Summary
Subarachnoid blødning fortsætter med at bære en høj byrde af dødelighed og sygelighed hos mennesket. For at lette yderligere forskning i tilstanden og dens patofysiologi præsenteres en præ-chiasmatisk, enkelt injektionsmodel.
Abstract
På trods af fremskridt i behandlingen i løbet af de sidste årtier bærer subaraknoid blødning (SAH) fortsat en høj byrde af sygelighed og dødelighed, der stort set rammer en ret ung befolkning. Flere dyremodeller af SAH er blevet udviklet til at undersøge de patofysiologiske mekanismer bag SAH og til at teste farmakologiske interventioner. Den præ-chiasmatiske, enkelt injektionsmodel i rotten, der præsenteres i denne artikel, er en eksperimentel model af SAH med et forudbestemt blodvolumen. Kort sagt bedøves dyret, intuberes og holdes under mekanisk ventilation. Temperaturen reguleres med en varmepude. Et kateter placeres i halearterien, hvilket muliggør kontinuerlig blodtryksmåling samt blodprøvetagning. Atlantooccipitalmembranen skæres, og et kateter til trykoptagelse placeres i cisterna magna for at muliggøre intracerebral trykmåling. Dette kateter kan også bruges til intratekale terapeutiske indgreb. Rotten placeres i en stereotaksisk ramme, et burrhul bores anteriort til bregmaen, og et kateter indsættes gennem burrhullet og placeres lige foran den optiske chiasme. Autologt blod (0,3 ml) trækkes ud af halekateteret og injiceres manuelt. Dette resulterer i en stigning i intracerebralt tryk og et fald i cerebral blodgennemstrømning. Dyret holdes bedøvet i 30 minutter og gives subkutan saltvand og smertestillende midler. Dyret ekstuberes og returneres til sit bur. Den præchiasmatiske model har en høj reproducerbarhedshastighed og begrænset variation mellem dyr på grund af det forudbestemte blodvolumen. Det efterligner SAH hos mennesker, hvilket gør det til en relevant model for SAH-forskning.
Introduction
Ikke-traumatisk subaraknoid blødning (SAH) er en form for slagtilfælde, der repræsenterer omkring 5% af alle tilfælde. Den mest almindelige årsag til ikke-traumatisk SAH er den pludselige brud på en aneurisme (aSAH), som tegner sig for 85% af SAH'erne. Andre årsager omfatter brud på en arterio-venøs misdannelse, koagulopatier og brud på vener i perimesencephalic blødning1. Incidensraten er 9 pr. 100.000 personår med dødelighed omkring en ud af tre og en anden tredjedel, der kræver støtte fra dagligdagen efter SAH 2,3.
Efter indledende stabilisering og diagnosebekræftelse afhænger behandlingen af blødningens sværhedsgrad. De hårdest ramte patienter vil få indsat et ekstraventrikulært dræn i ventriklerne for at reducere det intracerebrale tryk (ICP) og blive indlagt på neurointensivafdelingen, hvor de overvåges nøje. Patienterne vil gennemgå en angiografi for at identificere den (sandsynlige) aneurisme og derefter få aneurismet oprullet eller klippet for at forhindre genblødning4. På trods af adskillige forsøg med farmakologiske terapier har kun nimodipin, en calciumkanalantagonist, vist sig at forbedre resultaterne5. Flere kliniske forsøg er i øjeblikket i gang. Se anmeldelsen af Daou og kolleger for en omfattende liste6.
Bruddet af en aneurisme er blevet beskrevet som den pludselige indtræden af den værste hovedpine, der nogensinde er oplevet, eller en tordenklaphovedpine. Bruddet resulterer i en kraftig stigning i ICP efterfulgt af en reduktion i cerebral blodgennemstrømning (CBF). Denne reduktion resulterer i global iskæmi i hjernen, hvilket kan resultere i bevidsthedstab. Denne mere mekanistiske vej sammen med den initierede nedbrydning af de ekstravaserede elementer i blodet giver anledning til cytokinfrigivelse og aktivering af det medfødte immunsystem, hvilket resulterer i steril neuroinflammation. Desuden observeres ofte nedbrydning af blod-hjerne-barrieren, hvilket resulterer i cerebralt ødem og forstyrrelse i ionhomeostasen. Alle disse ændringer og mere, opfundet tidlig hjerneskade (EBI), forekommer inden for de første par dage og resulterer i neuronalt tab og apoptose7.
Ca. 1/3 af patienterne ramt af aSAH vil udvikle forsinket cerebral iskæmi (DCI) mellem dag 4-148. DCI defineres som enten debut af en fokal, neurologisk svækkelse eller et fald på mindst to point på Glasgow komaskalaen, der varer i mindst 1 time, når andre årsager, herunder anfald og genblødning, er udelukket. DCI er forbundet med en øget risiko for død og nedsat funktionsresultat efter aSAH9. Cerebral vasospasme (CVS), indsnævring af cerebrale arterier, har været kendt for at være forbundet med DCI i årtier og blev tidligere anset for at være den eneste årsag til DCI. Det er siden blevet vist, at CVS kan forekomme uden udvikling af DCI, og flere faktorer, herunder mikrovaskulær trombose og indsnævring, kortikal spredningsdepression og et inflammatorisk respons af EBI er siden blevet identificeret10,11,12.
