Summary
Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) является эффективной стратегией эпигеномного профилирования хроматина. Этот протокол представляет собой усовершенствованную стратегию CUT&Tag для профилирования модификаций гистонов в растениях.
Abstract
Эпигеномная регуляция на хроматическом уровне, включая модификации ДНК и гистонов, поведение факторов транскрипции и некодирующие РНК с их рекрутированными белками, приводят к временному и пространственному контролю экспрессии генов. Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) представляет собой метод ферментного связывания, при котором специфический белок хроматина сначала распознается по его специфическому антителу, а затем антитело связывает белок слияния белка А-транспозазы (pA-Tn5), который расщепляет целевой хроматин in situ путем активации ионов магния. Здесь мы предоставляем наш ранее опубликованный протокол CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллортетраплоидных листьев хлопка с модификацией. Этот пошаговый протокол может быть использован для эпигеномных исследований растений. Кроме того, существенные модификации для выделения ядер растений снабжены критическими комментариями.
Introduction
Участки ДНК, связывающие транскрипционный фактор, и открытый хроматин, связанный со знаками модификации гистона, играют решающую функциональную роль в регулировании экспрессии генов и являются основными направлениями эпигенетических исследований1. Традиционно анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) в сочетании с глубоким секвенированием (ChIP-seq) были использованы для общегеномной идентификации специфических модификаций гистонов хроматина или мишеней ДНК с конкретными белками и широко распространены в области эпигенетики2. Технология расщепления под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) была первоначально разработана лабораторией Хеникова для захвата связанных с белком фрагментов ДНК по всему геному5. По сравнению с ChIP, CUT&Tagcan генерирует библиотеки ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном, используя небольшое количество клеток с упрощенной процедурой3. На сегодняшний день в клетках животных установлены методы анализа хроматиновых областей со специфическими модификациями гистонов с использованием CUT&Tag4,5. В частности, одноклеточный CUT&Tag (scCUT&Tag) также был успешно разработан для тканей и клеток человека6. Однако из-за сложности клеточной стенки и вторичных метаболитов CUT&Tag по-прежнему технически сложен для растительных тканей.
Ранее мы сообщали о протоколе CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллотетраплоидных листьев хлопка4. Чтобы продемонстрировать эффективность выделения ядер и захвата ДНК с помощью растительной ткани, процедура профилирования представлена здесь. Основные этапы включают выделение интактных ядер, инкубацию in situ с антителом для модификации хроматина, инкубацию транспозазы, интеграцию адаптеров и подготовку библиотеки ДНК. Поиск и устранение неисправностей сосредоточен на подготовке библиотеки CUT&Tag к выделению ядер растений и контроле качества.
В этом исследовании мы представляем усовершенствованную стратегию CUT&Tag для растений. Мы не только предоставляем пошаговый протокол профилирования H3K4me3 в листьях хлопка, но также предоставляем оптимизированную методологию выделения ядер растений, включая стратегию выбора концентрации моющего средства для правильного лизиса клеток и стратегию фильтрации ядер. Подробные шаги с критическими комментариями также включены в этот обновленный протокол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовьте транспозазы и стоковые растворы (День 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части олигонуклеотидные адаптеры комплексуют с транспозазой Tn5 для получения активной транспозазы.
- Разбавляйте грунтовки (грунтовка А, грунтовка В и грунтовка С) до концентрации 100 мкМ с использованием буфера отжига (10 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) (см. Таблицу 1 для информации о последовательности грунтовок и Таблицу 2 для рецептур рабочих растворов). Хранить при температуре -20 °C до использования.
- Наладите следующие две реакции в пробирках ПЦР: Реакция 1 (адаптер AB), 10 мкл праймера A 100 мкМ, 10 мкл праймера B 100 мкМ; Реакция 2 (адаптер переменного тока), 10 мкл 100 мкМ праймера А, 10 мкл 100 мкМ праймер С.
