Summary
כאן, אנו מפרטים את שיטת הסבר מח העצם, מהכנת מדגם לניתוח שקופיות מיקרוסקופי, כדי להעריך את היכולת של מגהקריוציטים אשר הבדילו בסביבה הפיזיולוגית שלהם כדי ליצור מפיץ.
Abstract
השלב האחרון של megakaryopoiesis מוביל הרחבות ציטופלסמיות מ megakaryocytes בוגר, מה שנקרא proplatelets. הרבה נלמד על היווצרות proplatelet באמצעות מקרוציטיםבמבחנה- מובחנים; עם זאת, יש ראיות הולכות וגדלות לכך שמערכות תרבות קונבנציונליות אינן מסכמות בנאמנות את תהליך הבידול / ההתבגרות המתרחש בתוך מח העצם. בכתב יד זה, אנו מציגים שיטה מסבירה שתוארה בתחילה בשנת 1956 על ידי תיירי ובסיס לדמיין מגהקריוציטים שהבשילו בסביבתם הטבעית, ובכך לעקוף חפצים פוטנציאליים ופרשנויות שגויות. מח עצם טרי נאסף על ידי שטיפה של עצם הירך של עכברים, פרוסים 0.5 מ"מ חתך, ומניחים בתא דגירה ב 37 °C המכיל חיץ פיזיולוגי. מגה-קריוציטים נראים בהדרגה בפריפריה המהוללת ונצפתים עד 6 שעות תחת מיקרוסקופ הפוך בשילוב עם מצלמת וידאו. עם הזמן, megakaryocytes לשנות את צורתם, עם תאים מסוימים בעלי צורה כדורית ואחרים לפתח הרחבות עבות או הרחבת מדחפים דקים רבים עם הסתעפות נרחבת. מתבצעות חקירות איכותיות וכמותיות. שיטה זו יש את היתרון של להיות פשוט, לשחזור, ומהיר כמו megakaryocytes רבים נוכחים, ומחצית קלאסית מהם ליצור proplatelets ב 6 שעות לעומת 4 ימים עבור megakaryocytes עכבר מתורבת. בנוסף לחקר עכברים מוטנטיים, יישום מעניין של שיטה זו הוא הערכה פשוטה של הסוכנים הפרמקולוגיים על תהליך הרחבת ההתפשטות, מבלי להפריע לתהליך הבידול שעלול להתרחש בתרבויות.
Introduction
טכניקת הסבר מח העצם פותחה לראשונה על ידי תיירי ובסיס בשנת 1956 כדי לתאר את היווצרותם של תוספות ציטופלסמיות מקרוציטים של חולדה כאירוע ראשוני בהיווצרות טסיות דם1. באמצעות ניגודיות פאזה וטכניקות קולנועיות, מחברים אלה אפיינו את הפיכתם של מגה-קריוציטים עגולים בוגרים לתאי תרומבוציטוגניים "דמויי דיונון" עם הרחבות ציטופלסמיות המציגות תנועות דינמיות של התארכות והתכווצות. זרועות אלה הופכות בהדרגה דקות יותר עד שהן הופכות לפילפורם עם נפיחות קטנה לאורך הזרועות ובקצוות. אלה התארכות megakaryocyte טיפוסי, המתקבל במבחנה ובמדיה נוזלית, יש קווי דמיון מסוימים עם טסיות דם שנצפו במח עצם קבוע, שבו megakaryocytes לבלט הרחבות ארוכות דרך קירות הסינוסואיד לתוך זרימת הדם2,3. גילוי ושיבוט של TPO בשנת 1994, מותר להבדיל megakaryocytes בתרבות מסוגל ליצור הרחבות proplatelet הדומה לאלה המתוארים explants מח עצם4,5,6. עם זאת, התבגרות megakaryocyte הוא הרבה פחות יעיל בתנאי תרבות, במיוחד רשת הממברנה הפנימית הנרחבת של מקרוציטים מח עצם התבגרה מפותחת במגקריוציטים מתורבתים, מה שמעכב מחקרים על המנגנונים של ביוגנזה טסיות דם7,8.