På grund af EBI's og DCI's store indflydelse på sygdomsforløbet og udfaldet af de ramte patienter, skal dyremodeller efterligne disse i videst muligt omfang, samtidig med at de stadig er reproducerbare. Forskere har anvendt en bred vifte af forskellige modeller i en række dyr fra mus til ikke-menneskelige primater for at forsøge at simulere aSAH. Sprague-Dawley og Wistar vildtype rotter er i øjeblikket de mest almindeligt anvendte forsøgsdyr, og de mest almindelige modeller er den endovaskulære perforeringsmodel, cisterna-magna dobbeltinjektionsmodellen og endelig den præ-chiasmatiske enkeltinjektionsmodel, som vil blive beskrevet i denne artikel13.
Den præ-chiasmatiske, enkeltinjektionsmodel blev oprindeligt udviklet af Prunell og kolleger for at imødegå nogle af manglerne ved de andre eksperimentelle modeller14. Når operationen mestres, er den meget reproducerbar og minimerer variation mellem dyr. Modellen efterligner SAH hos mennesker på flere punkter, herunder den pludselige stigning i ICP efter injektion af blod, hvilket resulterer i forbigående global iskæmi på grund af et fald i CBF15,16. Det påvirker den forreste cirkulation, hvor de fleste aSAH hos mennesker forekommer17. Dødeligheden varierer fra 10% -33% afhængigt af undersøgelsen og mængden af injiceret blod14,18. Forsinket celledød og neuroinflammation kan påvises på dag 2 og 7, hvorved der tilvejebringes variabler til undersøgelse af konsekvenserne af EBI og DCI 19,20.
Studiet præsenterer en opdateret beskrivelse af den præchiasmatiske enkeltinjektionsmodel hos rotter sammen med en beskrivelse af, hvordan ICP-sonden kan udnyttes som port til intratekal administration af lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure udføres i overensstemmelse med EU's direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål og er godkendt af Dyreforsøgstilsynet (licens nr. 2016-15-0201-00940). Kirurgi udføres ved hjælp af aseptisk teknik i videst muligt omfang, herunder sterile instrumenter, handsker, katetre og suturer. Undersøgelsen anvendte han- og hunrotter fra Sprague-Dawley, der vejede 230-350 g, grupperet i 12-timers lys/mørk cyklus med konstant temperatur på 22 °C (± 2 °C) og fugtighed på 55% (± 10%). Dyrene er forsynet med standard chow og vand ad libitum. Dyrene anbringes i enkeltbure efter operationen, men kan sættes tilbage i gruppebur, når ICP-sonden er fjernet. Bedøvelsesmidlet i denne protokol er isoflurangas, men en 1,5 ml / kg 3: 2 intraperitoneal blanding af ketamin (100 mg / ml) og xylazin (20 mg / ml) er også effektiv21.
1. Forberedelser
- Et 16 G perifert venekateter ændres til intubation. For at ændre skal nålen forkortes med 1 cm og den resterende distale 1 cm x 30° bøjes mod injektionsventilen. Fjern katetervingerne (flere gange).
- For at lave en ICP-sonde skal du skære et 20 mm stykke polyethylenrør (indvendig diameter (ID): 0,58 mm, ydre diameter (OD): 0,96 mm) og brænde den ene ende for at lave en cirkulær plade, der holder et åbent lumen. Omgå polyethylenslangen med 1 mm silikoneslange (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm), før du tilslutter 10 mm silikoneslange (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) til enden af polyethylenslangen.
- Tænd for den bærbare computer, og åbn dataindsamlingssoftwaren. Kalibrer blodtrykstransducere (BP) og ICP-transducere (intracerebralt tryk) og laserdoppleren i henhold til producentens anvisninger.
- Forbered blodgasanalysatorapparatet.
FORSIGTIG: Sørg for, at der er nok isofluran i fordamperen. - Tænd forO2 og atmosfærisk luftstrøm. Indstil strømmen afO2 ved 30% og atmosfærisk luft ved 70%.
- Sæt varmepuden og indstil temperaturen til 37 °C.
2. Anæstesi
- Placer rotten i anæstesikammeret med en strøm på 30%O2 og 70% atmosfærisk luft. Indgiv 5% isoflurangas i kammeret. Tilstrækkelig bedøvelse tager ca. 4 min. Kontroller vejrtrækningen omhyggeligt.
- Når den bedøves, skal du placere rotten i liggende stilling på en tung plade omgået af et gummibånd. Placer rottens fortænder under elastikken.
- Træk tungen forsigtigt ud med buede tang. Rengør strubehovedet med en bomuldsspids. Placer et eksternt lys i midterlinjen af halsen for at visualisere stemmebåndene.
- Intubate under inspiration ved hjælp af det modificerede 16 G perifere venekateter. Når stiletten er korrekt indsat, skal du fjerne den. Tilslut kateteret til ventilatoren.
BEMÆRK: Korrekt placering af røret bekræftes af brystbevægelser synkroniseret med respirationshastigheden. Hvis der ses bevægelser af maven, ekstuberes og genindføres rotten i anæstesiklokken. Gentag ikke proceduren mere end tre gange på grund af risikoen for at beskadige luftvejene. - Når du intuberer, skal du holde dyret på kunstig åndedræt med 30%O2 og 70% atmosfærisk luft. Oprethold anæstesien ved 1,5% -3% isofluran. Isofluran justeres for at holde blodtrykket mellem 80-100 mmHg.