- Отожгите адаптеры в аппарате ПЦР с помощью следующей программы: нагревательная крышка (102 °C), 75 °C в течение 15 мин, 60 °C в течение 10 мин, 50 °C в течение 10 мин, 40 °C в течение 10 мин, 25 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры представляют собой частично двухцепочечные молекулы ДНК (концентрация = 50 пмоль/мкл). - Настройте следующую реакцию в центрифужной трубке объемом 1,5 мл: 10 мкл транспозазы pA-Tn5 (500 нг/мкл или 7,5 пмоль/мкл), 0,75 мкл адаптера AB (50 пмоль/мкл), 0,75 мкл адаптера переменного тока (50 пмоль/мкл), 7 мкл буфера связи. Пипетку 20x аккуратно перемешать и инкубировать при 30 °C на водяной бане в течение 1 ч. Конечная концентрация транспозазы = 4 пмоль/мкл. Хранить при -20 °С до начала использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Молярное соотношение адаптера AB: адаптера AC: транспозаза = 0,5:0,5:1. - Подготовьте стоковые растворы в соответствии с рецептами, приведенными в таблице 2 , и автоклав или отфильтруйте исходные растворы для стерилизации.
- Автоклавные и стерилизующие ножницы, фильтровальная бумага, сито из нержавеющей стали, ступка, пестики и т.д.
2. Выделение ядер (День 2)
- Предварительно охладите центрифугу до 4 °C. На каждый 1 г исходного материала (хлопковых листьев) готовят 25 мл буфера ядерной изоляции A (10 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), 20 мл буфера ядерной изоляции B (10 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), 50 мл буфера ядерной промывки (10 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%), 1 мл буфера антител (50 мМ Tris pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, 1 мг/мл BSA, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, 0,05% мас./v цифры). Дайте трубкам постоять на льду до использования.
- Измельченные свежие листья (~1 г) в жидком азоте до мелкодисперсного порошка и переложить в трубку объемом 50 мл, содержащую 25 мл охлажденного буфера ядерной изоляции А.
- Аккуратно перемешайте буферный раствор и инкубируйте трубку на льду в течение 5 мин с легким встряхиванием, чтобы равномерно рассеять материал.
- Центрифуга в течение 5 мин при 500 rcf при 4 °C с образованием ячейки гранулы.
- Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу 20 мл охлажденного буфера ядерной изоляции B, дополненного 0,5% Triton X-100. Осторожно переверните трубку, чтобы полностью повторно суспендировать гранулу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер ядерной изоляции B объемом 20 мл применим для исходного материала весом 1 г, и этот объем может быть соответствующим образом масштабирован.- Выполните пилотный анализ для проверки эффекта последовательной концентрации тритона X-100 (например, 2 мл буфера ядерной изоляции B, каждый с 0,1%, 0,25%, 0,5% и 1% Triton X-100 на 100 мг измельченных тканей). На соответствующую концентрацию Тритона Х-100 указывает скопление белых/серых ядер на дне и темно-зеленого супернатанта после лизиса и центрифугирования на низкой скорости (< 500 rcf в течение 4 мин).
- Отфильтруйте полученный лизат клеток комбинацией двух сит: 500-сетчатое сито сверху для удаления более крупных тканевых обломков и 1000-сетчатое сито снизу для сбора ядер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий размер ячеек для сит в зависимости от размера ядер растений. - Используйте стерильную фильтровальную бумагу на задней стороне сита, чтобы поглотить мелкий клеточный мусор в лизате.
- Перенесите оставшиеся ядра, содержащие лизат, на верхней стороне 1000-сетчатого сита в четыре свежие трубки центрифуги объемом 1,5 мл.
- Центрифуга в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C для сбора ядер.
- Удалите как можно больше супернатанта с помощью наконечника пипетки и промойте гранулу с помощью буфера ядерной промывки.
- Добавьте 800 мкл буфера ядерной промывки и осторожно переверните трубки, чтобы повторно суспендировать гранулу. Снова вращайте трубку в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C.
- Выполните в общей сложности 3 стирки.
- (Необязательно) Визуализируйте ядра под микроскопом для окрашивания DAPI.