אנו מפרטים כאן את מודל מוסף מח העצם, המבוסס על תיירי ובסיס, כדי לעקוב אחר היווצרות מפלגות בזמן אמת של מגהקריוציטים של עכברים, שהבשילו לחלוטין בסביבתם הטבעית, ובכך לעקוף חפצים במבחנה ופרשנויות שגויות. תוצאות המתקבלות בעכברים בוגרים מסוג בר מוצגות כדי להמחיש את היכולת של megakaryocyte להרחיב את הנפצים, המורפולוגיה שלהם ואת המורכבות של proplatelets. אנו מציגים גם אסטרטגיית כימות מהירה לאימות איכות כדי להבטיח דיוק ועמידות נתונים במהלך תהליך ההקלטה של megakaryocyte. הפרוטוקול המוצג כאן הוא הגרסה העדכנית ביותר של השיטה שפורסמה כפרק ספר בעבר9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. הכנת ריאגנטים
- הכן ריאגנטים כמתואר בטבלה 1.
- עבור המלאי I, להמיס כל אבקה בנפרד. ודא כי osmolarity של ההכנה גבוהה מ 295 mOsm / L. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) במשך שנה אחת.
- להכנת המאגר של טיירוד, הפוך את הפתרון כמתואר בטבלה 1, להתאים את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים ולהוסיף 0.1 גרם D נטול מים (+) סוכרוז. התאימו ל-pH 7.3 באמצעות 1 N HCl לפי הצורך ואת האוסמולריות ל-295 mOsm/L. כדי למנוע צמיחה חיידקית, להוסיף פניצילין G בריכוז הסופי 10 U /mL סטרפטומיצין סולפט בריכוז הסופי 0.29 מ"ג/מ"ל. סנן את הפתרון הסופי באמצעות נקבוביות 0.22 מיקרומטר.
2. הכנת מערך הניסויים
- ביום הניסוי, לחמם את המאגר של טיירוד ב 37 °C (50 °F), ולהדליק את תא החימום של המיקרוסקופ כדי להביא את הטמפרטורה ל 37 °C (50 °F).
- הכן את כל הכלים הדרושים, כגון טיימר, תאי דגירה, מזרקי 5 מ"ל, 21 G, מלקחיים, סכין גילוח, פיפטות פסטר, מגלשות זכוכית, וצינור צנטריפוגה 15 מ"ל(איור 1A).
3. בידוד מוח העצם של העכבר
- המת חסד C57BL /6 עכברים בגילאי 8-12 שבועות על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם. זה צריך להיעשות במהירות על ידי אדם מוסמך ומוסמך.
- כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי, להשרות את גוף העכבר 70% (v/v) אתנול לפני הסרת עצם הירך. השתמש במכשירים מחוטאים ב 70% אתנול עבור היצירה. לאסוף את שני עצם הירך ולנקות אותם על ידי הסרת כל רקמה דבק. לאחר טבילה מהירה באתנול, מניחים אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל חיץ טיירוד של 2 מ"ל.
- חותכים את האפיפיזות באמצעות סכין גילוח חדה ושוטפים את מח העצם באמצעות מזרק 5 מ"ל מלא במאגר של 2 מ"ל טיירדודה. כדי להשיג זאת, הכניסו מחט 21 G לתוך פתח עצם הירך (בצד הברך) ולחצו לאט על הבוכנה כדי לאחזר גליל מח שלם(איור 1B,C). שמור את מושב איסוף מח העצם קצר ככל האפשר (פחות מ -10 דקות).
