Summary
Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.
Abstract
La última etapa de la megacaropoyesis conduce a extensiones citoplasmáticas de megacariocitos maduros, los llamados proplatlets. Mucho se ha aprendido sobre la formación de proplatlet utilizando megacariocitosdiferenciados in vitro; sin embargo, existe una creciente evidencia de que los sistemas de cultivo convencionales no recapitulan fielmente el proceso de diferenciación/maduración que tiene lugar dentro de la médula ósea. En este manuscrito, presentamos un método de explante descrito inicialmente en 1956 por Thiéry y Bessis para visualizar megacariocitos que han madurado en su entorno nativo, evitando así posibles artefactos y malas interpretaciones. Las médulas óseas frescas se recogen enjuagando los fémures de los ratones, se cortan en secciones transversales de 0,5 mm y se colocan en una cámara de incubación a 37 ° C que contiene un tampón fisiológico. Los megacariocitos se hacen gradualmente visibles en la periferia del explante y se observan hasta 6 horas bajo un microscopio invertido acoplado a una cámara de video. Con el tiempo, los megacariocitos cambian su forma, con algunas células que tienen una forma esférica y otras que desarrollan extensiones gruesas o extienden muchos proplatelets delgados con ramificaciones extensas. Se llevan a cabo investigaciones cualitativas y cuantitativas. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido, ya que numerosos megacariocitos están presentes, y clásicamente la mitad de ellos forman proplalets en 6 horas en comparación con 4 días para los megacariocitos de ratón cultivados. Además del estudio de ratones mutantes, una aplicación interesante de este método es la evaluación directa de los agentes farmacológicos en el proceso de extensión del proplatelet, sin interferir con el proceso de diferenciación que puede ocurrir en los cultivos.
Introduction
La técnica de explante de médula ósea fue desarrollada por primera vez por Thiéry y Bessis en 1956 para describir la formación de extensiones citoplasmáticas de megacariocitos de rata como un evento inicial en la formación de plaquetas1. Utilizando contraste de fase y técnicas cinematográficas, estos autores caracterizaron la transformación de megacariocitos redondos maduros en células trombocitogénicas "parecidas a calamares" con extensiones citoplasmáticas que muestran movimientos dinámicos de elongación y contracción. Estos brazos se vuelven progresivamente más delgados hasta que se vuelven filiformes con pequeñas hinchazones a lo largo de los brazos y en las puntas. Estas elongaciones típicas de megacariocitos, obtenidas in vitro y en medios líquidos, tienen ciertas similitudes con las plaquetas observadas en la médula ósea fija, donde los megacariocitos sobresalen largas extensiones a través de las paredes sinusoides en la circulación sanguínea2,3. El descubrimiento y clonación de TPO en 1994, permitió diferenciar megacariocitos en cultivo capaces de formar extensiones proplatletas similares a las descritas en los explantes de médula ósea4,5,6. Sin embargo, la maduración de los megacariocitos es mucho menos eficiente en condiciones de cultivo, en particular la extensa red de membrana interna de los megacariocitos maduros de la médula ósea está subdesarrollada en los megacariocitos cultivados, lo que dificulta los estudios sobre los mecanismos de la biogénesis plaquetaria7,8.
Detallamos aquí el modelo de explante de médula ósea, basado en Thiéry y Bessis, para seguir en tiempo real la formación de proplatlet de megacariocitos de ratón, que han madurado completamente en su entorno nativo, eludiendo así posibles artefactos in vitro y malas interpretaciones. Los resultados obtenidos en ratones adultos de tipo salvaje se presentan para ilustrar la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatlets, su morfología y la complejidad de los proplatlets. También introducimos una estrategia de cuantificación rápida para la validación de la calidad para garantizar la precisión y robustez de los datos durante el proceso de registro de megacariocitos. El protocolo aquí presentado es la versión más reciente del método publicado como libro capítulo anteriormente9.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Preparación de reactivos
- Preparar reactivos como se describe en la Tabla 1.
