Summary
Subarachnoïdale bloeding blijft een hoge last van mortaliteit en morbiditeit bij de mens met zich meebrengen. Om verder onderzoek naar de aandoening en de pathofysiologie ervan te vergemakkelijken, wordt een pre-chiasmatisch, enkelvoudig injectiemodel gepresenteerd.
Abstract
Ondanks de vooruitgang in de behandeling in de afgelopen decennia, blijft subarachnoïdale bloeding (SAH) een hoge last van morbiditeit en mortaliteit met zich meebrengen, grotendeels een vrij jonge bevolking treffend. Verschillende diermodellen van SAH zijn ontwikkeld om de pathofysiologische mechanismen achter SAH te onderzoeken en farmacologische interventies te testen. Het pre-chiasmatische, enkele injectiemodel bij de rat dat in dit artikel wordt gepresenteerd, is een experimenteel model van SAH met een vooraf bepaald bloedvolume. Kortom, het dier wordt verdoofd, geïntubeerd en onder mechanische ventilatie gehouden. De temperatuur wordt geregeld met een verwarmingskussen. Een katheter wordt in de staartslagader geplaatst, waardoor continue bloeddrukmeting en bloedafname mogelijk is. Het atlantooccipitale membraan wordt ingesneden en een katheter voor drukregistratie wordt in de cisterna magna geplaatst om intracerebrale drukmeting mogelijk te maken. Deze katheter kan ook worden gebruikt voor intrathecale therapeutische interventies. De rat wordt in een stereotaxisch frame geplaatst, een braamgat wordt anterieur naar de bregma geboord en een katheter wordt door het braamgat ingebracht en net voor het optische chiasma geplaatst. Autoloog bloed (0,3 ml) wordt uit de staartkatheter gehaald en handmatig geïnjecteerd. Dit resulteert in een stijging van de intracerebrale druk en een afname van de cerebrale bloedstroom. Het dier wordt gedurende 30 minuten verdoofd gehouden en krijgt onderhuidse zoutoplossing en pijnstillers. Het dier wordt geëxtubeerd en teruggebracht naar zijn kooi. Het pre-chiasmatische model heeft een hoge reproduceerbaarheidssnelheid en beperkte variatie tussen dieren vanwege het vooraf bepaalde bloedvolume. Het bootst SAH bij mensen na, waardoor het een relevant model is voor SAH-onderzoek.
Introduction
Niet-traumatische subarachnoïdale bloeding (SAH) is een vorm van beroerte, die ongeveer 5% van alle gevallen vertegenwoordigt. De meest voorkomende oorzaak van niet-traumatische SAH is de plotselinge breuk van een aneurysma (aSAH), dat goed is voor 85% van de SAHs. Andere oorzaken zijn de breuk van een arterio-veneuze malformatie, coagulopathieën en scheuring van aderen bij perimesencefale bloeding1. De incidentie is 9 per 100.000 persoonsjaren met sterfte rond een op de drie en nog eens een derde die de ondersteuning van het dagelijks leven nodig heeft na SAH 2,3.
Na de eerste stabilisatie en bevestiging van de diagnose hangt de behandeling af van de ernst van de bloeding. De zwaarst getroffen patiënten krijgen een extra-ventriculaire drain ingebracht in de ventrikels om de intracerebrale druk (ICP) te verminderen en worden opgenomen op de neurointensieve zorgafdeling, waar ze nauwlettend worden gevolgd. Patiënten zullen een angiografie ondergaan om het (waarschijnlijke) aneurysma te identificeren en daarna het aneurysma laten oprollen of knippen om rebloeding te voorkomen4. Ondanks talrijke onderzoeken naar farmacologische therapieën, heeft alleen nimodipine, een calciumkanaalantagonist, aangetoond de resultaten te verbeteren5. Meerdere klinische onderzoeken zijn momenteel aan de gang. Zie de review van Daou en collega's voor een uitgebreide lijst6.
