Summary
Her beskriver vi benmargseksekale metoder, fra prøvepreparering til mikroskopisk lysbildeanalyse, for å evaluere evnen til megakaryocytter som har differensiert i deres fysiologiske miljø til å danne proplatelets.
Abstract
Den siste fasen av megakaryopoiesis fører til cytoplasmatiske utvidelser fra modne megakaryocytter, de såkalte proplatelets. Mye har blitt lært om proplateletformasjonen ved hjelp av in vitro-differensierte megakaryocytter; Det er imidlertid et økende bevis på at konvensjonelle kultursystemer ikke trofast rekapitulerer differensierings- / modningsprosessen som foregår inne i benmargen. I dette manuskriptet presenterer vi en explant-metode som opprinnelig ble beskrevet i 1956 av Thiéry og Bessis for å visualisere megakaryocytter som har modnet i sitt opprinnelige miljø, og dermed omgå potensielle gjenstander og feiltolkninger. Friske benmarger samles ved å skylle lårbenene til mus, skivet i 0,5 mm tverrsnitt, og plasseres i et inkubasjonskammer ved 37 °C som inneholder en fysiologisk buffer. Megakaryocytter blir gradvis synlige i den utplantede periferien og observeres opptil 6 timer under et invertert mikroskop koblet til et videokamera. Over tid endrer megakaryocytter sin form, med noen celler som har en sfærisk form og andre utvikler tykke utvidelser eller utvider mange tynne proplatelets med omfattende forgrening. Både kvalitative og kvantitative undersøkelser utføres. Denne metoden har fordelen av å være enkel, reproduserbar og rask som mange megakaryocytter er til stede, og klassisk halvparten av dem danner proplatelets på 6 timer sammenlignet med 4 dager for dyrkede mus megakaryocytter. I tillegg til studiet av mutante mus er en interessant anvendelse av denne metoden den enkle evalueringen av farmakologiske midler på proplateletforlengelsesprosessen, uten å forstyrre differensieringsprosessen som kan oppstå i kulturer.
Introduction
Benmargsutvisningsteknikken ble først utviklet av Thiéry og Bessis i 1956 for å beskrive dannelsen av rotte megakaryocytt cytoplasmatiske utvidelser som en innledende hendelse i blodplateformasjon1. Ved hjelp av fasekontrast og kinematografiske teknikker karakteriserte disse forfatterne transformasjonen av modne runde megakaryocytter til "blekksprutlignende" trombocytogene celler med cytoplasmatiske utvidelser som viser dynamiske bevegelser av forlengelse og sammentrekning. Disse armene blir gradvis tynnere til de blir filiform med små hevelser langs armene og på spissene. Disse typiske megakaryocyttforlengelsene, oppnådd in vitro og i flytende medier, har visse likheter med blodplater observert i fast benmarg, hvor megakaryocytter stikker lange forlengelser gjennom bihuleveggene inn i blodsirkulasjonen2,3. Oppdagelsen og kloningen av TPO i 1994, fikk lov til å skille megakaryocytter i kultur i stand til å danne proplatelet utvidelser som ligner de som er beskrevet i benmarg explants4,5,6. Imidlertid er megakaryocyttmodning langt mindre effektiv i kulturforhold, spesielt det omfattende indre membrannettverket av benmarg modnet megakaryocytter er underutviklet i dyrkede megakaryocytter, noe som hemmer studier på mekanismene for blodplatebiogenese7,8.
Vi detaljerer her benmargen explant modell, basert på Thiéry og Bessis, å følge i sanntid proplatelet dannelse av mus megakaryocytter, som har fullstendig modnet i sitt opprinnelige miljø, og dermed omgå mulige in vitro artefakter og feiltolkninger. Resultater oppnådd i villtype voksne mus presenteres for å illustrere megakaryocyttens evne til å utvide proplater, deres morfologi og kompleksiteten til proplatelets. Vi introduserer også en rask kvantifiseringsstrategi for kvalitetsvalidering for å sikre datanøyaktighet og robusthet under megakaryocyttopptaksprosessen. Protokollen som presenteres her, er den nyeste versjonen av metoden som ble publisert som et bokkapittel tidligere9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med europeiske standarder 2010/63/EU og CREMEAS-komiteen for etikk for dyreforsøk ved Universitetet i Strasbourg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Utarbeidelse av reagenser
- Forbered reagenser som beskrevet i tabell 1.