- Para el Stock I, disuelva cada polvo por separado. Asegúrese de que la osmolaridad de la preparación sea superior a 295 mOsm/L. Esta solución se puede almacenar a 4 °C durante un año.
- Para la preparación del tampón de Tyrode, haga la solución como se describe en la Tabla 1,ajuste el volumen a 100 ml con agua destilada y agregue 0,1 g de sacarosa D (+) anhidra. Ajuste a pH 7.3 usando 1 N HCl según sea necesario y la osmolaridad a 295 mOsm/L. Para prevenir el crecimiento bacteriano, agregue penicilina G a 10 U/ml de concentración final y sulfato de estreptomicina a 0,29 mg/ml de concentración final. Filtrar la solución final a través de poros de 0,22 μm.
2. Preparación de la configuración experimental
- El día del experimento, caliente el tampón del Tyrode a 37 ° C y encienda la cámara de calentamiento del microscopio para llevar la temperatura a 37 ° C.
- Prepare todas las herramientas necesarias, como un temporizador, cámaras de incubación, jeringas de 5 ml, 21 G, fórceps, cuchilla de afeitar, pipetas Pasteur, portaobjetos de vidrio y tubo centrífugo de 15 ml(Figura 1A).
3. Aislamiento de la médula ósea del ratón
- Eutanasiar ratones C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad por asfixia por CO2 y luxación cervical. Esto debe ser hecho rápidamente por una persona competente y calificada.
- Para evitar la contaminación microbiana, remoje el cuerpo del ratón en etanol al 70% (v / v) antes de eliminar los fémures. Utilizar instrumentos desinfectados en etanol al 70% para la disección. Recoge los dos fémures y límpialos eliminando cualquier tejido adherente. Después de una rápida inmersión en etanol, colóquelos en un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón de Tyrode.
- Corte las epífisis con una cuchilla de afeitar afilada y enjuague la médula ósea con una jeringa de 5 ml llena de tampón de Tyrdode de 2 ml. Para lograr esto, introduzca una aguja de 21 G en la abertura del fémur (en el lado de la rodilla) y presione lentamente el émbolo para recuperar un cilindro de médula intacto(Figura 1B,C). Mantenga la sesión de recolección de médula lo más breve posible (menos de 10 min).
4. Seccionamiento de la médula ósea y colocación en la cámara de incubación
- Use una pipeta de plástico de 3 ml para transferir cuidadosa y suavemente la médula ósea intacta a un portaobjetos de vidrio. Es importante que las muestras estén cubiertas con tampón para evitar que se sequen (Figura 1D).
NOTA: Evite el flujo-reflujo para minimizar las cizallas que podrían disociar el tejido. - Debajo de un estereomitroscopio (10x), corte los extremos de la médula que pueden haber sido comprimidos en el momento del lavado. Luego corte las secciones transversales con una cuchilla de afeitar afilada. Las secciones deben ser lo suficientemente delgadas como para permitir una observación detallada, pero asegúrese de que los megacariocitos no se dañen por compresión (generalmente con un grosor de alrededor de 0,5 mm)(Figura 1E,F).
NOTA: Las secciones están hechas con una cuchilla de afeitar afilada y debajo de una lupa para ajustar su grosor a aproximadamente 0,5 mm. Solo se seleccionan las secciones de espesor uniforme. Este procedimiento no es complicado pero su estandarización requiere cierta experiencia. - Usando una pipeta de plástico, recolecte 10 secciones en un tubo de 1 ml que contenga el tampón de Tyrode(Figura 1G).
- Transfiera cuidadosamente las secciones a una cámara de incubación con un diámetro de 13 mm (Figura 1H).
- Aspire el tampón y ajuste el volumen a 30 μL del tampón de Tyrode complementado con suero de ratón al 5 %.