De breuk van een aneurysma is beschreven als het plotselinge begin van de ergste hoofdpijn ooit ervaren of een donderslag hoofdpijn. De breuk resulteert in een sterke stijging van de ICP gevolgd door een vermindering van de cerebrale bloedstroom (CBF). Deze vermindering resulteert in globale ischemie van de hersenen, wat kan resulteren in een verlies van bewustzijn. Deze meer mechanistische route, samen met de geïnitieerde afbraak van de geëxtravaseerde elementen van bloed, geeft aanleiding tot cytokine-afgifte en activering van het aangeboren immuunsysteem, wat resulteert in steriele neuro-inflammatie. Bovendien wordt vaak afbraak van de bloed-hersenbarrière, resulterend in hersenoedeem en verstoring van de ionhomeostase, waargenomen. Al deze veranderingen en meer, bedacht vroeg hersenletsel (EBI), treden op binnen de eerste paar dagen en resulteren in neuronaal verlies en apoptose7.
Ongeveer 1/3 van de patiënten met aSAH zal tussen dag 4-14 8 vertraagde cerebrale ischemie (DCI)ontwikkelen. DCI wordt gedefinieerd als het debuut van een focale, neurologische stoornis of een daling van minimaal twee punten op de Glasgow-comaschaal die minimaal 1 uur duurt, wanneer andere oorzaken, waaronder epileptische aanvallen en herbloedingen, zijn uitgesloten. DCI is geassocieerd met een verhoogd risico op overlijden en verminderde functionele uitkomst na aSAH9. Cerebraal vasospasme (CVS), de vernauwing van de hersenslagaders, is al tientallen jaren bekend als geassocieerd met DCI en werd voorheen beschouwd als de enige reden voor DCI. Sindsdien is aangetoond dat CVS kan optreden zonder de ontwikkeling van DCI en meer factoren, waaronder microvasculaire trombose en vernauwing, corticale verspreidende depressie en een ontstekingsreactie van EBI zijn sindsdien geïdentificeerd10,11,12.
Vanwege de grote invloed van EBI en DCI op het verloop van de ziekte en de uitkomst van de getroffen patiënten, moeten diermodellen deze in de grootst mogelijke mate nabootsen, terwijl ze nog steeds reproduceerbaar zijn. Onderzoekers hebben een breed scala aan verschillende modellen gebruikt bij een verscheidenheid aan dieren, van muizen tot niet-menselijke primaten, om te proberen aSAH te simuleren. Sprague-Dawley en Wistar wildtype ratten zijn momenteel de meest gebruikte proefdieren, en de meest voorkomende modellen zijn het endovasculaire perforatiemodel, het cisterna-magna dubbele injectiemodel en ten slotte het pre-chiasmatische model met enkele injectie, dat in dit artikel13 zal worden beschreven.
Het pre-chiasmatische, enkele injectiemodel werd oorspronkelijk ontwikkeld door Prunell en collega's om enkele van de tekortkomingen van de andere experimentele modellen tegen te gaan14. De operatie, wanneer onder de knie, is zeer reproduceerbaar en minimaliseert variatie tussen dieren. Het model bootst SAH bij mensen op meerdere punten na, waaronder de plotselinge stijging van ICP na de injectie van bloed, resulterend in voorbijgaande globale ischemie als gevolg van een daling van de CBF15,16. Het beïnvloedt de voorste circulatie, waar de meeste aSAH bij mensen voorkomen17. De mortaliteit varieert van 10%-33% afhankelijk van het onderzoek en de hoeveelheid geïnjecteerd bloed14,18. Vertraagde celdood en neuro-inflammatie kunnen op dag 2 en 7 worden gedetecteerd en bieden daarmee variabelen om de gevolgen van EBI en DCI 19,20 te bestuderen.