- For lager I, oppløs hvert pulver separat. Forsikre deg om at osmolariteten til preparatet er høyere enn 295 mOsm / L. Denne løsningen kan lagres ved 4 °C i ett år.
- For Tyrodes bufferpreparat, lag løsningen som beskrevet i tabell 1, juster volumet til 100 ml med destillert vann og tilsett 0,1 g vannfri D (+) sukrose. Juster til pH 7.3 ved hjelp av 1 N HCl etter behov og osmolariteten til 295 mOsm/L. For å forhindre bakterievekst, tilsett penicillin G ved 10 U/ml endelig konsentrasjon og streptomycinsulfat ved 0,29 mg/ml endelig konsentrasjon. Filtrer den endelige løsningen gjennom 0,22 μm porene.
2. Forberedelse av det eksperimentelle oppsettet
- På eksperimentets dag varmer du Tyrodes buffer ved 37 °C, og slår på mikroskopets varmekammer for å bringe temperaturen til 37 °C.
- Forbered alle nødvendige verktøy, for eksempel en timer, inkubasjonskamre, 5 ml sprøyter, 21 G, tang, barberblad, Pasteurpipetter, glasssklier og 15 ml sentrifugerør (figur 1A).
3. Isolering av musebenmargen
- Euthanize C57BL/6 mus i alderen 8-12 uker ved CO2-kvelning og livmorhalsdislokasjon. Dette bør gjøres raskt av en kompetent og kvalifisert person.
- For å unngå mikrobiell kontaminering, suge musekroppen i 70% (v / v) etanol før du fjerner lårbenene. Bruk instrumenter desinfisert i 70% etanol for disseksjonen. Samle de to lårbenene og rengjør dem ved å fjerne eventuelt tilhengervev. Etter rask nedsenking i etanol, plasser dem i 15 ml sentrifugerør som inneholder 2 ml Tyrodes buffer.
- Klipp bort epifysene med et skarpt barberblad og skyll benmargen med en 5 ml sprøyte fylt med 2 ml Tyrdodes buffer. For å oppnå dette, introduser en 21 G nål i åpningen av lårbenet (på knesiden) og trykk stempelet sakte for å hente en intakt margsylinder (Figur 1B,C). Hold margsamlingsøkten så kort som mulig (under 10 min).
4. Benmargsseksjon og plassering i inkubasjonskammeret
- Bruk en 3 ml plastpipette for å forsiktig og forsiktig overføre den intakte benmargen til en glasssklie. Det er viktig at prøvene dekkes med buffer for å unngå uttørking (Figur 1D).
MERK: Unngå strømningsgjennomstrømning for å minimere saks som kan fjerne vevet. - Under et stereomikroskop (10x) kutter du av endene av margen som kan ha blitt komprimert på tidspunktet for spylingen. Klipp deretter tverrgående seksjoner med et skarpt barberblad. Seksjoner bør være tynne nok til å tillate en detaljert observasjon, men sørg for at megakaryocytter ikke blir skadet av kompresjon (vanligvis tykkelse rundt 0,5 mm) (Figur 1E, F).
MERK: Seksjonene er laget med et skarpt barberblad og under en forstørrelsesglass for å justere tykkelsen til ca. 0,5 mm. Bare delene med jevn tykkelse er valgt. Denne prosedyren er ikke komplisert, men standardiseringen krever litt erfaring. - Bruk en plastpipette til å samle 10 seksjoner i 1 ml rør som inneholder Tyrodes buffer (figur 1G).
