Summary
I den nåværende protokollen demonstrerer vi hvordan man visualiserer DNA dobbeltstrenget end reseksjon under S / G2-fasen av cellesyklusen ved hjelp av en immunfluorescence-basert metode.
Abstract
Studien av DNA-skaderesponsen (DDR) er et komplekst og essensielt felt, som bare har blitt viktigere på grunn av bruk av DDR-målrettede legemidler til kreftbehandling. Disse målene er poly(ADP-ribose) polymeraser (PARPer), som initierer ulike former for DNA-reparasjon. Hemming av disse enzymene ved hjelp av PARP-hemmere (PARPi) oppnår syntetisk dødelighet ved å gi en terapeutisk sårbarhet i homolog rekombinasjon (HR)-mangelfulle celler på grunn av mutasjoner i brystkreft type 1 (BRCA1), BRCA2, eller partner og lokalisering av BRCA2 (PALB2).
Celler behandlet med PARPi akkumulerer DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSBer). Disse pausene behandles av DNA-end reseksjonsmaskineri, noe som fører til dannelse av enkeltstrenget (ss) DNA og påfølgende DNA-reparasjon. I en BRCA1-mangelfull kontekst forårsaker gjenoppfriskning av DNA-reseksjon gjennom mutasjoner i DNA-reseksjonshemmere, som 53BP1 og DYNLL1, PARPi-resistens. Derfor er det viktig å kunne overvåke DNA-reseksjon i cellulo for en klarere forståelse av DNA-reparasjonsveiene og utviklingen av nye strategier for å overvinne PARPi-motstand. Immunfluorescens (IF)-baserte teknikker muliggjør overvåking av global DNA-reseksjon etter DNA-skade. Denne strategien krever genomisk DNA-merking med lang puls med 5-bromo-2′-deoksyuridin (BrdU). Etter DNA-skade og DNA-end reseksjon, blir det resulterende enkeltstrengede DNA spesielt oppdaget av et anti-BrdU-antistoff under innfødte forhold. Videre kan DNA-reseksjon også studeres ved hjelp av cellesyklusmarkører for å skille mellom ulike faser av cellesyklusen. Celler i S/G2-fasen tillater studiet av avsluttende reseksjon innen HR, mens G1-celler kan brukes til å studere ikke-homolog endeføyning (NHEJ). En detaljert protokoll for denne IF-metoden kombinert med cellesyklusdiskriminering er beskrevet i dette dokumentet.
Introduction
Modulering av DNA-reparasjonsfaktorer er en stadig utviklende metode for kreftbehandling, spesielt i DNA DSB-reparasjonsdefekterende tumormiljøer. Hemming av spesifikke reparasjonsfaktorer er en av de geniale strategiene som brukes til å sensibilisere kreftceller til DNA-skadelige midler. Tiår med forskning førte til identifisering av ulike mutasjoner av DNA-reparasjonsgener som biomarkører for terapeutiske strategivalg1. Derfor har DNA-reparasjonsfeltet blitt et knutepunkt for narkotikautvikling for å sikre et bredt spekter av behandlinger, og styrke det personlige medisinkonseptet.
DSB-er repareres av to hovedveier: NHEJ og HR2. NHEJ-banen er feilutsatt, og ligaerer raskt de to DNA-endene med lite eller ingen DNA-sluttbehandling og involverer proteinkinase (DNA-PKcs), Ku70/80-komplekset, 53BP1 og RIF1 proteiner3. Hr er derimot en trofast mekanisme initiert av BRCA14. Et viktig skritt i HR-reparasjon er DNA-end reseksjonsprosessen, som er nedbrytningen av de ødelagte endene som fører til enkeltstrenget (ss) DNA med 3'-OH ender. BRCA1 legger til rette for rekruttering av nedstrømsproteiner som danner resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, som er involvert i 5' til 3' DNA-reseksjon5.
Den første end-reseksjonen oppnås gjennom endonukleaseaktiviteten til MRE11, noe som muliggjør videre behandling av DNA2- og EXO1-nukleasene. De genererte ssDNA-overhengene er raskt belagt av Replication Protein A (RPA) for å beskytte dem mot videre behandling. Deretter engasjerer BRCA2, PALB2 og BRCA1 seg for å megle forskyvningen av RPA og monteringen av RAD51-kjernen som kreves for homologistyrt reparasjonsmekanisme. En fin balanse mellom bruk av NHEJ og HR er nødvendig for optimalt vedlikehold av genomisk integritet. Banevalget avhenger av cellesyklusfasen. HR brukes fortrinnsvis i S til G2-fasene der DNA-reseksjon er på høyeste nivå, og søsterkromotidene er tilgjengelige for å sikre riktig reparasjon.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) er et av de tidligste proteinene som rekrutteres til DSB. Det regulerer både reseksjonsaktivitet og montering av nedstrømseffektorer involvert i NHEJ5,6. PARP-1 er også nødvendig for DNA enkeltstrenget pausereparasjon under replikering7,8. På grunn av sin viktige rolle i DNA-reparasjon, brukes PARP-hemmere (PARPi) som kreftbehandlinger. I flere HR-mangelfulle kreftformer fører PARPi-behandling til en syntetisk dødelig respons på grunn av manglende evne til HR-mangelfulle celler for å reparere den akkumulerte skaden via en alternativ vei9,10. Det er for tiden fire FDA-godkjente PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib og Talazoparib (også kalt BMN 673), som brukes til ulike bryst- og eggstokkkreftbehandlinger11. PARPi-resistens er imidlertid vanlig, og en potensiell årsak oppstår gjennom reacquisition av HR-ferdigheter12. Tap eller hemming av PARP-1 i nærvær av bestråling dysregulaterer resectosome maskineri, noe som fører til akkumulering av lengre ssDNA-traktater13. Derfor er en grundig studie av DNA-reseksjon in vivo avgjørende for en klarere forståelse av DNA-reparasjonsveiene og den påfølgende utviklingen av nye strategier for å behandle kreft og for å overvinne PARPi-resistens.