4. חלוקת מח עצם ומיקום לתא הדגירה
- השתמש פיפטה פלסטיק 3 מ"ל להעביר בזהירות ובעדינות את מח העצם שלם על שקופית זכוכית. חשוב שהדגימות יכוסו במאגר כדי למנוע התייבשות(איור 1D).
הערה: יש להימנע מזרימת זרימה מחדש כדי למזער מזמרות שעלולות לנתק את הרקמה. - תחת סטריאומיקוסקופ (10x), חתוך את קצות מח העצם שאולי נדחס בזמן השטיפה. ואז לחתוך חלקים רוחביים עם סכין גילוח חד. חלקים צריכים להיות דקים מספיק כדי לאפשר תצפית מפורטת אך להבטיח כי megakaryocytes אינם נפגעים על ידי דחיסה (בדרך כלל עובי סביב 0.5 מ"מ) (איור 1E,F).
הערה: המקטעים מיוצרים עם סכין גילוח חד ומתחת להגדלה כדי להתאים את עובים לכ -0.5 מ"מ. רק מקטעי העובי האחיד נבחרים. הליך זה אינו מסובך אך התקינה שלו דורשת ניסיון מסוים. - באמצעות פיפטה מפלסטיק, אספו 10 חלקים לתוך צינור 1 מ"ל המכיל את המאגר שלטיירוד (איור 1G).
- העבירו בזהירות את המקטעים לתא דגירה בקוטר של 13 מ"מ (איור 1H).
- שאף את המאגר ולהתאים את עוצמת הקול ל 30 μL של המאגר של טיירוד בתוספת סרום עכבר 5 %.
הערה: בשלב זה ניתן להוסיף סוכנים פרמקולוגיים כדי להעריך את השפעתם על היווצרות פרופלטלט. - מקם את המקטעים במרחק. אטמו את תא ההדבקה העצמית עם כיסוי של הממד 22 x 55 מ"מ. הטה את כיסוי תוך כדי היצמדות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר(איור 1I).
- מניחים את התא בתא החימום ב 37 °C (50 °F). מרגע זה, הכרונומטר מופעל (T = 0 h). הניסוי פועל במשך 6 שעות ב 37 °C (T = 6 שעות).
5. התבוננות בזמן אמת של מח העצם
- השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה (עדשת פי 40 להגדלה) בשילוב למצלמת וידאו כדי לצפות בגורמי מח העצם. תן לתאים לדגור במשך 30 דקות לפני תחילת התצפית. בעת התבוננות, יש צורך להתאים את המוקד כי megakaryocytes נעים.
הערה: מצבי תצפית אחרים אפשריים (למשל, DIC, פלואורסצנטיות באמצעות עכברים שהמקריוציטים שלהם מבטאים סמן פלואורסצנטי אנדוגני), אך מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה היא אופטימלית כדי לדמיין בבירור את הרחבות המגקריוציטים הארוכות והדקות, ומאפשרות כימות מדויק. לאחר 30 דקות, תאי מח העצם נודדים בהדרגה לפריפריה של המהולל, ויוצרים מונונייטר. לאחר שעה של דגירה, ניתן לזהות מגה-קריוציטים לפי גודלם הגדול והגרעין רב-אלובולי(איור 1J,K). לאחר 3 שעות של דגירה, מספר megakaryocytes גדל וחלקם יש הרחבות ארוכות. - הפוך קטעי וידאו כדי להקליט את הטרנספורמציה של megakaryocytes.
6. כימות המגקריוציטים המרחיבים את ההתפשטות
- צייר מפה כדי להתאים כל מקטע לתא הדגירה(איור 1K).
- לאחר שעה, זהה את המגקריוציטים הנראים לעין (כלומר, תאים פולילוביבוליים ענקיים) בפריפריה של כל קטע ושרטט את מיקומם על הציור. חזור על הליך זה לאחר 3 ו 6 שעות.