- Overfør forsiktig seksjonene til et inkubasjonskammer med en diameter på 13 mm (figur 1H).
- Aspirer bufferen og juster volumet til 30 μL av Tyrodes buffer supplert med 5 % museserum.
MERK: Det er på dette stadiet at farmakologiske midler kan tilsettes for å evaluere deres innvirkning på proplateletdannelse. - Plasser seksjonene på avstand. Forsegle det selvklebende kammeret med en dekslelip av dimensjonen 22 x 55 mm. Hell dekslene mens du stikker for å unngå dannelse av luftbobler (Figur 1I).
- Plasser kammeret i varmekammeret ved 37 °C. Fra dette øyeblikket startes kronometeret (T = 0 h). Eksperimentet går i 6 timer ved 37 °C (T = 6 timer).
5. Sanntidsobservasjon av margutløp
- Bruk et invertert fasekontrastmikroskop (40x linse for forstørrelse) koblet til et videokamera for å observere benmargen utviser. La cellene inkubere i 30 minutter før du starter observasjonen. Mens du observerer, er det nødvendig å justere fokuset fordi megakaryocytter beveger seg.
MERK: Andre observasjonsmoduser er mulige (f.eks. DIC, fluorescens ved hjelp av mus hvis megakaryocytter uttrykker en endogen fluorescerende markør), men fasekontrastmikroskopi er optimal for å tydelig visualisere de lange og tynne megakaryocyttforlengelsene, noe som muliggjør presis kvantifisering. Etter 30 min migrerer margcellene gradvis til periferien av explanten, og danner en monolayer. Etter 1 t inkubasjon kan megakaryocytter identifiseres av deres store størrelse og polylobuerte kjerner (Figur 1J, K). Etter 3 h inkubasjon øker antall megakaryocytter og noen har lange utvidelser. - Lag videoer for å spille inn transformasjonen av megakaryocyttene.
6. Kvantifisering av de proplatelet-forlengende megakaryocyttene
- Tegn et kart for å lokalisere hver del i inkubasjonskammeret (Figur 1K).
- Etter 1 time, identifiser de synlige megakaryocyttene (dvs. gigantiske polylobuerte celler) på hver seksjons periferi og plott deres posisjoner på tegningen. Gjenta denne prosedyren etter 3 og 6 timer.
MERK: På grunnlag av tegningen kan hver megakaryocytt lett plasseres over tid og utviklingen av morfologien analysert (f.eks. størrelse, deformasjon, proplateletforlengelse, etc.). En annen mulighet er bruk av en bestemt navigasjonsprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitative resultater. I begynnelsen av eksperimentet komprimeres alle celler i benmargsdelen. Det tar 30 min for cellene å bli tydelig synlige i periferien av explants. Megakaryocyttene er da gjenkjennelige av sin store størrelse, og deres evolusjon kan deretter studeres over tid (størrelse, form, dynamisk, proplateletforlengelse og blodplateutløsning) (Figur 2A). Små megakaryocytter har en diameter mellom 20 og 30 μm og deres kjerner er polylobulert mens modne runde megakaryocytter er større (> 30 μm i diameter) med forstørret cytoplasma. Noen få mørke megakaryocytter kan observeres (Figur 2C). Disse representerer døde celler hvis andel ikke skal overstige 0,5%. En andel som er høyere enn denne verdien, angir et problem med prøveforberedelsen. Morfologien til kjernen kan enkelt visualiseres ved å variere fokuset.
Kvantitative resultater. Megakaryocytter telles manuelt som beskrevet i 6.2. og klassifisert i henhold til deres morfologi ved 3 timer og 6 timer etter forsegling av inkubasjonskammeret. Figur 2A oppsummerer de fire essensielle megakaryocyttklassene: (1) små MKs, (2) store MKs, (3) MKs med tykke forlengelser, (4) MKs med tynne, langstrakte og ramifiserte utvidelser. Disse senere er de typiske proplateletdannende megakaryocyttene, med de fremtredende egenskapene til hevelser langs proplatene og tilstedeværelsen av brytningsknopper i ekstremiteter. Ved hjelp av kartlegging (Figur 1K) kan deres evolusjon følges over tid. Resultatene uttrykkes som en prosentandel av hver klasse på hvert observasjonstidspunkt. Klassisk utvider halvparten av megakaryocyttene som er synlige i periferien, proplatelets på 6 timer for wild-type C57BL/6 musebenmarg (Figur 2B).