Det har vært flere metoder for å oppdage DNA-reseksjonshendelser5. En slik metode er den klassiske IF-baserte teknikken som muliggjør indirekte farging og visualisering av det resekterte DNA etter stressindusert DSB ved hjelp av et anti-RPA-antistoff. Merking av genomisk DNA med 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) og detektering av bare ssDNA er en direkte måling av DNA-reseksjonshendelser. Den omgår overvåkingen av RPA, som er involvert i flere cellulære prosesser som DNA-replikering. I metoden beskrevet her, celler inkubert med BrdU for en enkelt celle syklus tillate BrdU å bli innlemmet i en tråd av replikering cellulære DNA. Etter reseksjon utføres IF-farging under forhold som tillater brdU-deteksjon bare i ssDNA-form, ved bruk av et anti-BrdU-antistoff. Dette antistoffet kan bare få tilgang til eksponerte BrdU-nukleotider og vil ikke oppdage de som er integrert i dobbeltstrenget DNA. Ved hjelp av fluorescensmikroskopi kan det resekterte DNA-et visualiseres i form av punktering brdU / ssDNA foci. Kjerneintensiteten til disse fociene kan brukes som en avlesning for å kvantifisere reseksjon etter DNA-skade. Dette dokumentet beskriver trinnvis prosessene for denne metoden, som kan brukes på de fleste pattedyrcellelinjer. Denne metoden bør være av bred nytte som en enkel måte å overvåke DNA end reseksjon i cellulo, som et konseptbevis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur, behandlinger og coverlip forberedelse
MERK: All cellebelegg, transfeksjoner og behandlinger, bortsett fra bestråling, bør foregå under en steril cellekultur hette.
- Dag 1
- I en 6-brønns plate, plasser en enkelt dekslelip i hver brønn for så mange forhold som nødvendig. Plate ~150,000 HeLa celler for transfeksjon eller narkotika behandling, etter ønske.
MERK: Hvis transfekting, anbefales det å gjøre en omvendt transfeksjon på tidspunktet for plating, eller det er mulig å gjøre en fremover transfection flere timer etter plating for å tillate overholdelse. En omvendt transfeksjon oppnås ved å legge til transfeksjonsblandingen i dekslene før cellene legges til; Dermed begynner transfeksjon før cellene begynner å følge. En fremovertransfeksjon er derimot tillegg av transfeksjonsblandingen etter overholdelse av overflaten vanligvis neste dag. Det er imidlertid mulig å gjøre dette på samme dag, forutsatt at det er gitt nok tid til at cellene kan følge. - For denne metoden, bruk 4 brønner: Brønn 1: siRNA-kontroll (kalt siCTRL); Vel 2: siRNA mot PARP-1 (siPARP-1); Brønn 3: ubehandlet; Brønn 4: Celler som skal behandles med 5 μM BMN673 1 time før bestråling.
MERK: I denne protokollen ble alle testene utført under bestrålede forhold (se pkt. 1.3). - Inkuber cellene ved 37 °C i en 5 % CO2-fuktet inkubator over natten, selv om transfeksjonsprotokollen tillater opptil 3 dagers inkubasjon. Inkubasjonstiden før BrdU-behandling vil avhenge av siRNA-transfeksjonseffektiviteten. Hvis det ikke er transfeksjon, er inkubasjon i 16 timer tilstrekkelig til å tillate overholdelse av dekslene og litt cellevekst.
MERK: Inkubatorforholdene kan endres i henhold til cellelinjen som brukes.
- I en 6-brønns plate, plasser en enkelt dekslelip i hver brønn for så mange forhold som nødvendig. Plate ~150,000 HeLa celler for transfeksjon eller narkotika behandling, etter ønske.
- Dag 2
- Tilsett BrdU ved en endelig konsentrasjon på 10 μM i de aktuelle kulturingsmediene, og inkuber i 16 timer (en cellesyklus).
MERK: BrdU-oppløsningen fremstilles i dimetylsulfoksid; lagerløsningen som brukes er 10 mM og lagres i aliquots ved -20 °C.