De studie presenteert een bijgewerkte beschrijving van het pre-chiasmatische model voor één injectie bij de rat, samen met een beschrijving van hoe de ICP-sonde kan worden gebruikt als een poort voor intrathecale toediening van farmaceutische producten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure wordt uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijn 2010/63/EU van de Europese Unie betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en is goedgekeurd door de Deense inspectie voor dierproeven (licentienummer 2016-15-0201-00940). Chirurgie wordt uitgevoerd met behulp van aseptische techniek in de breedst mogelijke mate, met inbegrip van steriele instrumenten, handschoenen, katheters en hechtingen. De studie gebruikte mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 230-350 g, groep gehuisvest in een licht/ donkercyclus van 12 uur, met een constante temperatuur van 22 ° C (± 2 ° C) en een vochtigheid van 55% (± 10%). De dieren zijn voorzien van standaard chow en water ad libitum. De dieren worden na de operatie in enkele kooien gehuisvest, maar kunnen na de operatie worden teruggebracht naar de groepskooi wanneer de ICP-sonde is verwijderd. Het verdovingsmiddel in dit protocol is isofluraangas, maar een 1,5 ml / kg 3: 2 intraperitoneaal mengsel van ketamine (100 mg / ml) en xylazine (20 mg / ml) is ook effectief21.
1. Voorbereidingen
- Wijzig een 16 G perifere aderkatheter voor intubatie. Om te wijzigen, verkort u de naald met 1 cm en buigt u de resterende distale 1 cm bij 30° naar de injectieklep. Verwijder de kathetervleugels (meervoudig gebruik).
- Om een ICP-sonde te maken, snijdt u een stuk polytheenbuis van 20 mm (binnendiameter (ID): 0,58 mm, buitendiameter (OD): 0,96 mm) en brandt u het ene uiteinde om een cirkelvormige plaat te maken, waarbij u een open lumen houdt. Omzeil de polytheenslang met 1 mm siliconenslang (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm) voordat u 10 mm siliconenslang (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) aansluit op het uiteinde van de polyethyleenbuis.
- Schakel de laptop in en open de software voor gegevensverzameling. Kalibreer de bloeddruk (BP) en intra-cerebrale druk (ICP) transducers en de Laser-Doppler volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid het bloedgasanalysatorapparaat voor.
LET OP: Zorg ervoor dat er voldoende isofluraan in de vaporizer zit. - Zet de O2 en de atmosferische luchtstroom aan. Stel het debiet van O2 in op 30% en atmosferische lucht op 70%.
- Plaats het verwarmingskussen en stel de temperatuur in op 37 °C.
2. Anesthesie
- Plaats de rat in de anesthesiekamer met een stroom van 30% O2 en 70% atmosferische lucht. Dien 5% isofluraangas toe in de kamer. Adequate anesthesie duurt ongeveer 4 minuten. Controleer de ademhaling zorgvuldig.
- Wanneer verdoofd, plaats de rat in rugligging op een zware plaat omzeild door een elastiekje. Plaats de voortanden van de rat onder het elastiekje.
- Trek de tong voorzichtig naar buiten met een gebogen tang. Maak het strottenhoofd schoon met een wattenstaafje. Plaats een extern licht in de middellijn van de keel om de stembanden te visualiseren.
- Intubate tijdens inspiratie met behulp van de gemodificeerde 16 G perifere aderkatheter. Wanneer correct geplaatst, verwijdert u de stiletto. Sluit de katheter aan op de beademingsmachine.
OPMERKING: De juiste plaatsing van de buis wordt bevestigd door borstbewegingen die synchroon lopen met de ademhalingsfrequentie. Als bewegingen van de buik worden gezien, extubeer en herintroduceer de rat in de anesthesiebel. Herhaal de procedure niet meer dan drie keer vanwege het risico op beschadiging van de luchtwegen. - Houd het dier bij intubatie op kunstmatige beademing met 30% O2 en 70% atmosferische lucht. Handhaaf de anesthesie op 1,5% -3% van isofluraan. Pas de isofluraan aan om de bloeddruk tussen de 80-100 mmHg te houden.
- Houd het inspiratoire volume van het gasmasker op 3 ml en de frequentie op 40-45 inspiratie/min. Pas het inspiratoire volume aan volgens de bloedgasanalyse.
- Maak een steek door het binnenste zachte weefsel van de wang met een 2-0 hechting. Bind de hechting rond de injectiebuis en de injectieklep van de perifere aderkatheter om de katheter vast te maken.
- Verplaats de rat naar het operatieveld en plaats hem in rugligging met de staart naar de chirurg gericht.
- Breng de ooggel aan wanneer dat nodig is om droge ogen tegen te gaan.