- Hold åndedrætsværnets inspirerende volumen på 3 ml og frekvensen på 40-45 inspirationer/min. Juster det inspirerende volumen i henhold til blodgasanalysen.
- Lav en søm gennem det indre bløde væv i kinden med en 2-0 sutur. Bind suturen omkring injektionsrøret og injektionsventilen i det perifere venekateter for at fastgøre kateteret.
- Flyt rotten til operationsfeltet og placer den i liggende stilling med halen vendt mod kirurgen.
- Påfør øjengelen, når det er nødvendigt for at modvirke tørre øjne.
- Udfør en tåklemme for at bekræfte en tilstrækkelig dybde af anæstesi. Vurder og vedligehold anæstesidybden under operationen.
3. Halekateter
- Desinficer den proksimale 3-4 cm af halen med 0,5% chlorhexidinethanol.
BEMÆRK: Fra nu af skal du bruge det kirurgiske mikroskop efter kirurgens skøn. - Lav et 15-20 mm hudsnit i den proksimale ende af halen på den ventrale side. Pas på ikke at skære arterien.
- Løsn huden fra det underliggende bindevæv ved hjælp af en buet tang.
- Træng forsigtigt ind i fasciaen, der udsætter arterien.
- Frigør forsigtigt halearterien fra det underliggende væv ved hjælp af en buet tang.
- Slip tre sorte silketråde under beholderen. Placer en tråd så distalt som muligt og bind en kirurgisk knude tæt omkring arterien. Hold de løse ender af tråden med en hæmostat.
- Bind de to resterende tråde løst rundt om arterien.
- Skub den proksimale tråd så proximalt som muligt. Påfør en hemostat for at holde enderne af den proksimale tråd. Træk hemostat let, men nok til at begrænse og blokere blodgennemstrømningen. Placer hæmostaten på maven.
- Skær spidsen af kateteret i en vinkel på 45°. Skær det skarpe punkt for at forhindre arteriel vægindtrængning.
- Brug en Vannas-saks til at lave et arteriesnit 1/3 af arteriens diameter i en vinkel på 30 °, 3-5 mm fra den distale knude.
- Indsæt kateteret i arterien ved hjælp af to lige tang. Brug en tang til at holde kateteret og den anden til forsigtigt at trække arterien over kateteret.
- Indsæt kateteret op i beholderen til den proksimale knude og løsn knuden fra hæmostaten. Visualiser blodgennemstrømningen i kateteret. Fastgør den midterste tråd løst til kateteret.
- Fortsæt indsættelsen til, og om muligt lige ud over, det punkt, hvor arterien er dækket igen af fascia.
- Kontroller kateterets placering og eventuel lækage ved at skylle med saltvand.
- Fastgør de to proksimale tråde ved hjælp af kirurgiske knuder.
BEMÆRK: Blodtryksmålingen skal være pulserende; Hvis ikke, er kateteret ikke placeret korrekt. - Fastgør kateteret i slutningen af snittet ved at binde en kirurgisk knude ved hjælp af den distale tråd.
- Sy hudsnittet løst sammen med to ikke-resorberbare monofilament 4-0 sutur. Pas på ikke at trænge ind i kateteret.
BEMÆRK: Under hele operationen skal du være opmærksom på pulsationens amplitude. Hvis dette er lavt, skylles kateteret med saltvand. - Løsn arteriekateteret fra tryktransduceren for at tillade blodgennemstrømning til blodgasprøvetagning. Anbring et mikrokapillarrør for enden af kateteret. Lad blodet strømme ind i røret. Sæt kateteret på transduceren igen efter blodopsamling, og skyl kateteret.
- Indsæt kapillarrøret i blodgasanalysatoren. Mål pH, pCO2 og pO2 og noter dem ned
BEMÆRK: Afhængigt af blodgas- og blodtryksværdierne skal du ændre ventilationshastigheden. Hvis det gennemsnitlige arterielle tryk (MAP) er for lavt, skal du prøve at skrue ned for strømningshastigheden af isofluran. Test reflekserne for at sikre korrekt dybde af anæstesi.
4. ICP-sonde
- Placer rotten i den stereotaksiske ramme. Det er vigtigt at placere rotten symmetrisk.
- Placer en cylindrisk pude under den stereotaksiske ramme for at skabe forreste bøjning af nakken.
- Barber rottens hovedbund, hals og området bag ørerne. Fjern det overflødige hår.
- Desinficer området med 0,5% chlorhexidinethanol.
- Bedøv lokalt med 0,7 ml 10 mg / 5 μg / ml lidokain med adrenalin, indsæt nålen i den kaudale ende af kraniet i midterlinjen. Injicer i nakkemuskulaturen med 0,3-0,4 ml. Injicer resten subkutant rundt og foran bregmaen.
- Lav et hudsnit fra nålepunktionen ~ 8 mm kausalt i midterlinjen.
- Disseker alle musklerne stump i lag for at identificere atlantooccipital membranen (marmorfarvet trekant kausalt til kraniet i midterlinjen).
- Brug Alm retractoren til at begrænse nakkemuskulaturen. Placer den spidsede retractor kausalt, hvis det er nødvendigt.
- Kontroller, om den sterile ICP-sonde er tilsluttet ICP-transduceren. ICP-sonden skylles med saltvand. Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede i ICP-sonden.