הערה: על בסיס הציור, כל megakaryocyte יכול להיות ממוקם בקלות לאורך זמן ואת האבולוציה של המורפולוגיה שלהם נותח (למשל, גודל, עיוות, הרחבת proplatelet, וכו '). אפשרות נוספת היא שימוש בתוכנת ניווט ספציפית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות איכותיות. בתחילת הניסוי, כל התאים נדחסים בסעיף מח העצם. לוקח 30 דקות עד שהתאים נראים בבירור בפריפריה של המהללים. לאחר מכן ניתן לזהות את המגקריוציטים לפי גודלם הגדול, ולאחר מכן ניתן ללמוד את התפתחותם לאורך זמן (גודל, צורה, דינמיקה, הרחבת פרופלטציה ושחרור טסיות דם)(איור 2A). למגקריוציטים קטנים יש קוטר של בין 20 ל -30 מיקרומטר והגרעין שלהם הם polylobulated בעוד מקרוציטים עגולים בוגרים גדולים יותר (> 30 מיקרומטר קוטר) עם ציטופלסמה מוגדלת. ניתן לצפות בכמה מגה-קריוציטים כהים(איור 2C). אלה מייצגים תאים מתים שחלקם לא יעלה על 0.5%. שיעור גבוה מערך זה מצביע על בעיית הכנת מדגם. ניתן לדמיין בקלות את המורפולוגיה של הגרעין על ידי שינוי המוקד.
תוצאות כמותיות. Megakaryocytes נספרים באופן ידני כמתואר ב- 6.2. ומסווג על פי המורפולוגיה שלהם ב 3 שעות ו 6 שעות לאחר איטום תא הדגירה. איור 2א מסכם את ארבע הכיתות המהקריוציות החיוניות: (1) ח"כים קטנים, (2) ח"כים גדולים, (3) ח"כים עם הרחבות עבות, (4) ח"כים עם הרחבות דקות, מוארכות ומנומרות. אלה מאוחר יותר הם מקרוציטים יוצרי פרופלט, עם המאפיינים הבולטים של נפיחות לאורך הנפיחות ואת נוכחותם של ניצנים שבירה בגפיים שלהם. בעזרת מיפוי (איור 1K), ניתן לעקוב אחר התפתחותם לאורך זמן. התוצאות מתבטאות כאחוז מכל כיתה בכל זמן תצפית. באופן קלאסי, מחצית מהמגהקריוציטים הנראים בפריפריה מרחיבים את ההרחבה ב-6 שעות עבור מח עצם עכבר מסוג C57BL/6(איור 2B).
ניתן לעקוב אחר גורלם של חברי כנסת עגולים על ידי לכידת תמונות רצפיות לאורך זמן כדי לדמיין כיצד הם יוצרים פרופלטלטים(וידאו 1). מעניין לציין שכאשר חברי כנסת בעלי תוספות עבות היו תחת פיקוח על פני תקופה של 3 שעות, נצפתה כי ההרחבות העבות יכולות להתנתק מגוף התא ולהסתעף לתפוחים או לסגת לרפורמה של ח"כים עגולים גדולים.
| ריאגנטים | ח2O | ||||
| מלאי I* | 16 גרם | 0.4 גרם | 2 גרם | 0.116 גרם | |
| NaCl | KCL | נהקו3 | נה2PO4, | עד 100 מ"ל | |
| (2.73 מטר) | (53.6 מ"ר) | (238 מ"ר) | (8.6 מ"ר) | ||
| מלאי II | 2.033 גרם MgCl2.6H2O (0.1 מטר) | ||||
| מלאי III | 2.19 גרם CaCl2.6H2O (0.1 מטר) | עד 100 מ"ל | |||
| מניית HEPES** | 119 גר' HEPES* (0.5 מ') | ל- 1 ליטר | |||
| המאגר של טיירוד*** | 5 מ"ל מניות I | 1 מ"ל סטוק II | 2 מ"ל סטוק III | 1 מ"ל HEPES מניות | 1.8 מ"ל אלבומין סטוק |
טבלה 1: הכנת המאגר של הטיירוד. כל פתרון מלאי מצוין בעמודה הראשונה של הטבלה. הרכב, כמו גם את כמות ריאגנט (נתון בגרמים) הנדרש עבור כל פתרון מלאי מצוין לכל שורה. מספר הקטלוג והחברה של כל ריאגנט ניתנים בטבלת האספקה החיונית.