- Voer een teenknijp uit om een voldoende diepte van anesthesie te bevestigen. Beoordeel en behoud de anesthesiediepte tijdens de operatie.
3. Staartkatheter
- Desinfecteer de proximale 3-4 cm van de staart met 0,5% chloorhexidine-ethanol.
OPMERKING: Gebruik vanaf nu de chirurgische microscoop naar goeddunken van de chirurg. - Maak een huidincisie van 15-20 mm in het proximale uiteinde van de staart aan de ventrale kant. Pas op dat u de slagader niet insnijdt.
- Maak de huid los van het onderliggende bindweefsel met behulp van een gebogen tang.
- Dring voorzichtig door de fascia en leg de slagader bloot.
- Laat de staartslagader voorzichtig los van het onderliggende weefsel met behulp van een gebogen tang.
- Schuif drie zwarte zijden draden onder het vat. Plaats een draad zo distaal mogelijk en bind een chirurgische knoop strak om de slagader. Houd de losse uiteinden van de draad vast met een hemostat.
- Bind de twee resterende draden losjes rond de slagader.
- Duw de proximale draad zo proximaal mogelijk. Breng een hemostat aan om de uiteinden van de proximale draad vast te houden. Trek de hemostat licht, maar genoeg om de bloedstroom te beperken en te blokkeren. Plaats de hemostat op de buik.
- Snijd de punt van de katheter in een hoek van 45°. Knip de scherpe punt om penetratie van de arteriële wand te voorkomen.
- Maak met behulp van een Vannas-schaar een slagaderincisie 1/3 van de diameter van de slagader in een hoek van 30°, 3-5 mm van de distale knoop.
- Breng de katheter in de slagader in met behulp van twee rechte tangen. Gebruik één tang om de katheter vast te houden en de andere om de slagader voorzichtig over de katheter te trekken.
- Breng de katheter in het vat naar de proximale knoop en maak de knoop los van de hemostat. Visualiseer de bloedstroom in de katheter. Bevestig de middelste draad losjes aan de katheter.
- Ga door met het inbrengen naar, en indien mogelijk, net voorbij het punt waar de slagader weer bedekt is met fascia.
- Controleer de plaatsing van de katheter en eventuele lekkage door te spoelen met zoutoplossing.
- Bevestig de twee proximale draden met behulp van chirurgische knopen.
OPMERKING: De bloeddrukmeting moet pulseerbaar zijn; Zo niet, dan is de katheter niet goed geplaatst. - Bevestig de katheter aan het einde van de incisie door een chirurgische knoop te binden met behulp van de distale draad.
- Hecht de huidincisie losjes aan elkaar met twee niet-resorbeerbare monofilament 4-0 hechtingen. Zorg ervoor dat u de katheter niet binnendringt.
OPMERKING: Houd tijdens de operatie rekening met de amplitude van pulsatie. Als dit laag is, spoelt u de katheter met een zoutoplossing. - Maak de arteriële katheter los van de drukomvormer om de bloedstroom voor bloedgasbemonstering mogelijk te maken. Plaats een microcapillair buisje aan het einde van de katheter. Laat het bloed in de buis stromen. Bevestig de katheter opnieuw aan de transducer na bloedafname en spoel de katheter door.
- Plaats de capillaire buis in de bloedgasanalysator. Meet de pH, pCO2 en pO2 en noteer ze
OPMERKING: Afhankelijk van de bloedgas- en bloeddrukwaarden, wijzigt u de beademingssnelheid. Als de gemiddelde arteriële druk (MAP) te laag is, probeer dan het debiet van isofluraan te verlagen. Test de reflexen om de juiste diepte van de anesthesie te garanderen.
4. ICP-sonde
- Plaats de rat in het stereotaxische frame. Het is belangrijk om de rat symmetrisch te positioneren.
- Plaats een cilindrisch kussen onder het stereotaxische frame om voorste flexie van de nek te creëren.
- Scheer de hoofdhuid, nek en het gebied achter de oren van de rat. Verwijder het overtollige haar.
- Desinfecteer het gebied met 0,5% chloorhexidine-ethanol.