- Tilsett BrdU ved en endelig konsentrasjon på 10 μM i de aktuelle kulturingsmediene, og inkuber i 16 timer (en cellesyklus).
- Dag 3
- Bestråle platene med en total dose på 5 Gy røntgenbestråling (variere dosen av bestråling avhengig av bestrålingstypen, for eksempel små dyrebestrålere vs. benkeplatebestrålere). Se materialtabellen for merket og modellen til bestråleren som brukes.
- Returner platene til inkubatoren, og slipp cellene i 3 timer.
- I løpet av inkubasjonsperioden på 3 timer forbereder du de to bufferne, A og B, og 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Bufferne A og B og sukrose bør tilberedes friskt på fikseringsdagen ved hjelp av fersk sukroseløsning for å forhindre forurensning.- Klargjør buffer A (pre-extraction buffer), i henhold til rekkefølgen (30 ml) som er beskrevet i tabell 1.
MERK: 1M-sukrose bør tilberedes på bruksdagen for å forhindre forurensning. - Klargjør buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) i henhold til rekkefølgen som er beskrevet i tabell 1 (30 ml).
MERK: Buffer B må utarbeides i den siterte rekkefølgen for å forhindre utfelling av Tween-20 og natriumdeoksycholatoppløsning. - Forbered 4% PFA, 2 ml per tilstand (10 ml), under en kjemisk hette (tabell 1).
- Klargjør buffer A (pre-extraction buffer), i henhold til rekkefølgen (30 ml) som er beskrevet i tabell 1.
2. Pre-ekstraksjon og fiksering
MERK: All pre-ekstraksjon og fiksering utføres med dekslene som er igjen i vevskulturplaten på is eller ved 4 °C; dekslene løftes bare i det siste trinnet med montering (se diskusjon).
- Forhåndsuttrekking
- Aspirer mediet, vask cellene forsiktig to ganger med 1x PBS, og fjern PBS. Tilsett 2 ml pre-ekstraksjonsbuffer A og inkuber umiddelbart ved 4 °C i 10 minutter.
MERK: Det er viktig at inkubasjonstiden i buffer A ikke forlenges. Utvidet inkubasjon i pre-utvinning buffere vil resultere i et økt antall frittliggende celler fra dekslenelip. Alternativt, i stedet for inkubasjon ved 4°C, kan inkubasjon gjøres på is. - Fjern buffer A til aspirasjon.
MERK: Ikke vask dekslene etter at du har fjernet buffer A. Gå videre til neste trinn. - Tilsett 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B og inkuber umiddelbart ved 4 °C i 10 minutter. Aspirer buffer B forsiktig, og vask cellene forsiktig en gang med 1x PBS. Aspirer forsiktig 1x PBS.
- Aspirer mediet, vask cellene forsiktig to ganger med 1x PBS, og fjern PBS. Tilsett 2 ml pre-ekstraksjonsbuffer A og inkuber umiddelbart ved 4 °C i 10 minutter.
- Fiksering
- Fest cellene ved å legge til 2 ml 4% PFA under den kjemiske hetten.
MERK: PFA er giftig og må manipuleres under en kjemisk hette. - Inkuber cellene ved romtemperatur i 20 min. Vask dekslene to ganger med 1x PBS, og aspirer overskuddet.
- Dekk dekslene med 100% kald metanol, og inkuber dekslene ved -20 °C i 5 minutter. Vask to ganger med 1x PBS.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Dekslene kan lagres ved 4 °C i 1x PBS og platen innpakket i aluminiumsfolie om nødvendig. Cellene bør ikke beholdes mer enn 5 dager før du fortsetter IF-protokollen.
- Fest cellene ved å legge til 2 ml 4% PFA under den kjemiske hetten.
3. Permeabilisering
- Inkuber cellene med 2 ml 1x PBS som inneholder 0,5% Triton X-100 ved romtemperatur i 15 min. Vask dekslene tre ganger med 2 ml 1x PBS.
4. Immunstaining
- Blokkeringstrinn
- Forbered nok fersk blokkeringsbuffer (3 % BSA i 1x PBS) til å bruke 2 ml per deksleslip.
MERK: Forbered en ekstra 5 ml blokkeringsbuffer for å lage antistoffløsningene. - Tilsett 2 ml blokkeringsbuffer til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- Forbered nok fersk blokkeringsbuffer (3 % BSA i 1x PBS) til å bruke 2 ml per deksleslip.
- Primær antistoffinkubasjon
- Forbered den primære antistoffløsningen i fersk blokkeringsbuffer: BrdU RPN202 1:1000 og proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 1:500, 100 μL perlip dekker.
MERK: For å bevare antistoffet kan et mindre volum brukes, 75-100 μL for en 22 x 22 mm dekslelip, 50-75 μL for en 18 x 18 mm dekslelip. - På hver coverlip, tilsett 100 μL primær antistoffoppløsning. Dekk dekslene med en firkant av parafilm ved hjelp av pinsett, og plasser forsiktig parafilmen for ikke å lage bobler.