NOTA: Es en esta etapa que se pueden agregar agentes farmacológicos para evaluar su impacto en la formación de proplatlet. - Coloque las secciones a distancia. Selle la cámara autoadhesiva con una cubierta de la dimensión 22 x 55 mm. Incline el la cubierta mientras se pega para evitar la formación de burbujas de aire(Figura 1I).
- Coloque la cámara en la cámara de calentamiento a 37 °C. A partir de este momento, se inicia el cronómetro (T= 0 h). El experimento dura 6 h a 37 °C (T = 6 h).
5. Observación en tiempo real de explantes de médula ósea
- Use un microscopio de contraste de fase invertida (lente 40x para aumento) acoplado a una cámara de video para observar los explantes de médula ósea. Deje que las células se incuben durante 30 minutos antes de comenzar la observación. Mientras se observa, es necesario ajustar el enfoque porque los megacariocitos se están moviendo.
NOTA: Otros modos de observación son posibles (por ejemplo, DIC, fluorescencia utilizando ratones cuyos megacariocitos expresan un marcador fluorescente endógeno), pero la microscopía de contraste de fase es óptima para visualizar claramente las extensiones de megacariocitos largas y delgadas, lo que permite una cuantificación precisa. Después de 30 min, las células de la médula migran gradualmente a la periferia del explante, formando una monocapa. Después de 1 h de incubación, los megacariocitos pueden ser identificados por su gran tamaño y núcleos polilobulados (Figura 1J,K). Después de 3 h de incubación, el número de megacariocitos aumenta y algunos tienen largas extensiones. - Realiza vídeos para grabar la transformación de los megacariocitos.
6. Cuantificación de los megacariocitos extensibles de proplatelet
- Dibuje un mapa para localizar cada sección en la cámara de incubación (Figura 1K).
- Después de 1 h, identifique los megacariocitos visibles (es decir, células polilobuladas gigantes) en la periferia de cada sección y trace sus posiciones en el dibujo. Repita este procedimiento después de 3 y 6 h.
NOTA: Sobre la base del dibujo, cada megacariocitos puede ser fácilmente localizado a lo largo del tiempo y la evolución de su morfología analizada (por ejemplo, tamaño, deformación, extensión proplatelet, etc.). Otra posibilidad es el uso de un software de navegación específico.
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Representative Results
Resultados cualitativos. Al comienzo del experimento, todas las células se compactan en la sección de médula ósea. Las células tardan 30 minutos en hacerse claramente visibles en la periferia de los explantes. Los megacariocitos son entonces reconocibles por su gran tamaño y su evolución puede ser estudiada a lo largo del tiempo (tamaño, forma, dinámica, extensión proplatelet y liberación plaquetaria)(Figura 2A). Los megacariocitos pequeños tienen un diámetro entre 20 y 30 μm y sus núcleos están polilobulados, mientras que los megacariocitos redondos maduros son más grandes (> 30 μm de diámetro) con un citoplasma agrandado. Se pueden observar algunos megacariocitos oscuros(Figura 2C). Estos representan células muertas cuya proporción no debe exceder el 0,5%. Una proporción superior a este valor indica un problema de preparación de la muestra. La morfología del núcleo se puede visualizar fácilmente variando el foco.
Resultados cuantitativos. Los megacariocitos se cuentan manualmente como se describe en 6.2. y clasificados según su morfología a las 3 h y 6 h después del sellado de la cámara de incubación. La Figura 2A resume las cuatro clases esenciales de megacariocitos: (1) MKs pequeños, (2) MKs grandes, (3) MKs con extensiones gruesas, (4) MKs con extensiones delgadas, alargadas y ramificadas. Estos más tarde son los típicos megacariocitos formadores de proplatlets, con las características prominentes de hinchazón a lo largo de los proplatlets y la presencia de brotes refractivos en sus extremidades. Con la ayuda del mapeo(Figura 1K),su evolución se puede seguir a lo largo del tiempo. Los resultados se expresan como un porcentaje de cada clase en cada momento de observación. Clásicamente, la mitad de los megacariocitos visibles en la periferia extienden los proplatlets a las 6 horas para la médula ósea de ratón C57BL/6 de tipo salvaje(Figura 2B).