Det er mulig å følge skjebnen til runde MK-er ved å ta sekvensielle bilder over tid for å se hvordan de danner proplatelets (Video 1). Interessant, da MKs med tykke utvidelser ble overvåket over en periode på 3 timer, ble det observert at de tykke utvidelsene enten kunne løsne fra cellekroppen og grenen til proplatelets eller trekke seg tilbake for å reformere store runde MKs.
| Reagenser | H2O | ||||
| Lager I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | til 100 ml | |
| (2,73 M) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Lager II | 2,033 g MgCl2,6H2O (0,1 M) | ||||
| Lager III | 2.19 g CaCl2.6H2O (0,1 M) | til 100 ml | |||
| HEPES-aksjer** | 119 g HEPES* (0,5 M) | til 1 L | |||
| Tyrodes buffer*** | 5 ml lager I | 1 ml lager II | 2 ml lager III | 1 ml HEPES-lager | 1,8 ml album i Stock |
Tabell 1: Klargjøring av Tyrodes buffer. Hver lagerløsning er angitt i den første kolonnen i tabellen. Sammensetningen samt mengden reagens (gitt i gram) som kreves for hver lagerløsning er angitt per rad. Katalognummeret og selskapet til hvert reagens er gitt i tabellen over essensielle forsyninger.
Figur 1: Fotografiske fremstillinger av prøveprepareringsmetoden for benmargen utvises. (A) Eksperimentelt oppsett som kreves for benmargspreparatet. (B) En 21-gauge sprøytemontert kanyle settes inn i beinet. (C) Benmargen skylles inn i et rør som inneholder Tyrodes buffer. (D) Benmargen blir deretter forsiktig avsatt på en glasssklie. (E) Ekstremitetene i benmargen er avskåret. (F) Margsylinderen er kuttet i ti 0,5 mm tykke seksjoner. (G-H) De ti seksjonene overføres til et inkubasjonskammer og observeres ved 37 °C ved hjelp av et invertert mikroskop. (I) Representativt bilde av et inkubasjonskammer som inneholder de ti delene av benmargen. (J) Perifere celler migrerer for å danne et lag der megakaryocyttene blir synlige. (K) Eksempel på tegning som illustrerer de ti utvisningsdelene i inkubasjonskammeret, samt plasseringen av megakaryocyttene (X blå merket) som har migrert ut av vevet for hver seksjon. Pilen viser en megakaryocytt i periferien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologisk klassifisering av megakaryocytter i utvisning over tid. (A) Megakaryocytter klassifiseres som "små", "store", med "tykk forlengelse" eller "proplatelet-extending". Barer: 50 μm (B) Andel megakaryocytter i hver klasse ble bestemt til 1 t, 3 t og 6 t i totalt 1468 megakaryocytter, noe som viser at andelen "små" og "sfæriske" megakaryocytter reduseres med tiden, mens andelen megakaryocytter som forlenger proplatelets øker (n = 6 mus). Vanligvis observeres mellom 8,3 og 11,5 megakaryocytter per seksjon i utvisningen av en WT-mus etter 3 timer. Feilfeltet tilsvarer standardfeilen for gjennomsnittet for hvert utvalg. (C) Representativt bilde av en mørk megakaryocytt. Bar: 50 μm (D) Representativt bilde av en megakaryocytt med ikke-muskuløs myosin II-A merket med et grønt fluorescerende protein. Bar: 50 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Intervallvideo som viser en MK som forlenger proplater. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en enkel og rimelig in vitro-metode for å evaluere effektiviteten til megakaryocytter for å utvide proplater som har vokst i benmargen. Benmargens utvisningsmodell for mus har fire hovedfordeler. For det første er det ingen avanserte tekniske ferdigheter som kreves. For det andre er tiden som trengs for å oppnå megakaryocyttforlengende proplatelets ganske kort, bare 6 timer for explant-metoden, sammenlignet med minst 4 dager for en konvensjonell kulturmetode som starter fra museforfedre. For det tredje, gitt at bare en liten mengde vev er nødvendig, og at de oppnådde resultatene er reproduserbare, reduserer det antall mus som trengs til et minimum (vanligvis 6 mus per eksperimentell tilstand), noe som gjør disse eksperimentene økonomisk og etisk effektive. Til slutt, men viktigst, ligger styrken til denne metoden i bruk av megakaryocytter som har utviklet seg fullt ut i sitt naturlige miljø, noe som kan vise seg uvurderlig i å avsløre fenotyper som kan maskeres in vitro av potensielle gjenstander av kulturforholdene. Dette har tidligere blitt dokumentert hos mus med megakaryocytt-begrenset MYH9-inaktivering der motstridende resultater er funnet på proplateletdannelse i in vitro (øktformasjon) 10 og in vivo (redusert formasjon) differensierte megakaryocytter11. Disse paradoksale resultatene har blitt forklart av kravet til myosin IIA for normal megakaryocyttdifferensiering i et begrensningsmiljø, mens myosin IIA er dispenserbar for megakaryocyttdifferensiering i flytende kultur7.
En interessant anvendelse av benmargsutløpsmodellen er muligheten til å studere effekten av genetiske mutasjoner eller mangler hos transgene mus og / eller farmakologiske midler utelukkende på blodplateforlengelsesprosessen, uten å forstyrre differensieringsprosessen som i tilfelle av in vitrokultur12. Den ideelle situasjonen er å bruke benmargen til en lårben som en behandlet prøve og dens motstykke som kontroll. I tillegg letter bruken av transgene mus som tillater spontan fluorescens i megakaryocyttene visualiseringen av blodplateforlengelsesprosessen. For å visualisere fluorescerende megakaryocytter, kan en mulighet være å legge til fluorescensmerkede antistoffer mot spesifikke megakaryocyttmarkører i kulturkammeret. En annen mulighet kan være bruk av genetisk konstruerte musemodeller som uttrykker et fluorescerende protein, enten spesielt i megakaryocytisk avledning som mus med CD41-merket YFP allerede rapportert i litteraturen13, eller i alle celler som mus der GFP er knyttet til N-terminus av ikke-muskuløs myosin II-A14 som illustrert i figur 2D.
Denne explant-metoden gir derfor både kvalitativ og kvantitativ informasjon for en bedre forståelse av blodplatedannelse i sitt naturlige miljø. Bemerkelsesverdig, selv om denne metoden er enkel og rask, forblir den komplementær til studiene som utføres ved hjelp av klassisk flytende kultur. Hver og en bringer separat kunnskap i henhold til stadier av spredning, modning, forlengelse av blodplater og blodplateutgivelse som man ønsker å studere. For eksempel, der explant -metoden gir informasjon om kapasiteten til forlengelse av proplatelets av megakaryocytter som har vokst i en fysiologisk kontekst, gir in vitrokultur informasjon om betydningen av benmargsmikromiljøet, for eksempel virkningen av celle ridigity7 eller ekstracellulær matriseavhengighet15. Dermed gjør in vitro megakaryocyte kulturer det mulig å modulere parametrene til mikromiljøet når det gjelder stivhet og limproteiner7,16. Vennligst se artikkelen "Megakaryocyte kultur i tredimensjonal metylcellulosebasert hydrogel for å forbedre cellemodning og studere virkningen av stivhet og innesperring" av J. Boscher et al., presentert i dette problemet for mer informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert for teknisk assistanse. Dette arbeidet har blitt støttet av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 og ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