- Snit atlantooccipital membranen ved hjælp af en 23 G nål. Lav et hul for at lokke ICP-sonden gennem membranen.
- Coax sonden forsigtigt gennem atlantooccipital membranen. Træk let i sonden, og sørg for, at den viser en pulserende kurve på mellem 0-5 mmHg. Hvis ikke, skal du fjerne sonden, kontrollere forbindelsen til transduceren og bekræfte strømmen gennem lumen.
- Påfør to dråber af vævslimen. Flyt 1 mm silikoneslangen frem til membranen, og påfør yderligere lim for at minimere risikoen for ICP-sondeforskydning.
- Fjern retractoren/retractorerne.
- Lav en vandret madrassutur til den cephaliske ende af snittet og en simpel afbrudt sutur til den kaudale ende ved hjælp af en ikke-resorberbar monofilament 4-0 sutur.
5. Placering af nålen og Laser-Doppler-sonden
- Lav et snit i midterlinjen lige foran øjnene, 15 mm kausalt.
- Fjern bindevævet og musklerne med tang. Brug enden af en steril vatpind som rougine, hvilket gør det muligt at identificere bregma og koronale suturer.
- Placer Alm-retraktoren.
- Anbring en 25 G rygnål i stereotaksrammen. Placer nålen nøjagtigt på bregma og noter positionen.
BEMÆRK: Placer midterlinjeleddet af stereotaksrammen 30° mod dyret i lodret plan. - Fjern nålen fra bregmaen, flyt rammen 65 mm anteriort og udskift derefter nålen i midterlinjen for at markere borestedet.
- Bor indtil dura mater er identificeret under knoglen. Fjern forsigtigt knoglefragmenterne ved hjælp af lige tang og fyld hulrummet med knoglevoks.
- Bor et andet hul 3-4 mm lateralt til højre for bregma og lige foran koronal sutur til Laser-Doppler. Det er ikke nødvendigt at bore hele vejen gennem knoglen. Pas på ikke at trænge ind i dura mater.
- Se efter de skibe, hvor laser-doppleren kan måle blodgennemstrømningen. Placer laser-doppleren, og kontroller værdierne. Der kræves en minimumsværdi på 100 FU. Fjern mikroskopet (kunstigt lys).
- Hvis værdierne stadig er acceptable, skal du tilføje en dråbe lim for at fastgøre sonden.
- Kontroller igen for at bekræfte, om værdien er over 80 FU. Hvis værdien er under 80 FU, skal du fjerne og flytte sonden for at nå en værdi over 80 FU.
BEMÆRK: Værdien, FU, er en vilkårlig enhed, der viser cerebral blodgennemstrømning (CBF).
6. Induktion af SAH
- Indsæt nålen forsigtigt gennem kraniet i midterlinjen mellem halvkuglerne, indtil modstanden af bunden af kraniet mærkes. Træk nålen 1 mm tilbage for at sikre korrekt placering lige foran den optiske chiasme.
- Drej nålen 90° med uret, så kanylespidsen peger mod højre for at sikre det mest homogene resultat ved injektion af blodet. Fjern stiletten (figur 3).
- Ligevægt i 15 min og juster anæstesiniveauet for at opnå et gennemsnitligt arterielt blodtryk i området 80-100 mmHg.
- Udfør en blodgasanalyse. Juster anæstesiniveauet i overensstemmelse hermed.
- Træk 500 μL blod ud af halekateteret ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en stump 23 G kanyle.
- Fyld det døde rum i rygmarvsnålskammeret med blod for at undgå injektion af luft. Fjern kanylen på 23 G fra den fyldte sprøjte og kontroller, at sprøjten indeholder 300 μliter blod.
- Tilslut sprøjten til rygsøjlen. Tag godt fat og injicer blodet manuelt for at overgå MAP.
- Overhold en stejl stigning i ICP og et stejlt fald i CBF på den bærbare computer.
BEMÆRK: CBF skal være 50% eller lavere sammenlignet med baseline score i mindst 5 minutter for at operationen skal lykkes, se figur 4. Sham rotter gennemgår ikke trin 6.1-6.7, hvorved indførelsen af rygnålen i cerebrum udelades, hvilket minimerer mulig spontan blødning og iatrogen hjerneskade.
7. Genopretning og opvågning
- Administrer 0,1 ml / 100 g dyrevægt på 5,0 mg / ml carprofen og 1 ml / 100 g dyrevægt isotonisk saltvand subkutant. Sørg for, at væskerne mindst har stuetemperatur, før du administrerer.
- Hold derefter rotten under bedøvelse i 30 minutter efter SAH.
- Fjern nålen, laserdopplersonden, og fyld derefter hulrummene med knoglevoks. Luk snittet ved hjælp af to vandrette madrassuturer med ikke-resorberbar monofilament 4-0 sutur.
- For at bruge ICP-sonden til injektioner i cisterna magna skal du fjerne silikoneslangen og indsætte en præcis adapter i polyethylenslangen.
- Hvis der ikke er planlagt nogen intervention, skal du skære den enkle, afbrudte sutur. Forkort ICP-sonden så meget som muligt ved hjælp af en saks, og lim derefter enden for at forhindre lækage af cerebrospinalvæske (CSF). Luk snittet med en ikke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Fjern rotten fra den stereotaxiske ramme og læg den i liggende stilling. Fjern de løse suturer fra halesnittet.
