科3 | NaH2PO4， | 至 100 mL | |
| （2.73 米） | （53.6 米） | （238毫米） | （8.6 毫米） | ||
| 库存二 | 2.033 克氯化镁2.6H2O （0.1 M） | ||||
| 库存三 | 2.19 克氯化钙2.6H2O （0.1 M） | 至 100 mL | |||
| HEPES库存** | 119克HEPES* （0.5M） | 至 1 L | |||
| 泰罗德的缓冲器*** | 5 mL 储备液 I | 1 mL 储备液 II | 2 mL 储备 III | 1 mL 高效肝素储备液 | 1.8 mL 白蛋白储备液 |
表1：Tyrode缓冲液的制备。 每个储备溶液在表格的第一列中指示。每行指示每种储备溶液所需的成分以及试剂（以克为单位）的量。每种试剂的目录号和公司在基本用品表中给出。
图1：骨髓外植体样品制备方法的摄影表示（A）骨髓制备所需的实验装置。（B）将21号注射器安装的针头插入骨骼中。（C）将骨髓冲洗到含有Tyrode缓冲液的管中。（D）然后将骨髓轻轻地沉积在载玻片上。（E）骨髓的四肢被切除（F）骨髓圆柱体被切成十个0.5毫米厚的部分。（G-H）将十个切片转移到孵育室，并使用倒置显微镜在37°C下观察。（I）含有十段骨髓的孵育室的代表照片。（J）外周细胞迁移形成巨核细胞可见的层。（K） 图例说明了孵育室中的十个外植体部分以及每个切片已从组织中迁移出来的巨核细胞（X蓝色标记）的位置。箭头显示了外围的巨核细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：外植体中巨核细胞随时间推移的形态学分类（A）巨核细胞被分类为"小"、"大"，具有"厚延伸"或"丙酸盐延伸"。Bars：50μm（B）在1小时，3小时和6小时测定每类巨核细胞的比例，总共1，468个巨核细胞，显示"小"和"球形"巨核细胞的比例随时间减少，而平行地，扩展丙酸盐的巨核细胞的比例增加（n = 6小鼠）。通常，在3小时后WT小鼠的外植体中，每节观察到8.3至11.5个巨核细胞。误差条对应于每个样本的均值的标准误差。（C） 深色巨核细胞的代表图像。酒吧：50μm（D）具有非肌肉肌球蛋白II-A标记有绿色荧光蛋白的巨核细胞的代表性图像。酒吧：50 μm请点击这里查看此图的放大版本。
视频1：延时视频显示MK延伸的螺旋桨。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
在这里，我们描述了一种简单且低成本的体外方法，以评估巨核细胞延长在骨髓中生长的丙酸盐的效率。小鼠骨髓外植体模型有四个主要优点。首先，不需要高级技术技能。其次，获得巨核细胞延伸丙酸盐所需的时间相当短，外植体方法仅为6小时，而从小鼠祖细胞开始的常规培养方法至少为4天。第三，鉴于只需要少量的组织并且获得的结果是可重复的，它将所需的小鼠数量减少到最低限度（通常每个实验条件6只小鼠），使这些实验在经济和道德上有效。最后，但重要的是，这种方法的优势在于使用在其自然环境中完全发育的巨核细胞，这可能在揭示可能被培养条件的潜在人工制品在体外掩盖的表型方面被证明是无价的。这在先前已记录在具有巨核细胞限制性MYH9失活的小鼠中，其中在体外（增加形成）10和体内（减少形成）分化巨核细胞11中发现了相反的结果。这些矛盾的结果可以通过要求肌球蛋白IIA在约束环境中进行正常的巨核细胞分化来解释，而肌球蛋白IIA对于液体培养物中的巨核细胞分化是可有可无的7。
骨髓外植体模型的一个有趣的应用是可以研究转基因小鼠和/或药理学药物中基因突变或缺陷仅对血小板延伸过程的影响，而不会像体外培养12那样干扰分化过程。理想的情况是使用一个股骨的骨髓作为治疗样本，使用其对应物作为对照。此外，使用允许巨核细胞自发荧光的转基因小鼠有助于血小板延伸过程的可视化。为了可视化荧光巨核细胞，一种可能性可能是在培养室中添加针对特定巨核细胞标记物的荧光标记抗体。另一种可能性可能是使用表达荧光蛋白的基因工程小鼠模型，特别是在巨核细胞谱系中，例如文献13中已经报道的具有CD41标记YFP的小鼠，或者在GFP与非肌肉肌球蛋白II-A14 的N末端相连的所有细胞中，如图 2D所示。
因此，这种外植体方法为更好地了解其自然环境中的血小板形成提供了定性和定量信息。值得注意的是，尽管这种方法简单快捷，但它仍然与使用经典液体培养物进行的研究相辅相成。每个人都根据希望研究的血小板的增殖，成熟，扩展和血小板释放的阶段带来单独的知识。例如，当外植体方法提供有关在生理环境中生长的巨核细胞扩展丙酸盐的能力的信息时，体外培养提供有关骨髓微环境重要性的信息，例如细胞依赖性7或细胞外基质依赖性15的影响。因此，体外巨核细胞培养物使得有可能在刚度和粘合蛋白7，16方面调节微环境的参数。请参阅本期J. Boscher等人的文章"在三维甲基纤维素基水凝胶中培养巨核细胞以改善细胞成熟并研究僵硬和限制的影响"，以获取更多信息。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢Jean-Yves Rinckel，Julie Boscher，Patricia Laeuffer，Monique Freund，Ketty Knez-Hippert的技术援助。这项工作得到了ANR（国家研究机构）Grant ANR-17-CE14-0001-01和ANR-18-CE14-0037的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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