- Dekk platen i aluminiumsfolie, og inkuber det primære antistoffet over natten ved 4 °C i et fuktet kammer.
- Fjern parafilm firkantene, og vask dekslene tre ganger med 2 ml steril 1x PBS.
- Forbered den primære antistoffløsningen i fersk blokkeringsbuffer: BrdU RPN202 1:1000 og proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 1:500, 100 μL perlip dekker.
- Sekundær antistoffinkubasjon
- Forbered nok sekundær antistoffløsning i fersk blokkeringsbuffer: antimus 488 fluorescerende sekundær A11011 (for BrdU) fortynning 1:800 og antikanin 568 fluorescerende sekundær A11011 (for PCNA) fortynning 1:800.
MERK: Fargene som brukes kan endres for å passe til de eksperimentelle behovene. Det spesifikke merket som brukes finnes i materialtabellen. - Legg på hver coverlip 100 μL sekundær antistoffløsning, dekk dekslene med en firkant av parafilm ved hjelp av pinsett, og plasser forsiktig parafilmen uten bobler.
- Inkuber det sekundære antistoffet ved romtemperatur i 1 time med platen dekket av aluminiumsfolie.
- Vask dekslene tre ganger med 2 ml 1x PBS.
- Forbered nok sekundær antistoffløsning i fersk blokkeringsbuffer: antimus 488 fluorescerende sekundær A11011 (for BrdU) fortynning 1:800 og antikanin 568 fluorescerende sekundær A11011 (for PCNA) fortynning 1:800.
- Kjernefysisk farging
- Forbered et volum på 2 ml per deksler på 1x PBS som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ved en endelig konsentrasjon på 1 μg/ml (1:1000).
- Legg på hver dekslelip 2 ml av DAPI-løsningen. Inkuber dekslene ved romtemperatur i 10 minutter med platen dekket av aluminiumsfolie. Vask dekslene to ganger med 1x PBS.
- Dekk dekslene med 1x PBS, og bruk enten en nål eller fine pinsett for å løfte dekslene fra bunnen av brønnen. Tørk forsiktig av overflødig væske ved å trykke forsiktig på en kant på et papirhåndkle.
MERK: Pass på at du ikke slipper lysbildet eller lar den flate overflaten med de festende cellene berøre papiret. - Monter dekslene på lysbildene ved hjelp av 10-20 μL IF-spesifikke monteringsmedier.
5. Bildeanskaffelse og analyse
MERK: Bildeanskaffelse kan gjøres på flere typer fluorescerende mikroskoper. Et epifluorescensmikroskop med et 63x oljemål ble brukt; se materialtabellen for merkevaren og modellen. Z-stabler er ikke nødvendig, selv om de kan være til nytte avhengig av cellelinjen og nivået av mitokondriefarging.
- Bildeanalyse
- Opprett flere TIFF-filer for hvert bilde. slå sammen alle plan, men hold fargekanalene atskilt. Importer disse filene til Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) og analyser ved hjelp av Speckle Counting pipeline (Supplemental Video 1).
- Last opp bildene (tilleggsfigur S1A).
- Hvis du vil begynne å opprette prosjektet, laster du rørledningen for flekktelling inn i programmet og bildene som skal analyseres i det angitte området.
- Bruk Modulen NamesAndTypes til å tilordne et meningsfullt navn til hvert bilde som andre moduler vil referere til it-C01: Representing BrdU Channel med. C02: Representere PCNA-kanal; C03: Representerer DAPI-kanal.
MERK: Disse identifikatorene vil avhenge av mikroskopet; Det må være en identifikator i filnavnet for å skille mellom kanalene.
- Identifiser hvilken fil som skal brukes til å identifisere kjernene og navngi den (endre dette navnet etter behov) (se Tilleggsfigur S1B og tilleggsfigur S1C).
- Velg diameteren på objektet mellom 50 og 300 pikselenheter, som er det akseptable størrelsesområdet for kjerner, men endre verdien slik at den passer til kjernene i bildet.
MERK: Det kan være at 50 er for stor en verdi og forhindrer at mindre kjerner identifiseres; På samme måte kan 300 tillate at store grupperinger av kjerner telles som 1. - Kast gjenstander utenfor diameterområdet for å sikre at bare de som oppfyller kriteriene, telles.
- Forkast objekter som berører kantlinjer, for å fjerne celler som bare kan være delvis i feltet.
- Bruk terskelen slik at den passer til de bestemte bildene. Legg merke til følgende innstillinger som et eksempel. Endre terskelkorrigeringsfaktoren basert på hvor streng terskelstrategien vil være. Andre innstillinger inkluderer terskelstrategi: Global; terskelmetode: Otsu; to klasser eller tre klasseterskler: To klasser; terskelutjevningsskala: 1; terskelutjevningsfaktor: 1; nedre og øvre grenser på terskelen: 0,0 og 1,0; metode for å skille klumpete objekter: Form; og metode for å tegne skillelinjer mellom klumpede objekter: Forplant.
MERK: For hver parameter gir celleprofiler komplementære definisjoner og tilgjengelig mulighet for variabelinnstillingen.