- Placer en enkelt sutur proksimal og dybt til arteriekateteret. Fjern kateteret og bind suturen for at forhindre blødning. Sutur halesnittet med en ikke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Sluk for isofluranen.
- Rens rotten og dens pels så meget som muligt.
- Når pedaludtrækningsrefleksen er genvundet, og rotten har spontan åndedræt, når den er afkoblet fra ventilatoren, ekstuberes den.
- Placer rotten i et enkelt bur med mad og vand ad libitum. Placer halvdelen af buret under en varmeplade og placer rotten i dette område af buret.
- Udfør intratekal administration ved at tilpasse pinportinjektoren til en præcisionssprøjte, og administrer behandlingen via pinportadapteren. Denne intervention er mulig hos dyr, der er vågne. Se figur 5.
8. ICP-sonde fjernelse (hvis ikke fjernet under operationen)
BEMÆRK: Brug et kirurgisk mikroskop efter kirurgens skøn.
- Placer rotten i anæstesikammeret som beskrevet tidligere.
- Når den bedøves, skal du placere rotten i liggende stilling i operationsfeltet med varmepude.
- Placer næsen i anæstesimasken. Indstil niveauerne forO2 til 30%, atmosfærisk luft til 70% og isofluran til 2%.
- Påfør kontinuerligt øjengelen for at modvirke tørre øjne.
- Skær den kaudale enkle afbrudte sutur. Åbn snittet og fjern det mulige nekrotiske væv eller blodpropper.
- Forkort ICP-sonden så meget som muligt ved hjælp af en saks og lim enden for at forhindre lækage af cerebrospinalvæske (CSF). Luk snittet med en ikke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Sluk for isofluranen.
- Når rotten begynder at bevæge sig, skal du placere den i et enkelt bur med mad og vand ad libitum. Placer halvdelen af buret over en varmeplade og placer rotten i dette område.
- Når dyrene vender tilbage til sædvanlig tilstand, genintroduceres de i et fælles bur under opsyn i de første 15 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvinder har en øget risiko for aSAH sammenlignet med mænd. På trods af dette anvendes mandlige gnavere primært i forsøg på grund af mulig bias fra heterogenitet af østruscyklus hos kvinder. De repræsentative resultater, der præsenteres her, er fra en nylig publikation, der sammenligner hun- og hanrotter, hvilket bekræfter, at modellen giver lignende resultater hos hundyr sammenlignet med hanrotterpå 21 år. Undersøgelsen omfattede 34 hunrotter fra Sprague-Dawley (18 SAH'er og 16 shams). Shams havde ikke rygmarvsnålen ned til optisk chiasme eller blod injiceret. Alle andre procedurer blev udført på Shams, der var identiske med SAH'er. Alle de fysiologiske parametre mellem grupperne var sammenlignelige. Endelig blev der foretaget en metaanalyse af data fra tidligere forsøg med hanrotter, som blev sammenlignet med resultaterne af nærværende undersøgelse21.
Den roterende poltest er en test af grov sensorimotorisk funktion. Dyret placeres i den ene ende af en 150 cm x 45 mm stang, som kan rotere op til 10 o / min. Målet er at nå den fjerne ende af stangen, hvor et bur er placeret. SAH-rotter klarede sig signifikant dårligere på dag 1 og 2 sammenlignet med falske dyr på den roterende stang (figur 1).
Efter SAH opreguleres både ET-1- og 5-HT-receptorfamilien i cerebrale arterier, hvilket resulterer i en øget sammentrækning, når den stimuleres og derved bidrager til CVS22,23. Den basilararterie (BA) og midterste cerebrale arterier (MCA) blev fjernet efter halshugning og anvendt til myografforsøg. Både endothelin 1 (ET-1), en agonist for ET-1-receptorfamilien og 5-carboxamidotryptamin (5-CT), en agonist for 5-HT-receptorfamilien, producerede signifikant øget vaskulær sammentrækning i SAH sammenlignet med sham (figur 2). Følsomhed kan observeres ved de lavere koncentrationer, der er nødvendige for at fremkalde sammentrækning efter SAH hos begge køn.
Øget vandindhold (ødem) efter SAH er et mål for reduceret funktionelt resultat hos mennesker24. Signifikant øget cerebralt ødem blev fundet i SAH sammenlignet med humbug på dag 2. Der var også en tendens til øget ødem i hippocampus, men dette var ikke statistisk signifikant (p = 0,0508)21.
Når man sammenligner ovennævnte data med historiske mandlige data, er resultaterne sammenlignelige. Metadataene viser øget kontraktilitet hos mandlige SAH'er efter tilføjelse af ET-1 eller 5-CT (figur 2). Desuden klarede SAH-rotterne sig betydeligt dårligere sammenlignet med shams, når de udførte den roterende poltest. Resultatet indikerede en nedsat sensorimotorisk funktion (figur 1).
Figur 5A viser fordelingen af det autologe, injicerede blod efter saltvandsperfusion 30 minutter efter induktion af SAH. Figuren viser, at blodet er blevet fordelt i det subaraknoide rum efter præchiasmatisk injektion.