- Verdoof lokaal met 0,7 ml 10 mg/5 μg/ml lidocaïne met adrenaline, steek de naald in het caudale uiteinde van de schedel in de middellijn. Injecteer in de musculatuur van de nek met 0,3-0,4 ml. Injecteer de rest subcutaan rond en vooraan aan de bregma.
- Maak een huidincisie van de naaldpunctie ~ 8 mm caudaal in de middellijn.
- Ontleed alle spieren botweg in lagen om het atlantooccipitale membraan te identificeren (marmerkleurige driehoek caudaal naar de schedel in de middellijn).
- Gebruik de Alm retractor om de nekmusculatuur in bedwang te houden. Plaats het oprolmechanisme indien nodig caudaal.
- Controleer of de steriele ICP-sonde is aangesloten op de ICP-transducer. Spoel de ICP-sonde met zoutoplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de ICP-sonde.
- Insnijd het atlantooccipitale membraan met een naald van 23 G. Maak een gat om de ICP-sonde door het membraan te halen.
- Coax de sonde voorzichtig door het atlantooccipitale membraan. Trek de sonde lichtjes en zorg ervoor dat deze een pulserende curve vertoont tussen 0-5 mmHg. Zo niet, verwijder dan de sonde, controleer de verbinding met de transducer en bevestig de stroom door het lumen.
- Breng twee druppels van de weefsellijm aan. Beweeg de siliconenslang van 1 mm naar voren naar het membraan en breng extra lijm aan om het risico op verplaatsing van de ICP-sonde te minimaliseren.
- Verwijder de oprolmechanisme(s).
- Maak een horizontale matrashechting aan het cefalische uiteinde van de incisie en een eenvoudige onderbroken hechting aan het caudale uiteinde met behulp van een niet-resorbeerbare monofilament 4-0 hechting.
5. Plaatsing van de naald en de Laser-Doppler sonde
- Maak een incisie in de middellijn net voor de ogen, 15 mm caudaal.
- Verwijder het bindweefsel en de spieren met een tang. Gebruik het uiteinde van een steriel wattenstaafje als een rougine waardoor het mogelijk is om de bregma en de coronale hechtingen te identificeren.
- Plaats het Alm-oprolmechanisme.
- Plaats een spinale naald van 25 G in het stereotaxische frame. Plaats de naald precies op de bregma en noteer de positie.
OPMERKING: Plaats het middellijngewricht van het stereotaxische frame op 30° in de richting van het dier in het verticale vlak. - Verwijder de naald van de bregma, beweeg het frame 65 mm naar voren en vervang vervolgens de naald in de middellijn om de boorplaats te markeren.
- Boor totdat de dura mater onder het bot is geïdentificeerd. Verwijder voorzichtig de botfragmenten met een rechte tang en vul de holte met botwas.
- Boor nog een gat 3-4 mm lateraal rechts van de bregma en net voor de coronale hechting voor de Laser-Doppler. Het is niet nodig om helemaal door het bot te boren. Pas op dat je niet doordringt in de dura mater.
- Zoek naar de vaten waar de laser-doppler de bloedstroom kan meten. Plaats de laserdoppler en controleer de waarden. Een minimumwaarde van 100 FU is vereist. Verwijder de microscoop (kunstlicht).
- Als de waarden nog steeds acceptabel zijn, voegt u één druppel lijm toe om de sonde te fixeren.
- Controleer opnieuw of de waarde hoger is dan 80 FU. Als de waarde lager is dan 80 FU, verwijdert u de sonde en verplaatst u deze om een waarde boven 80 FU te bereiken.
OPMERKING: De waarde, FU, is een willekeurige eenheid die de cerebrale bloedstroom (CBF) weergeeft.
6. Inductie van SAH
- Steek de naald voorzichtig door de schedel in de middellijn tussen de hemisferen totdat de weerstand van de schedelbasis wordt gevoeld. Trek de naald 1 mm in om te zorgen voor een juiste plaatsing net voor de deur van het optische chiasma.
- Draai de naald 90° met de klok mee zodat de naaldpunt naar rechts wijst om het meest homogene resultaat te garanderen bij het injecteren van het bloed. Verwijder de stiletto (figuur 3).