- Velg diameteren på objektet mellom 50 og 300 pikselenheter, som er det akseptable størrelsesområdet for kjerner, men endre verdien slik at den passer til kjernene i bildet.
- Identifiser primærobjektet for å identifisere foci (tilleggsfigur S2A).
- Bruk følgende innstillinger: Velg inndatabildet: Maskedgreen; kalt primærobjektet som skal identifiseres: BrdUFoci; typisk diameter på objektet: 1-15; Kast gjenstanden utenfor diameterområdet: Ja; forkast objektet som berører kantlinjen på bildet : Nei; terskelstrategi: Adaptativ; terskelmetode: Otsu; to klasser eller tre klasseterskler: Tre klasser; terskelutjevningsskala: 1; terskelutjevningsfaktor: 3; og størrelse på utjevningsfilter: 4.
- Måleintensitet (supplerende figur S2B).
- Velg bildet som skal måles: OrigGreen.
- Klikk på Legg til et annet bilde. Velg bildet som skal måles: PCNA. Velg objekter som skal måles: Nuclei.
MERK: Dette vil bli brukt til å måle BrdU- og PCNA-intensiteten - de endelige dataene som vil bli grafert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen ble den bromodeksyuridinbaserte analysen (BrdU)-basert analyse brukt til kvantitativt å måle reseksjonsresponsen til HeLa-celler til bestrålingsindusert skade. De genererte ssDNA-sporene visualiseres som distinkte foci etter immunfluorescensfarging (figur 1A). Den identifiserte foci ble deretter kvantifisert og uttrykt som den totale integrerte intensiteten av BrdU-fargingen i kjernene (figur 1B, supplerende figur S1, supplerende figur S2 og supplerende figur S3). Det er mulig å måle foci-tallet eller gjennomsnittlig foci-intensitet, selv om dette kan være mindre pålitelig enn den totale kjernefysiske intensiteten, hovedsakelig delvis til den variable størrelsen på BrdU-foci.
For å skille mellom kortdistanse-reseksjonen som følge av NHEJ og den langtrekkende reseksjonen av HR, ble det utført samtidig farging ved hjelp av et anti-PCNA-antistoff for å identifisere celler som går gjennom S-fase (figur 1 og supplerende figur S4). PCNA utgjør DNA-klemmen som fungerer som en prosesjonsfaktor for DNA-polymerase og er avgjørende for replikering. PCNA er fremtredende i kjernen og når maksimalt uttrykk under S-fasen av cellesyklusen. Derfor, i tidlig S-fase, er PCNA-signalet lavt og har en granulær distribusjon. I sen S-fase er PCNA-fargingen derimot ganske sterk (figur 1A). Ved første analyse av PCNA-signalet (S-fase) må kjernene identifiseres og PCNA-intensiteten måles.
De resulterende verdiene plottes deretter inn som et scatter-plott for best å bestemme cut-off intensiteten for å diskriminere mellom PCNA-positive og PCNA-negative kjerner (Supplerende figur S4A). De PCNA-negative resultatene vil deretter bli fjernet fra datasettet for å tillate BrdU-intensitetsbasert analyse på grunn av det lave BrdU-signalet uavhengig av tilstanden (Tilleggsfigur S4B). Under disse eksperimentelle forholdene har den PCNA-negative kjernen en basal integrert intensitet av BrdU-fokus på 900 vilkårlige enheter (A.U.). Denne verdien når imidlertid 1800 e.Kr. i PCNA-positive kjerner (figur 1B). Dette representerer en 100% økning i mengden av det integrerte signalet til BrdU-foci. Økningen i BrdU-intensiteten kan deretter korreleres med en økning i DNA-reseksjon, noe som er mer uttalt og effektivt når celler går gjennom S- og G2-faser og bestråles.
I denne protokollen, for å demonstrere en økning i DNA-reseksjon etter bestråling (5 Gy), ble PARP-1-aktiviteten modulert enten gjennom tap av PARP-1 ved hjelp av en siRNA-knockdown-tilstand eller etter kraftig hemming av PARP-1 ved hjelp av Talazoparib (BMN673) (figur 2 og supplerende figur S5). Mengden resected DNA i hver tilstand ble deretter kvantifisert etter IF (figur 2B). I uforstyrret tilstand (siCTRL) er den integrerte intensiteten til BrdU foci per kjerne ca. 1500 e.Kr. i den PCNA-positive kjernen (figur 2A, B). Etter en effektiv nedslag av PARP-1 ved hjelp av en siRNA (figur 2C), ble det observert en betydelig økning i intensiteten til BrdU-foci til ca. 1900 e.Kr., noe som tilsvarer 26% økning i intensitet (p ˂ 0,0001). Tilsvarende, etter hemming av PARP-1 ved bruk av BMN673 (5 μM endelig konsentrasjon), økte intensiteten av foci fra ca. 1750 til 2500 e.Kr. tilsvarende 43% økning av foci-intensiteten (p ˂ 0,0001). Dermed dysregulerte tap av PARP-1 DNA-reseksjon som rapportert tidligere13.