איור 1: ייצוגים צילומיים של שיטת הכנת הדגימה עבור מסלק מח העצם. (A)התקנה ניסיונית הנדרשת להכנת מח העצם. (B)מחט 21-מד רכוב מזרק מוכנס לתוך העצם. (C)מח העצם נשטף לתוך צינור המכיל את המאגר של טיירוד. מחהעצם מופקד בעדינות על מגלשת זכוכית. (ה) הגפיים של מח העצם נחתכות. (ו)גליל מח העצם נחתך לעשרה מקטעים בעובי 0.5 מ " מ. (G-H) עשרת החלקים מועברים לתא דגירה ונצפים ב 37 °C (37 °F) באמצעות מיקרוסקופ הפוך. (I)תמונה מייצגת של תא דגירה המכיל את עשרת החלקים של מח העצם. (J)תאים היקפיים נודדים כדי ליצור שכבה שבה המגקריוציטים הופכים גלויים. (K)דוגמה לציור הממחיש את עשרת המקטעים המהוללים בתא הדגירה, כמו גם את מיקומם של המגקריוציטים (סימן כחול X) שהיגרו מתוך הרקמה עבור כל מקטע. החץ מראה מגה-קריוציט בפריפריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סיווג מורפולוגי של מגהקריוציטים ב explants לאורך זמן. (A)Megakaryocytes מסווגים "קטן", "גדול", עם "הרחבה עבה" או "הרחבת פרופלטלט". ברים: 50 מיקרומטר (B)שיעור המקרוציטים בכל כיתה נקבע בשעה 1, 3 שעות ו 6 שעות בסך הכל 1,468 מגהקריוציטים, מראה כי שיעור המגקריוציטים "הקטנים" וה"כדוריים " פוחת עם הזמן, ובמקביל, שיעור המגקריוציטים המרחיבים את הפרופלטים עולה (n = 6 עכברים). בדרך כלל, ב explants של עכבר WT לאחר 3 שעות, בין 8.3 ו 11.5 מגהקריוציטים נצפים לכל סעיף. שורת השגיאה תואמת לשגיאה הסטנדרטית של הממוצע עבור כל דוגמה. (C)תמונה מייצגת של מגה-קרוציט כהה. בר: 50 מיקרומטר(D)תמונה מייצגת של מגהקריוצייט עם מיוסין II-A לא שרירי המסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק. בר: 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: סרטון בזמן מעידה המציג מרחיב ח"כים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטת במבחנה פשוטה ובעלות נמוכה כדי להעריך את היעילות של megakaryocytes כדי להרחיב את פרופלטלטים אשר גדלו במח העצם. לדגם מסלק מח העצם לעכבר יש ארבעה יתרונות עיקריים. ראשית, אין צורך בכישורים טכניים מתקדמים. שנית, הזמן הדרוש כדי להשיג מקרוציטים מאריכים מרחיב הוא קצר למדי, רק 6 שעות עבור שיטת explant, לעומת מינימום של 4 ימים עבור שיטת תרבות קונבנציונלית החל אבות עכבר. שלישית, בהתחשב בכך שיש צורך בכמות קטנה של רקמה בלבד וכי התוצאות המתקבלות ניתנות לשחזור, היא מפחיתה את מספר העכברים הדרושים למינימום (בדרך כלל 6 עכברים לכל מצב ניסיוני), מה שהופך את הניסויים האלה ליעילים מבחינה כלכלית ואתית. לבסוף, אבל חשוב מכך, כוחה של שיטה זו טמון בשימוש במגקריוציטים שהתפתחו במלואם בסביבתם הטבעית, אשר עשוי להוכיח לא יסולא בפז בחשיפת פנוטיפים שיכולים להיות מוסווים במבחנה על ידי ממצאים פוטנציאליים של תנאי התרבות. זה תועד בעבר בעכברים עם אי-שבוית MYH9 מוגבלת מקרוציטים שבה נמצאו תוצאות מנוגדות על היווצרות פרופלטלט במבחנה (היווצרות מוגברת)10 וב- vivo (היווצרות מופחתת) מקרוציטים מובחנים11. תוצאות פרדוקסליות אלה הוסברו על ידי הדרישה של myosin IIA עבור בידול megakaryocyte נורמלי בסביבת אילוץ, בעוד myosin IIA ניתן לוותר על בידול megakaryocyte בתרבות נוזלית7.