- Evenwicht gedurende 15 minuten en pas het niveau van anesthesie aan om een gemiddelde arteriële bloeddruk te verkrijgen in het bereik van 80-100 mmHg.
- Voer een bloedgasanalyse uit. Pas het niveau van anesthesie dienovereenkomstig aan.
- Zuig 500 μL bloed op uit de staartkatheter met behulp van een spuit van 1 ml met een stompe naald van 23 G.
- Vul de dode ruimte van de spinale naaldkamer met bloed om injectie van lucht te voorkomen. Verwijder de naald van 23 G uit de met bloed gevulde spuit en controleer of de spuit 300 μl bloed bevat.
- Sluit de spuit aan op de spinale naald. Pak het stevig vast en injecteer het bloed handmatig om MAP te overtreffen.
- Observeer een steile stijging van ICP en een steile daling van CBF op de laptop.
OPMERKING: CBF moet 50% of lager zijn in vergelijking met de basislijnscore gedurende ten minste 5 minuten om de operatie succesvol te laten zijn, zie figuur 4. Schijnratten ondergaan de stappen 6.1-6.7 niet, waardoor de introductie van de spinale naald in het cerebrum wordt weggelaten, waardoor mogelijke spontane bloeding en iatrogene hersenbeschadiging worden geminimaliseerd.
7. Herstel en ontwaken
- Dien 0,1 ml/100 g dierlijk gewicht van 5,0 mg/ml carprofen en 1 ml/100 g dierlijk gewicht van isotone zoutoplossing subcutaan toe. Zorg ervoor dat de vloeistoffen ten minste op kamertemperatuur zijn voordat u ze toedient.
- Houd de rat vervolgens 30 minuten na de SAH onder narcose.
- Verwijder de naald, de laserdopplersonde en vul vervolgens de holtes met botwas. Sluit de incisie met behulp van twee horizontale matrashechtingen met niet-resorbeerbare monofilament 4-0 hechtdraad.
- Om de ICP-sonde te gebruiken voor injecties in de cisterna magna, verwijdert u de siliconenslang en plaatst u een pinpoint-adapter in de polyethyleenbuis.
- Als er geen interventie is gepland, snijdt u de eenvoudige, onderbroken hechting. Kort de ICP-sonde zoveel mogelijk in met een schaar en lijm vervolgens het uiteinde om lekkage van hersenvocht (CSF) te voorkomen. Sluit de incisie met een niet-absorbeerbare monofilament 4-0 hechting.
- Verwijder de rat uit het stereotaxische frame en plaats in rugligging. Verwijder de losse hechtingen uit de staartincisie.
- Plaats een enkele hechting proximaal en diep op de arteriële katheter. Verwijder de katheter en bind de hechtdraad vast om bloedingen te voorkomen. Hecht de staartincisie met een niet-absorbeerbare monofilament 4-0 hechting.
- Schakel de isofluraan uit.
- Maak de rat en zijn vacht zoveel mogelijk schoon.
- Wanneer de terugtrekkingsreflex van het pedaal is herwonnen en de rat spontane ademhaling heeft wanneer deze wordt losgekoppeld van de ventilator, extubeer deze dan.
- Plaats de rat in een enkele kooi met voedsel en water ad libitum. Plaats de ene helft van de kooi onder een verwarmingsplaat en plaats de rat in dit deel van de kooi.
- Voer intrathecale toediening uit door de pinport-injector aan te passen aan een precisiespuit en de behandeling toe te dienen via de pinportadapter. Deze ingreep is haalbaar bij dieren die wakker zijn. Zie figuur 5.
8. ICP-sonde verwijderen (indien niet verwijderd tijdens de operatie)
OPMERKING: Gebruik een chirurgische microscoop naar goeddunken van de chirurg.
- Plaats de rat in de anesthesiekamer zoals eerder beschreven.
- Wanneer verdoofd, plaats de rat in rugligging in het operatieveld met verwarmingskussen.
- Plaats de neus in het anesthesiemasker. Stel de niveaus van O 2 in op 30%, atmosferische lucht op 70% en isofluraan op2 %.
- Breng de ooggel continu aan om droge ogen tegen te gaan.
- Snijd de caudale eenvoudige onderbroken hechting. Open de incisie en verwijder het mogelijke necrotische weefsel of bloedstolsels.