- Перенос 100 мкл суспензии ядер в буфер ядерной промывки с шага 2.11. на новую трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 900 мкл буфера ядерной промывки и 2 мкл исходного раствора DAPI (1 мг/мл), чтобы получить окончательную рабочую концентрацию 2 мкг/мл для DAPI. Инкубировать тюбик в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
- После окрашивания центрифугируют в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C для сбора ядер.
- Удалите как можно больше супернатанта с помощью наконечника пипетки. Промыть 3 раза с 800 мкл буфера ядерной промывки.
- Удалите как можно больше супернатанта и повторно суспендируйте ядра 100 мкл буфера ядерной промывки.
- Визуализируйте ядра под флуоресцентным микроскопом с помощью канала DAPI.
- Объедините ядра из двух пробирок (~50 мкл ядер в объеме в каждой трубке объемом 1,5 мл). Центрифуга в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите как можно больше оставшегося буфера с помощью наконечника пипетки.
3. Инкубация антител
- Повторно суспендировать каждые 50 мкл ядер в пробирке объемом 1,5 мл с 1 мл буфера антител.
- Наладили следующие реакции в пробирках объемом 1,5 мл: две биологические реплики контрольных групп IgG со 150 мкл ядер (~ 1 мкг хроматина) и 2 мкл IgG (1 мг/мл) в каждой пробирке, две биологические реплики групп анализа H3K4me3 со 150 мкл ядер и 2 мкл антитела против H3K4me3 (1 мг/мл) в каждой трубке.
- Осторожно перемешайте раствор и оставьте трубки на горизонтальном шейкере для гибридизации на ночь при 4 °C и 12 об/мин.
- Предварительно охладите центрифугу до 4 °C. Приготовьте свежие 50 мл иммунопреципитационного (IP) промывочного буфера (10 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, ,0,05% мас./об.дигитонина) в центрифужной трубке объемом 50 мл. Дайте трубке посидеть на льду.
- Центрифугируйте трубки в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите буфер антител из каждой трубки.
- Добавьте 800 мкл IP-буфера для промывки в каждую трубку и аккуратно перемешайте. Оставьте трубки на горизонтальном шейкере на 5 мин при комнатной температуре и 12 об/мин.
- После промывки центрифугируйте трубки в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать какого-либо нарушения гранул ядра, оставьте ~50-80 мкл буфера с ядрами. - Повторите шаги 3.6.-3.7. еще два раза.
- После третьей промывки центрифугируют в течение 2 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите оставшийся буфер как можно больше.
4. Инкубация транспозазы
- Получают свежий 1 мл инкубационного буфера транспозазы (10 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, 0,05% мас./об.) путем смешивания 1 мл IP-буфера промывки с 30 мкл 5 М NaCl.
- Чтобы приготовить смесь транспозазы Tn5 для инкубации, добавляют 1 мкл транспозазы к каждому 150 мкл инкубационного буфера транспозазы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала подготовьте смесь раствора транспозазы в соответствии с количеством реакций, а затем добавьте аликвоту по 150 мкл в каждую пробирку. - Повторное суспендирование ядер 150 мкл раствора транспозазы.
- Оставьте пробирки на горизонтальном шейкере при 12 об/мин на 2-3 ч при комнатной температуре и перемешайте каждые 10-15 мин.
- После инкубации транспозазы центрифугируют пробирки в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите инкубационный буфер транспозазы в каждой пробирке.
- Промывайте трубки с помощью IP-буфера для промывки. Для этого добавьте 800 мкл IP-буфера для промывки в каждую трубку, аккуратно перемешайте и оставьте трубки на горизонтальном шейкере при 12 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки.
- Повторите шаги 4.6.-4.7. еще два раза.
- После третьей промывки центрифугируют в течение 2 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите оставшийся буфер как можно больше.
5. Тагментация
- Только что получить 2 мл буфера тегментации (10 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, 10 мМ MgCl2, 0,05% мас./об.дигитонина) путем смешивания 2 мл БУФЕРА ПРОМЫВКИ IP с 60 мкл 5 М NaCl и 20 мкл 1 М МгCl2.
- Повторное суспендирование ядер с 300 мкл буфера тегментации.
- Перемешать раствор и инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 ч для маркировки.