Es posible seguir el destino de los MK redondos capturando imágenes secuenciales a lo largo del tiempo para obtener imágenes de cómo forman los proplatlets(Video 1). Curiosamente, cuando los DIPUTADOs con extensiones gruesas fueron monitoreados durante un período de 3 h, se observó que las extensiones gruesas podían desprenderse del cuerpo celular y ramificarse en proplatlets o retraerse para reformar grandes MK redondos.
| Reactivos | H2O | ||||
| Stock I* | 16 g | 0,4 g | 2 g | 0,116 g | |
| NaCl | KCL | NaHCO3 | NaH2PO4, | hasta 100 ml | |
| (2,73 m) | (53,6 mM) | (238 mM) | (8,6 mM) | ||
| Stock II | 2.033 g MgCl2.6H2O (0.1 M) | ||||
| Stock III | 2,19 g CaCl2,6H2O (0,1 M) | hasta 100 ml | |||
| Stock de HEPES** | 119 g HEPES* (0,5 M) | a 1 L | |||
| Búfer de Tyrode*** | 5 ml Stock I | 1 mL Stock II | 2 ml Stock III | 1 ml de stock HEPES | 1.8 mL de stock de albúmina |
Tabla 1: Preparación del tampón del Tyrode. Cada solución de stock se indica en la primera columna de la tabla. La composición, así como la cantidad de reactivo (dada en gramos) requerida para cada solución de stock se indica por fila. El número de catálogo y la compañía de cada reactivo se dan en la tabla de suministros esenciales.
Figura 1: Representaciones fotográficas del método de preparación de muestras para el explante de médula ósea. (A) Configuración experimental requerida para la preparación de médula ósea. (B) Se inserta una aguja montada en una jeringa de calibre 21 en el hueso. (C) La médula ósea se enjuaga en un tubo que contiene el tampón de Tyrode. (D) La médula ósea se deposita suavemente en un portaobjetos de vidrio. (E) Se cortan las extremidades de la médula ósea. (F) El cilindro de la médula se corta en diez secciones de 0,5 mm de espesor. (G-H) Las diez secciones se transfieren a una cámara de incubación y se observan a 37 °C utilizando un microscopio invertido. (I) Foto representativa de una cámara de incubación que contiene las diez secciones de médula ósea. (J) Las células periféricas migran para formar una capa en la que los megacariocitos se hacen visibles. (K) Ejemplo de dibujo que ilustra las diez secciones de explante en la cámara de incubación, así como la ubicación de los megacariocitos (marca azul X) que han migrado fuera del tejido para cada sección. La flecha muestra un megacariocito en la periferia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Clasificación morfológica de los megacariocitos en explantes a lo largo del tiempo. (A) Los megacariocitos se clasifican como "pequeños", "grandes", con "extensión gruesa" o "proplatelet-extensión". Barras: 50 μm (B) La proporción de megacariocitos en cada clase se determinó a 1 h, 3 h y 6 h para un total de 1.468 megacariocitos, lo que demuestra que la proporción de megacariocitos "pequeños" y "esféricos" disminuye con el tiempo mientras que, en paralelo, aumenta la proporción de megacariocitos que extienden proplalets (n = 6 ratones). Típicamente, en los explantes de un ratón WT después de 3 h, se observan entre 8,3 y 11,5 megacariocitos por sección. La barra de error corresponde al error estándar de la media para cada muestra. (C) Imagen representativa de un megacariocitos oscuros. Bar: 50 μm (D) Imagen representativa de un megacariocitos con miosina II-A no muscular etiquetada con una proteína fluorescente verde. Barra: 50 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Video de lapso de tiempo que muestra un MK extendiendo proplatelets. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Aquí describimos un método in vitro simple y de bajo costo para evaluar la eficiencia de los megacariocitos para extender los proplatlets que han crecido en la médula ósea. El modelo de explante de médula ósea para ratón tiene cuatro ventajas principales. En primer lugar, no se requieren habilidades técnicas avanzadas. En segundo lugar, el tiempo necesario para obtener proplatlets extensibles de megacariocitos es bastante corto, solo 6 horas para el método de explante, en comparación con un mínimo de 4 días para un método de cultivo convencional a partir de progenitores de ratón. En tercer lugar, dado que solo se necesita una pequeña cantidad de tejido y que los resultados obtenidos son reproducibles, reduce el número de ratones necesarios al mínimo (generalmente 6 ratones por condición experimental), lo que hace que estos experimentos sean económica y éticamente eficientes. Por último, pero importante, la fuerza de este método radica en el uso de megacariocitos que se han desarrollado completamente en su entorno natural, lo que puede resultar invaluable para revelar fenotipos que podrían ser enmascarados in vitro por posibles artefactos de las condiciones de cultivo. Esto se ha documentado previamente en ratones con inactivación myH9 restringida en megacariocitos donde se han encontrado resultados opuestos en la formación de proplatlets in vitro (aumento de la formación)10 e in vivo (disminución de la formación) de megacariocitos diferenciados11. Estos resultados paradójicos se han explicado por el requerimiento de miosina IIA para la diferenciación normal de megacariocitos en un entorno de restricción, mientras que la miosina IIA es prescindible para la diferenciación de megacariocitos en cultivo líquido7.
Una aplicación interesante del modelo de explante de médula ósea es la posibilidad de estudiar el impacto de mutaciones genéticas o deficiencias en ratones transgénicos y/o agentes farmacológicos exclusivamente sobre el proceso de extensión plaquetaria, sin interferir con el proceso de diferenciación como en el caso del cultivo in vitro12. La situación ideal es utilizar la médula ósea de un fémur como muestra tratada y su contraparte como control. Además, el uso de ratones transgénicos que permiten la fluorescencia espontánea en los megacariocitos facilita la visualización del proceso de extensión plaquetaria. Para visualizar los megacariocitos fluorescentes, una posibilidad podría ser agregar anticuerpos etiquetados con fluorescencia contra marcadores específicos de megacariocitos en la cámara de cultivo. Otra posibilidad podría ser el uso de modelos de ratón genéticamente modificados que expresen una proteína fluorescente, ya sea específicamente en el linaje megacariocítico como ratones con YFP marcada con CD41 ya reportados en la literatura13,o en todas las células como ratones donde GFP está vinculado al N-terminal de la miosina no muscular II-A14 como se ilustra en la Figura 2D.
Este método de explante, por lo tanto, proporciona información cualitativa y cuantitativa para una mejor comprensión de la formación de plaquetas en su entorno natural. Cabe destacar que, aunque este método es simple y rápido, sigue siendo complementario a los estudios realizados con cultivo líquido clásico. Cada uno aporta conocimientos separados según las etapas de proliferación, maduración, extensión de las plaquetas y liberación plaquetaria que se desee estudiar. Por ejemplo, donde el método de explante proporciona información sobre la capacidad de extensión de los proplalets por megacariocitos que han crecido en un contexto fisiológico, el cultivo in vitro proporciona información sobre la importancia del microambiente de la médula ósea como el impacto de la ridigidad celular7 o la dependencia de la matriz extracelular15. Así, los cultivos de megacariocitos in vitro permiten modular los parámetros del microambiente en términos de rigidez y proteínas adhesivas7,16. Consulte el artículo "Cultivo de megacariocitos en hidrogel tridimensional a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento" de J. Boscher et al., presentado en este número para obtener más información.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert por su asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 y ANR-18-CE14-0037.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 - 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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