Det er viktig å huske at BMN-673 både hemmer aktiviteten til PARP-1 og fanger den i DNA, og effekten av denne behandlingen er mye mer skadelig for cellen, noe som resulterer i større økning av BrdU-intensitet enn i siRNA-behandlede celler. Den lille forskjellen i ubehandlede og siCTRL-intensiteter viser hvordan enhver behandling, for eksempel siRNA-transfeksjon, kan påvirke responsen og utgangen av en analyse. Det kan ytterligere demonstrere viktigheten av å bruke de riktige kontrollene for hver betingelse.
Figur 1: BrdU fociformasjon er mer utsatt for å forekomme i PCNA-positive celler enn i replikering av celler. (A) Representative bilder av BrdU fociformasjon og PCNA-farging etter 5 Gy bestråling og 3 h utgivelse. En innzoomet firkant som viser merket BrdU-foci, er til stede i hjørnet av hvert BrdU-bilde. Skalastenger = 5 μm. (B) Kvantifisering av BrdU kjernefysisk intensitet i ubehandlede (uten BMN-673) HeLa-celler. Dataene viser gjennomsnittlig ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Forkortelser: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = spredning av celle kjernefysisk antigen; IR = bestråling; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; A.U. = vilkårlige enheter; s.e.m. = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Poly(ADP-ribose) polymerase-1 knockdown eller hemming resulterer i økt BrdU foci dannelse i replikering celler. (A) Representative bilder av BrdU foci formasjon og PCNA farging i ubehandlede HeLa celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL, og siPARP-1, etterfulgt av 5 Gy bestråling og 3 h release. En innzoomet firkant som viser merket BrdU-foci, er til stede i hjørnet av hvert BrdU-bilde. Skalastenger = 5 μm. (B) Kvantifisering av BrdU kjernefysisk intensitet i ubehandlede HeLa-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1 etterfulgt av 5 Gy-bestråling, viser dataene gjennomsnittlig ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Vestlig flekk for å validere siRNA-nedslag av PARP-1. F1-23 PARP-1 antistoff gjenkjenner automodifisert PARP-1, noe som resulterer i smurt utseende av siCTRL-båndet og det faste utseendet til katalytisk hemmet PARP-1 i BMN-673-behandlede prøver. Forkortelser: PARP-1 = poly (ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-bromo-2′-deoksyuridin; PCNA = spredning av celle kjernefysisk antigen; IR = bestråling; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; A.U. = vilkårlige enheter; siCTRL = siRNA-kontroll; siPARP-1 = siRNA for å slå ned PARP-1; s.e.m. = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer A (buffer før utpakking) 30 ml | ||
| Reagent | Volum | Endelig konsentrasjon |
| H2O | 18 ml | |
| RØR (pH 7, 500 mM) | 600 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 750 μL | 100 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| EGTA (500 mM) | 60 μL | 1 mM |
| Trition X-100 (10%) | 1,5 ml | 0.50% |
| Sukrose (1 M) | 9 ml | 300 mM |
| Buffer B (Cytoskeleton-buffer) 30 ml | ||
| Reagent | Volum | Endelig konsentrasjon |
| H2O | 25.035 ml | |
| Tris pH 7,5 (1 M) | 300 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 75 μL | 10 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| Tween20 (10 %) | 3 ml | 1% |
| 10% natriumdeoksykolcat | 1,5 ml | 0.50% |
| Reagent | Volum |
| 16% PFA | 2,5 ml |
| PBS 1x | 7,5 ml |
Tabell 1.
Supplerende figur S1: Visuell representasjon av Cell Profiler Software og Speckle counting pipeline del 1. (A) Skjermbilde viser vinduet som brukes til å identifisere de forskjellige kanalfilene til bildene som skal analyseres. Disse bildene viser celleprofileringsgrensesnittet. (B) Skjermbilde av menyen Identifiser primære objekter for å identifisere nukleiene. De uthevede verdiene er de ofte endrede verdiene for best å identifisere kjerner. Forkortelser: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Visuell representasjon av Cell Profiler Software og Speckle counting pipeline del 2. (A) Skjermbilde av menyen Identifiser primære objekter for å identifisere BrdU-focien i kjernene. (B) Skjermbilde av menyen Mål objektintensitet for å måle BrdU- og PCNA-kjerneintensiteten. Forkortelser: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = spredning av celle kjernefysisk antigen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Visuell representasjon av Cell Profiler Software og Speckle counting pipeline del 3. (A) Representasjon av nukleiidentifikasjonen etter celleprofilering etter optimalisering. (B) Representasjon av BrdU-foci-identifikasjonen. (C) Skjermbilde er en zoom-in på en celle i det første vinduet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S4: Scatter-plott av PCNA-positive og PCNA-negative celler. (A) Et eksempel på en PCNA-scatter-tomt som brukes til å