Figur 5B og figur 5C viser fordelingen af intratekalt injicerede farvestoffer efterfulgt af saltvandsperfusion i hele kroppen i 30 minutter efter injektionen. Figur 5B viser fordelingen af 25 μL af 20 mM Evans Blue (vandopløselig) og figur 5C viser fordelingen af 25 μL af 10 mM Oil Red O (vanduopløselig). Begge farvestoffer viste sig at være fordelt i det subaraknoide rum efter injektionen i cisterna magna, hvilket bekræfter, at dette er en gennemførlig model for intratekal injektion af både vandopløselige og uopløselige forbindelser. Værd at bemærke er dannelsen af aflejringer omkring arterierne for den vanduopløselige forbindelse.
Figur 1: Analyse af sensorisk-motorisk kognition i de første 2 dage efter SAH hos han- og hunrotter. Rotationspoltest blev udført på dag 1 og dag 2 efter SAH. Rotter af begge køn havde betydelige underskud sammenlignet med shamopererede rotter af samme køn. Statistiske forskelle i adfærd mellem grupper blev testet af 2-vejs ANOVA på dag 0, dag 1 og dag 2. Kvinde ingen rotation og 3 o / min: p < 0,05. Kvinde 10 o / min og alle mandlige data: p < 0,01. Værdier er midler ± SEM. Genudgivet med tilladelse fra Spray, S. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af øget følsomhed over for ET-1 og 5-CT inducerede sammentrækninger i basilararterien (BA) og den midterste cerebrale arterie (MCA) 2 dage efter SAH hos han- og hunrotter. (A,B) 60 mM K+-fremkaldte (K+max) kontraktile responser blev anvendt som referenceværdier for normalisering af agonistinduceret respons. Følsomheden over for ET-1 blev signifikant øget 2 dage efter SAH sammenlignet med skamopererede rotter af samme køn i både BA og MCA. (C,D) Følsomheden over for 5-CT blev signifikant øget 2 dage efter SAH sammenlignet med skamopererede rotter af samme køn i både BA og MCA. Koncentrations-responskurverne blev statistisk sammenlignet med tovejs ANOVA. Alle data: p < 0,001. Værdier er midler ± SEM. Genudgivet med tilladelse fra Spray, S. et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Oversigt over opsætningen før induktion af SAH. Fra toppen af billedet skal du bemærke, at 1) injektionsnålen, 2) laser-Doppler-sonden og 3) ICP-sonden alle er på plads. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Prøvespor efter intratekal injektion. Den røde graf viser blodtrykket i mmHg. Den blå graf viser ICP'et i mmHg, og den grønne graf viser CBF i den vilkårlige enhed FU. Stigningen i ICP er resultatet af blodinjektion. Bemærk, at dette resulterer i et fald i CBF > 50% af baseline i mere end 5 minutter. ICP-stigningen resulterer desuden i en lille stigning i blodtrykket, som normaliseres inden for få sekunder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fordeling af intratekalt injiceret blod og farvede farvestoffer. (A) Fordeling af autologt blod 30 minutter efter SAH-induktion. B) Fordeling af 25 μL 20 mM Evans Blue efter intratekal injektion gennem ICP-kateter. C) Fordeling af 25 μL 10 mM Oil Red O efter intratekal injektion gennem ICP-kateter. Alle dyr blev bedøvet med intraperitoneal ketamin/xylazinblanding efterfulgt af saltvandsperfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præchiasmatiske enkeltinjektionsmodel af SAH efterligner flere vigtige elementer i human SAH, herunder stigningen i ICP, reduktion af CBF, forbigående global iskæmi, opregulering af neuroinflammatoriske markører og CVS 14,15,16,18,19,20. ICP-sonden blev også anvendt som port til intratekal administration (figur 5). Desuden viser undersøgelsen, at modellen fungerer ens i han- og hundyr21. Modellen omfatter ikke udvikling af og efterfølgende brud på en aneurisme. En række modeller har forsøgt at producere SAH fra en bristet aneurisme ved induktion af systemisk hypertension enten kirurgisk eller farmakologisk og ved at svække arterievæggen ved hjælp af elastase25,26,27. Alle forsøg har produceret aneurysmal SAH i en delmængde af dyr, men disse modeller har en iboende variation, herunder manglende evne til at forudsige, hvornår aneurismet vil briste. Modellerne egner sig ikke særlig godt til præklinisk forskning på SAH18,28.
Blandt andre murin, SAH-modeller, inkluderer den endovaskulære perforeringsmodel brud på et kar, der noget efterligner bruddet af en aneurisme, men tilbøjelig til høj variabilitet og dødelighed. Den her beskrevne model er bedre sporbar og mere reproducerbar, da blodvolumen er forudbestemt, og injektionstrykket kan kontrolleres. Den dobbelte injektionsmodel har større sandsynlighed for at producere forsinket CVS, men påvirker primært den bageste cirkulation og inkluderer en ufysiologisk anden blodinjektion. Til sammenligning ligner denne model SAH hos mennesker, da det er en enkelt injektion af det forreste kredsløb, og den producerer en reproducerbar ICP-stigning18.