יישום מעניין של מודל explant מח העצם הוא האפשרות לחקור את ההשפעה של מוטציות גנטיות או ליקויים בעכברים מהונדסים ו /או סוכנים פרמקולוגיים אך ורק על תהליך הרחבת טסיות הדם, מבלי להפריע לתהליך הבידול כמו במקרה של תרבות הפריה חוץ גופית12. המצב האידיאלי הוא להשתמש במח העצם של עצם אחת כדגימה מטופלת ומקבילה כשליטה. בנוסף, השימוש בעכברים מהונדסים המאפשרים פלואורסצנטיות ספונטנית במגקריוציטים מקל על הדמיה של תהליך הרחבת טסיות הדם. כדי לדמיין מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים, אפשרות אחת יכולה להיות להוסיף נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים נגד סמני מגה-קיריוציטים ספציפיים בתא התרבות. אפשרות נוספת יכולה להיות שימוש במודלים של עכבר מהונדס גנטית המבטאים חלבון פלואורסצנטי, או במיוחד בשושלת המגקריוציטית כגון עכברים עם YFP עם תווית CD41 שכבר דווח בספרות13, או בכל התאים כגון עכברים שבהם GFP מקושר ל- N-terminus של מיוסין II-Aלא שרירי כפי שמודגם באיור 2D.
שיטה זו, אם כן, מספקת מידע איכותי וכמותי להבנה טובה יותר של היווצרות טסיות דם בסביבתם הטבעית. ראוי לציון, למרות ששיטה זו היא פשוטה ומהירה היא נשארת משלימה למחקרים המבוצעים באמצעות תרבות נוזלית קלאסית. כל אחד מביא ידע נפרד על פי שלבי ההתפשטות, ההתבגרות, הרחבת טסיות הדם ושחרור טסיות הדם שרוצים ללמוד. לדוגמה, כאשר השיטה explant נותן מידע על היכולת של הרחבה של proplatelets על ידי megakaryocytes שגדלו בהקשר פיזיולוגי, תרבות במבחנה מספקת מידע על החשיבות של microenvironment מח העצם כגון ההשפעה שללעג תאים 7 או תלות מטריצה חוץ תאית15. לכן, בתרביות מקרו-קריוציטים מאפשרות לווסת את הפרמטרים של המיקרו-סביבה במונחים של נוקשות וחלבוניםדבקים 7,16. אנא עיין במאמר "תרבות Megakaryocyte בהידרוג'ל תלת מימדי המבוסס על מתילצלולוז כדי לשפר את התבגרות התאים וללמוד את ההשפעה של נוקשות וכליאה" על ידי ג 'Boscher ואח ', שהוצג בגיליון זה לקבלת מידע נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לז'אן-איב רינקל, ג'ולי בושר, פטרישיה לאופר, מוניק פרוינד, קטי קנז-היפפרט על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ANR (אגנס נשיונל דה לה Recherche) גרנט ANR-17-CE14-0001-01 ו ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