skille PCNA-positiv fra PCNA-negative celler. PCNA-intensiteten fra en enkelt tilstand ble plottet inn og skillet mellom de to populasjonene identifisert. Den grønne fremhever PCNA-positive celler, den røde representerer PCNA-negative celler. Dette gjøres for hvert enkelt eksperiment og tilstand. (B) Kvantifisering av BrdU kjernefysisk intensitet i PCNA-negative ubehandlede HeLa-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1; dataene viser gjennomsnittlig ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Forkortelser: PARP-1 = poly (ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-bromo-2′-deoksyuridin; IR = bestråling; PCNA = spredning av celle kjernefysisk antigen; A.U. = vilkårlige enheter; siCTRL = siRNA-kontroll; siPARP-1 = siRNA for å slå ned PARP-1; s.e.m. = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S5: BrdU-signal uten bestråling. (A) Representative bilder av BrdU foci formasjon og PCNA farging uten bestråling. Skalastenger = 5 μm. En innzoomet firkant som viser merket BrdU-foci, er til stede i hjørnet av hvert BrdU-bilde. (B) Kvantifisering av BrdU kjernefysisk intensitet i PCNA-positive ubehandlede Hela-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1; dataene viser gjennomsnittlig ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Kvantifisering av BrdU kjernefysisk intensitet i PCNA-negative ubehandlede HeLa-celler, behandlet med 5 μM BMN-673, siCTRL og siPARP-1; dataene viser gjennomsnittlig ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Forkortelser: PARP-1 = poly (ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-bromo-2′-deoksyuridin; PCNA = spredning av celle kjernefysisk antigen; IR = bestråling; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; A.U. = vilkårlige enheter; siCTRL = siRNA-kontroll; siPARP-1 = siRNA for å slå ned PARP-1; s.e.m. = standardfeil av gjennomsnittet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra video 1: Bruk av Cell Profiler og Speckle Counting pipeline for å analysere BrdU-farging for måling av DNA-reseksjon. Denne videoen viser bruken av Cell Profiler og Speckle counting pipeline. Den viser hvordan du importerer og analyserer bilder med dette verktøyet spesielt for denne protokollen. Forkortelse: BrdU =5-bromo-2′-deoxyuridine. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver en metode som gjør bruk av IF-farging for å måle variasjoner i DNA-reseksjon i cellulo. Den nåværende standarden for å observere en effekt på DNA-reseksjon er gjennom RPA-farging; Dette er imidlertid en indirekte metode som kan påvirkes av DNA-replikasjon. Tidligere har en annen BrdU-inkorporeringsbasert DNA-reseksjon IF-teknikk blitt beskrevet for å klassifisere de resulterende intensitetene i BrdU-positive og BrdU-negative celler. Denne metoden gjorde det mulig for celler som ikke gjennomgår HR å bli regnet som positive på grunn av bakgrunn eller mitokondriefarging, noe som resulterer i en høy BrdU-intensitet14,15,16. Den primære nyheten om metoden beskrevet i dette dokumentet er tillegg av PCNA-farging, noe som gjør det mulig å velge for S- og G2-faser av cellesyklusen, og sikre at det resulterende BrdU-signalet skyldes reseksjon og dermed til homologistyrt reparasjon.
Det kritiske trinnet i denne protokollen er forhåndsutpakkingen. uten dette vil BrdU-foci ikke være synlig, og hvis det gjøres feil, vil cellene løsne helt. Feil forberedte buffere vil resultere i ufullstendig forhåndsuttrekking, for eksempel delvis fjerning av cytoskeletal eller økt bakgrunnssignal. Det er svært viktig å respektere varigheten av inkubasjon med pre-utvinning buffere, økt varighet i bufferne kan føre til at cellene løsner fra dekslene. Viktig, hvis denne protokollen utføres med dårlig tilhengerceller, forhåndsbehandle dekslene med polylysin for å redusere celleavløsning under pre-ekstraksjon. Deretter, uten metanolfiksering, vil PCNA-signalet ikke være synlig.
En annen viktig variabel i denne protokollen er blokkeringsbufferen: Inkompatible blokkeringsbuffere vil føre til tap av BrdU-signal. For eksempel vil 10% føtal bovint serum i 1x PBS-blokkeringsbuffer fungere når det ikke kombineres med metanolfiksering; Men når det kombineres med metanolfiksering etter behov for PCNA-farging, reduseres BrdU-signalet betydelig. Det er mulig at andre blokkeringsagenter og metoder vil fungere med denne protokollen; 3% BSA i 1x PBS ga de beste resultatene. En endelig viktig komponent i denne teknikken er bruken av en DNA-skadekilde; uten dette vil det være lite eller ingen kjernefysisk BrdU-signal (Supplerende figur S5). Erfaring har vist at bestråling er en utmerket skadekilde for denne metoden. Men hvis det ikke er tilgang til en bestråler, kan radiomimetiske stoffer som neocarzinostatin brukes i stedet.