Indflydelsen af forskellige anæstesiregimer på eksperimentel SAH er uklar, og de eksperimentelle data er modstridende. En undersøgelse rapporterede mulig hæmning af cytokiner og generel neuroinflammation i en endovaskulær perforeringsmodel hos mus ved anvendelse af isofluraninhalationer29. En anden gnavermodel resulterede i reducerede respiratoriske parametre og øget hjerneødem sammen med reduceret regional CBF ved anvendelse af isofluraner30. En metaanalyse, der sammenlignede dødeligheden i musemodeller, viste imidlertid ingen forskel i dødelighed mellem isofluran og andre typer anæstesi31. I overensstemmelse hermed har ovennævnte protokol med succes anvendt enten inhalation af isofluran eller en intraperitoneal ketamin/xylazinblanding med lignende resultater i begge grupper21.
For at sikre høj reproducerbarhed og korrekt dataindsamling lægges der overordnet vægt på trinnene vedrørende placering af overvågningsudstyret. Korrekt placering af halekateteret letter kontinuerlig overvågning af blodtrykket og evnen til at foretage blodgasanalyser. Korrekt placering af ICP-kateteret sikrer korrekt ICP-overvågning og efterfølgende mulighed for intratekal intervention. Passende placering af Laser-Doppler-sonden sikrer, at reduktionen af CBF kan overvåges, hvor en reduktion på 50% eller lavere af baseline score i mindst 5 minutter efter SAH-induktion sikrer en stærk iskæmi32. Ved at sikre, at alle overvågningstrin er i orden, kan forskeren sikre korrekt dataindsamling efter SAH-introduktionen.
Protokollen beskriver den præ-chiasmatiske enkeltinjektionsmodel af subaraknoid blødning med opdateringer og modifikationer. Modellen har været værdifuld for SAH-forskningen og vil formentlig fortsat bidrage til en bedre forståelse af subaraknoid blødning, herunder tidlig hjerneskade og forsinket hjerneiskæmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser at erklære.
Acknowledgments
Arbejdet er støttet af Lundbeckfonden og Lundbeck Grant of Excellence (nr. R59-A5404). Funders havde ingen rolle i nogen del af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G peripheral vein catheter | BD Venflon | 393229 | Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed |
| Anesthesia bell/ chamber | Unknown | ||
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL80 | |
| Blood pressure (BP) monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Curved forceps, 12 cm x 3 | F.S.T | 11001-12 | For anesthesia |
| Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm | Homemade | Made from surgical towels | |
| Data acquisition hardware | Adinstruments | ML870 Powerlab | |
| Data acquistion software | Adinstruments | LabChart 6.0 | |
| Drill | KMD | 1189 | |
| Drill controller | Silfradent | 300 IN | |
| Flexible light | Schott | KL200 | |
| Heating pad | Minco | 1135 | |
| Hypodermic needle, 20 G | KD Medical | 301300 | Connects to stereotaxic frame |
| ICP monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | TEC3 | |
| Laptop | Lenovo | T410 | |
| Laser doppler monitor | Adinstruments | ML191 | |
| Laser doppler probe | Oxford Optronics | MSF100XP | Connects to laser doppler monitor |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | For anesthesia |
| Precision syringe, 0.025 mL | Hamilton | 547407 | |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | M900 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss | F170 | |
| Suture needle | Allgaier | 1245 | For anesthesia |
| Temperaure controller | CWE,INC. | TC-1000 | |
| Transducer x 2 | Adinstruments | MLT0699 | Connects to BP and ICP monitor |
| Ventilator | Ugo Basile | 7025 | |
| Veterinary clipper | Aesculap | GT421 | |
| 3-pronged Blair retractor, 13.5 cm | Agnthos | 17022--13 | |
| Blunt Alm retractor | F.S.T | 17008-07 | |
| Curved forceps, 12 cm x 2 | F.S.T | 11001-12 | |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | |
| Straight Dumont forceps, 11 cm | F.S.T | 11252-00 | |
| Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2 | F.S.T | 13008-12 | |
| Straight Iris scissor, 9 cm | F.S.T | 14090-09 | |
| Straight Vannas scissor, 10.5 cm | F.S.T | 15018-10 | |
| Absorpable swabs | Kettenbach | 31603 | |
| Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm | Vömel | 14757 | |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | |
| Carbomer eye gel 2 mg/g | Paranova | ||
| Cotton swab | Heinz Herenz | WA-1 | |
| Cotton tipped applicator x 4 | Selefa | 120788 | |
| Hypodermic needle, 23 G x2 | KD Medical | 900284 | Connects to stopcock. Remove distal end |
| Hypodermic needle, 23 G x3 | KD Medical | 900284 | Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe |
| ICP probe: | Homemade | Made of the following: | |
| Polythene tubing, 20 mm | Smiths medical | 800/100/200 | Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm. |
| Silicone tubing, 10 mm | Fisher | 15202710 | ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm. |
| Silicone tubing, 2 mm | Fisher | 11716513 | ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm. |
| Micro hematocrit tubes | Brand | 7493 11 | |
| OP-towel, 45 cm x75 cm | Mölnlycke | 800430 | |
| PinPort adapter, 22 G | Instech | PNP3F22 | |
| PinPort injector | Instech | PNP3M | |
| Polythene tubing, 2 x 20 cm | Smiths medical | 800/100/200 | Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm. |
| Rubberband | Unknown | ||
| Scalpel, 10 blade | Kiato | 23110 | |
| Spinalneedle, 25 G x 3.5'' | Braun | 5405905-01 | |
| Stopcock system, Discofix x 2 | Braun | 16494C | Connects to transducer |
| Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3 | Ethicon | EH7145H | |
| Syringe, 1 mL | BD Plastipak | 1710023 | |
| Syringe, luer-lock, 10 mL x 4 | BD Plastipak | 305959 | Connects to transducer |
| Tissue adhesive glue | 3M | 1469SB | |
| 0.5% Chlorhexidine spirit | Faaborg Pharma | 210918 | |
| Carprofen 50 mg/mL | ScanVet | 43715 | Diluted 1:10 |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isotonic saline | Amgros | 16404 | |
| Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL | Amgros | 16318 |
References
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), London, England. 306-318 (2007).