- Прекращают тагментацию 10 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация ~15 мМ) и 30 мкл 10% SDS (конечная концентрация 1%).
6. Извлечение ДНК и построение библиотеки NGS
- Добавьте 300 мкл буфера экстракции ДНК CTAB, как описано7. Инкубируйте трубки на водяной бане при температуре 65 °C в течение 30 мин. Инвертировать, чтобы перемешать каждые ~ 10 мин.
- Добавьте 600 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25:24:1) в каждую пробирку. Тщательно перемешать.
- Предварительно центрифугируйте гелевые трубки с фазовой блокировкой в течение 2 мин при 13 000 rcf при 4 °C. Перенесите вышеуказанный раствор в фазовые гелевые трубки.
- Центрифуга в течение 10 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
- Перенесите супернатант (~600 мкл) в новую трубку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 600 мкл хлороформа в каждую пробирку. Тщательно перемешать.
- Центрифуга в течение 10 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
- Переложите супернатант (~600 мкл) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 12 мкл 100% этанола и 2 мкл копреципитанта GlycoBlue. Тщательно перемешать и хранить при -20 °C в течение 1 ч.
- Центрифуга в течение 10 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
- Декант супернатанта. Промыть гранулу ДНК с использованием 75% (v/v) этанола и центрифуги в течение 5 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
- Декант супернатанта. Высушите гранулу ДНК на воздухе и повторно суспендируйте ДНК в 25 мкл ddH2O.
- Настройте реакцию ПЦР следующим образом. В общей сложности 50 мкл реакции добавьте 24 мкл ДНК, 11 мкл ddH2O, 10 мкл 5x TAE буфера, 2 мкл праймера P5 (10 мкМ), 2 мкл праймера P7 (10 мкМ) и 1 мкл фермента TruePrep Amplify. Программа ПЦР: 72 °C в течение 3 мин, 98 °C в течение 30 с; затем 14 циклов 98 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, затем 72 °C в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 72 °C в течение 3 минут для продления не могут быть пропущены. Чрезмерная амплификация библиотеки приведет к высокому уровню дубликатов ПЦР в NGS. Начните с 12-14 циклов ПЦР в реакции ПЦР для H3K4me3 при использовании ~1 мкг хроматина в каждой реакции. - Нагрузите 2 мкл препаратов ПЦР на 1,5% агарозный гель для электрофореза.
- Очистите продукты ПЦР с помощью коммерческих магнитных шариков для очистки ДНК.
- Количественно оцените библиотеку с помощью флуорометра и электрофореза агарозного геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная концентрация библиотеки должна быть >2 нМ с помощью qPCR для обеспечения хорошего качества. - Выполняйте секвенирование следующего поколения (NGS) и анализ данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан рабочий процесс CUT&Tag. На рисунке 2 показано окрашивание DAPI интактных ядер. Целью этапа «изоляции ядер» было получение интактных ядер в достаточном количестве для последующей реакции CUT&Tag. На рисунке 3 показан электрофорез агарозного геля продуктов ПЦР. Отрицательный контроль IgG требуется параллельно при настройке эксперимента. По сравнению с контрольной группой IgG, основная часть фрагментов ДНК, извлеченных с образцом антитела H3K4me3, варьировалась от ~ 280 до 500 пар оснований. На рисунке 4 показано результирующее секвенирование следующего поколения для антитела против H3K4me3 по сравнению с IgG-отрицательными контрольными группами.