Cell profiler er et nyttig og allsidig verktøy som muliggjør enkel og konsistent analyse av bildene som produseres i denne teknikken. Innstillingene kan tilpasses både for størrelsen på objektene som identifiseres, og terskelen for når det gjøres (Ekstra video 1). Siden kjerneintensiteten til BrdU-fargingen er ønsket avlesning, er nøkkeltilpasningen i identifiseringen av kjernene fra DAPI-filene. Analysen av bildene fra hver betingelse må gjøres separat, da resultatene oppnås i form av en enkelt CSV-fil som inneholder celle- og bildenumre, men ikke betingelsesnavn. Hvis du vil finne ut om analysebetingelsene er riktige, bruker du funksjonen Start testmodus og kontrollerer at øyeikonet er åpent i de ønskede trinnene. Lukk dette ikonet når du kjører den faktiske analysen, da det vil resultere i popup-vinduer og redusere hastigheten på programmet. I starttestmodus kan brukere gå frem og tilbake, endre innstillingene etter behov for å identifisere først kjernene og deretter BrdU-foci.
Når du er fornøyd med den resulterende identifikasjonen, bruk de samme innstillingene for hver betingelse i samme eksperiment; Dette kan kreve anskaffelse av et testbilde for hver betingelse før du analyserer hele bunken for å sikre at innstillingene overholder hver betingelse. Det er viktig å merke seg at avhengig av bildeanskaffelse, kan det være variasjon i Cell profiler-innstillingene mellom brukere og mellom programvareversjoner. Derfor er det viktig å gå gjennom teststadiet for å bestemme de ideelle parametrene for spesifikke eksperimenter. Når du forbereder deg på å grafere resultatene, må PCNA (S-fase)-positive celler identifiseres. For å gjøre dette måles PCNA-intensiteten, på samme måte som BrdU-intensiteten, og de resulterende verdiene plottes som et scatter-plott for best å visualisere cut-off intensitetsverdien for PCNA-positive celler. De PCNA-negative resultatene vil deretter bli fjernet fra datasettet for å tillate BrdU-intensitetsgrafen. De oppgitte tilleggstallene viser skjermbilder fra programmet som fremhever de mest optimaliserte innstillingene (Supplerende figur S1, supplerende figur S2 og supplerende figur S3).
En mulig modifikasjon av protokollen er PCNA-antistoffet som brukes; to forskjellige PCNA antistoffer ble vellykket testet, den som er oppført her og en annen som ikke lenger er i produksjon-en rotte monoklonalt antistoff (Bulldog Bio PCA16D10). Til slutt bør brukerne dekke dekslene med parafilm under antistoffinkubasjon. Det er ikke strengt nødvendig, selv om et betydelig større volum antistoffløsning ville være nødvendig for å dekke dekslene helt uten dette. En annen metode er å plassere et ark med parafilm rundt en glassplate, plassere dråper av antistoffoppløsningen på parafilmen, og forsiktig plassere dekslene på cellesiden ned på dråpen av antistoffoppløsning. Denne glassplaten kan deretter plasseres i et fuktig kammer ved 4 °C over natten for primær inkubasjon og i mørket ved romtemperatur for sekundær inkubasjon. Denne metoden er helt funksjonell selv om den øker tiden for håndtering av dekslene betydelig, og som et resultat øker sannsynligheten for å slippe eller bryte dekslene.
En alternativ metode for å måle reseksjon er gjennom bruk av DNA-kammen SMART-metoden; mens denne teknikken gir veldig klare resultater, er det mye mer komplisert, krever mer tid og er dyrere17. SMART-metoden krever utvinning av DNA uten å skade det, etterfulgt av å strekke dette DNA på deksler som skal følges av en IF. BrdU IF-metoden er til sammenligning både enkel og kostnadseffektiv, og krever ikke en større investering enn kostnaden for antistoffet. Denne metoden gir en innledende måte å måle reseksjon som er mer nøyaktig enn bare å måle RPA foci formasjon, som kan være relatert til dens effekter på mange cellulære funksjoner. RPA er imidlertid fosforylert på spesifikke rester under reseksjon som en del av DNA-skaderesponsen.
Enkeltmolekylavbildning avslørte nylig fosforylatert RPA (pRPA) som en negativ reseksjonsregulator18. Derfor kan denne metoden på lang sikt gjøres enda mer presis ved å koble PCNA / fosforilert RPA-farging med BrdU-avbildning ved bruk av passende antistoffer og optimaliserte fargingsforhold. Metoden som presenteres gir imidlertid en representasjon av reseksjon som observeres uavhengig av proteinene som er involvert i reseksjonsprosessen, og dermed negerer skjevheter som kan oppstå fra endringer i signalet som svar på behandlingen. Denne teknikken gir ikke bare en metode for å avgjøre om et protein er involvert i reseksjon, men også for å avgjøre om celledød som følge av narkotikabehandling er relatert til hypo / hyper-reseksjon. Denne informasjonen kan være gunstig for å forstå ikke bare de mekanistiske aspektene ved DNA-reparasjon, men også den biologiske mekanismen som ligger til grunn for den narkotikainduserte celledøden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Marie-Christine Caron for fremragende tekniske råd. Dette arbeidet støttes av midler fra Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. har en Tier 1 Canada Research Chair i DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S er en FRQS ph.d.-stipendiat, og S.Y.M er en FRQS postdoktor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J.
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