- de Rooij, N. K., Linn, F. H. H., vander Plas, J. A., Algra, A., Rinkel, G. J. E. Incidence of subarachnoid haemorrhage: a systematic review with emphasis on region, age, gender and time trends. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (12), 1365-1372 (2007).
- Feigin, V. L., Lawes, C. M., Bennett, D. A., Barker-Collo, S. L., Parag, V. Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies: a systematic review. The Lancet, Neurology. 8 (4), 355-369 (2009).
- Maher, M., Schweizer, T. A., Macdonald, R. L. Treatment of spontaneous subarachnoid hemorrhage: guidelines and gaps. Stroke. 51 (4), 1326-1332 (2020).
- Pickard, J. D., et al. Effect of oral nimodipine on cerebral infarction and outcome after subarachnoid haemorrhage: British aneurysm nimodipine trial. British Medical Journal (Clinical Research ed.). 298 (6674), 636-642 (1989).
- Daou, B. J., Koduri, S., Thompson, B. G., Chaudhary, N., Pandey, A. S. Clinical and experimental aspects of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. CNS Neuroscience and Therapeutics. 25 (10), 1096-1112 (2019).
- Fujii, M., et al. Early brain injury, an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research. Translational Stroke Research. 4 (4), 432-446 (2013).
- Roos, Y. B., et al. Complications and outcome in patients with aneurysmal subarachnoid haemorrhage: A prospective hospital based cohort study in the Netherlands. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 68 (3), 337-341 (2000).
- Vergouwen, M. D. I., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Brown, R. J., Kumar, A., Dhar, R., Sampson, T. R., Diringer, M. N. The relationship between delayed infarcts and angiographic vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 72 (5), 702-707 (2013).
- Dhar, R., et al. Relationship between angiographic vasospasm and regional hypoperfusion in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 43 (7), 1788-1794 (2012).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews. Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Svendgaard, N. -A. A new experimental model in rats for study of the pathophysiology of subarachnoid hemorrhage. Neuroreport. 13 (18), 2553-2556 (2002).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
- Prunell, G. F., et al. Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Cerebral blood flow and brain metabolism during the acute phase in three different models in the rat. Neurosurgery. 54 (2), 426-437 (2004).
- Velthuis, B. K., et al. Subarachnoid hemorrhage: Aneurysm detection and preoperative evaluation with CT angiography. Radiology. 208 (2), 423-430 (1998).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Inflammation in the brain after experimental subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 56 (5), 1082-1091 (2005).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Delayed cell death related to acute cerebral blood flow changes following subarachnoid hemorrhage in the rat brain. Journal of Neurosurgery. 102 (6), 1046-1054 (2005).
- Spray, S., Haanes, K. A., Edvinsson, L., Johansson, S. E. Subacute phase of subarachnoid haemorrhage in female rats: increased intracranial pressure, vascular changes and impaired sensorimotor function. Microvascular Research. 135, 104127 (2020).
- Ansar, S., Vikman, P., Nielsen, M., Edvinsson, L. Cerebrovascular ETB, 5-HT1B, and AT1 receptor upregulation correlates with reduction in regional CBF after subarachnoid hemorrhage. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), 3750-3758 (2007).
- Hansen-Schwartz, J., et al. Subarachnoid hemorrhage enhances endothelin receptor expression and function in rat cerebral arteries. Neurosurgery. 52 (5), 1188-1194 (2003).
- Hayman, E. G., Wessell, A., Gerzanich, V., Sheth, K. N., Simard, J. M. Mechanisms of global cerebral edema formation in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurocritical Care. 26 (2), 301-310 (2017).
- Miyata, H., et al. Vasa vasorum formation is associated with rupture of intracranial aneurysms. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2019).
- Tada, Y., et al. Roles of hypertension in the rupture of intracranial aneurysms. Stroke. 45 (2), 579-586 (2014).
- Nuki, Y., et al. Elastase-induced intracranial aneurysms in hypertensive mice. Hypertension. 54 (6), Dallas, Tex. 1337-1344 (1979).
- Marbacher, S., Wanderer, S., Strange, F., Grüter, B. E., Fandino, J. Saccular aneurysm models featuring growth and rupture: A systematic review. Brain Sciences. 10 (2), 101 (2020).
- Altay, O., et al. Isoflurane on brain inflammation. Neurobiology of Disease. 62, 365-371 (2014).
- Hockel, K., Trabold, R., Schöller, K., Török, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4 (1), 5 (2012).
- Kamp, M. A., et al. A Systematic and meta-analysis of mortality in experimental mouse models analyzing delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Translational Stroke Research. 8 (3), 206-219 (2017).
- Povlsen, G. K., Johansson, S. E., Larsen, C. C., Samraj, A. K., Edvinsson, L. Early events triggering delayed vasoconstrictor receptor upregulation and cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. BMC Neuroscience. 14, 34 (2013).