Рисунок 1: Рабочий процесс CUT&Tag. Эта цифра изменена из Тао и др.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Окрашивание DAPI интактных ядер, выделенных из листьев хлопчатника. Шкала = 20 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Электрофорез агарозного геля 2 мкл продуктов ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный скриншот IGV для сигналов H3K4me3. (A) Репрезентативный обзор IGV сигналов CUT&Tag в большой области генома. ~1500 кб областей генома были выбраны случайным образом. (B) Репрезентативный скриншот IGV для генов с различными уровнями экспрессии показал высокое разрешение сигналов CUT&Tag. Были использованы нормализованные файлы bigWig, сгенерированные из bamCompare путем сравнения файла обработки bam (реакция CUT&Tag anti-H3K4me3) и контрольного файла bam (IgG). TPM, транскрипты на килобаза экзонной модели на миллион сопоставленных чтений. Эта цифра изменена по сравнению с Тао и др.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Последовательности праймеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Рецепты буферов и растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали CUT&Tag, технологию для генерации библиотек ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном с использованием небольшого количества клеток с упрощенной процедурой по сравнению с иммунопреципитацией хроматина (ChIP). Наш успех с профилированием H3K4me3 в листьях хлопка предполагает, что CUT&Tag, который был впервые разработан для клеток животных, также может быть использован для растительных клеток. Как буферная система Tris, обычно используемая для анализа ChIP8, так и буферная система HEPES, используемая для животных CUT&Tag, работают для CUT&Tag с использованием растительных ядер4,9. Изоляция интактных ядер растений является критическим шагом для успешного применения CUT&Tag в растениях. В ранее сообщенной методике выделения ядер4 раствор измельченных тканей фильтровали через два слоя мираткани перед лизисом клеток. Мы обнаружили, что эффективность получения адекватных ядер снижается при использовании относительно старых листьев (например, листьев 2-месячных хлопковых растений) и хлопковых волокон (например, волокна 20-DPA), потому что Miracloth сохраняет большую часть измельченных тканей. В этом видеопротоколе изоляция ядер растений была оптимизирована путем фильтрации лизата клеток через 500-ячеистое (размер пор 20 мкМ) сито из нержавеющей стали. Эта измененная операция значительно повысила эффективность удаления более крупных тканевых обломков и получения адекватных ядер для последующей реакции.
После ПЦР для построения библиотеки (шаг 6.13.) фрагменты ДНК могут быть очищены, а затем профилированы с помощью NGS. Однако, если контрольная группа IgG также изображает обогащение небольшими фрагментами, это указывает на сильный фон случайного разрезания ДНК транспозазой, которое может быть вызвано поврежденными ядрами или недостаточной промывкой для удаления несвязанных антител или транспозазы. В этом случае параллельные образцы для специфических антител не были рекомендованы для дальнейших NGS.
Недавно одноклеточная платформа CUT&Tag, адаптировавшая одноклеточную платформу ATAC-seq на основе капель 10x Genomics ATAC-seq, была разработана и применена в профилировании модификаций гистонов H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac и H3K36me3. В исследовании хроматина, посвященном хроматиновому фактору транскрипции OLIG2, компонент когезин-комплекса RAD21 в мозге мыши дал уникальное представление об эпигеномных ландшафтах в центральной нервной системе6. Таким образом, CUT&Tag может быть применен для изучения эпигеномных ландшафтов как для объемной модификации гистонов, так и для конкретных TF с низкими входными требованиями9, даже на уровне одной ячейки6. Эти приложения CUT&Tag указывают на то, что изучение эпигенетической регуляции растений в координации генных функциональных сетей во время динамики развития и экологических реакций может быть точным во временной и пространственной структуре.
CUT&Tag - это метод, который все еще находится в процессе разработки с проблемами, которые необходимо решить. Для факторов транскрипции, которые не выражены в изобилии или слабо, временно или косвенно связаны с хроматином10, необходимо сравнить различия между сшитыми и нативными ядрами в CUT&Tag. Стратегия CUT&Tag для профилирования с факторами транскрипции при низком изобилии по-прежнему технически сложна. Кроме того, из-за ограниченной доступности белкового эпитопа большинство антител ChIP, которые проверены для работы с условиями сшивания, могут плохо работать с нативными условиями в CUT&Tag; чувствительность и специфичность антител должны быть подтверждены. Кроме того, транспоза Tn5, используемая в CUT&Tag, имеет высокое сродство к областям открытого хроматина11, поэтому CUT&Tag может ввести смещение, которое также необходимо учитывать в будущих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы не имеют конфликта интересов с какой-либо компанией, торгующей одним из вышеупомянутых продуктов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) и Фондов фундаментальных исследований для центральных университетов, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Хайнаньского провинциального фонда естественных наук Китая (320LH002) и проекта JCIC-MCP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al.
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