- Kort de ICP-sonde zoveel mogelijk in met een schaar en lijm het uiteinde om het lekken van hersenvocht (CSF) te voorkomen. Sluit de incisie met een niet-absorbeerbare monofilament 4-0 hechting.
- Schakel de isofluraan uit.
- Wanneer de rat begint te bewegen, plaats hem dan in een enkele kooi met voedsel en water ad libitum. Plaats de ene helft van de kooi over een verwarmingsplaat en plaats de rat in dit gebied.
- Wanneer u terugkeert naar de gebruikelijke toestand, herintroduceert u de dieren aan elkaar in een gezamenlijke kooi onder toezicht gedurende de eerste 15 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vrouwen hebben een verhoogd risico op aSAH in vergelijking met mannen. Desondanks worden mannelijke knaagdieren voornamelijk gebruikt in experimenten vanwege mogelijke vertekening van heterogeniteit van de oestruscyclus bij vrouwen. De representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd, zijn afkomstig van een recente publicatie waarin vrouwelijke en mannelijke ratten worden vergeleken, wat bevestigt dat het model vergelijkbare resultaten oplevert bij vrouwelijke dieren in vergelijking met mannelijke21. De studie omvatte 34 vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (18 SAHs en 16 shams). Shams liet de spinale naald niet afdalen naar het optische chiasme of bloed injecteren. Alle andere procedures werden uitgevoerd op Shams die identiek waren aan SAHs. Alle fysiologische parameters tussen groepen waren vergelijkbaar. Ten slotte werd een meta-analyse van gegevens van eerdere experimenten op de mannelijke ratten gedaan en vergeleken met de resultaten van de huidige studie21.
De roterende pooltest is een test van de grove sensomotorische functie. Het dier wordt op het ene uiteinde van een paal van 150 cm bij 45 mm geplaatst, die tot 10 tpm kan draaien. Het doel is om het uiteinde van de paal te bereiken waar een kooi wordt geplaatst. SAH-ratten deden het significant slechter op dag 1 en 2, vergeleken met schijndieren op de roterende paal (figuur 1).
Na SAH worden zowel de ET-1- als de 5-HT-receptorfamilie in de hersenslagaders geupreguleerd, wat resulteert in een verhoogde contractie wanneer gestimuleerd en daardoor bijdraagt aan CVS22,23. De basilaire slagader (BA) en middelste hersenslagaders (MCA) werden na onthoofding verwijderd en gebruikt voor myograafexperimenten. Zowel endotheline 1 (ET-1), een agonist voor de ET-1 receptorfamilie als 5-carboxamidotryptamine (5-CT), een agonist voor de 5-HT-receptorfamilie, produceerden significant verhoogde vasculaire contractie in SAH in vergelijking met sham (figuur 2). Gevoeligheid kan worden waargenomen door de lagere concentraties die nodig zijn om contractie na SAH bij beide geslachten uit te lokken.
Verhoogd watergehalte (oedeem) na SAH is een maat voor verminderde functionele uitkomst bij mensen24. Significant verhoogd hersenoedeem werd gevonden in SAH in vergelijking met sham op dag 2. Er was ook een tendens naar verhoogd oedeem in de hippocampus, maar dit was niet statistisch significant (p = 0,0508)21.
Bij het vergelijken van de bovengenoemde gegevens met historische mannelijke gegevens, zijn de resultaten vergelijkbaar. De metadata tonen een verhoogde contractiliteit bij mannelijke SAHs na toevoeging van ET-1 of 5-CT (figuur 2). Bovendien presteerden de SAH-ratten significant slechter in vergelijking met shams bij het uitvoeren van de roterende pooltest. Het resultaat duidde op een verminderde sensomotorische functie (figuur 1).
Figuur 5A toont de verdeling van het autologe, geïnjecteerde bloed na zoutoplossingperfusie 30 min na inductie van de SAH. De figuur laat zien dat het bloed is verdeeld in de subarachnoïdale ruimte na pre-chiasmatische injectie.
Figuur 5B en figuur 5C tonen de verdeling van intrathecaal geïnjecteerde kleurstoffen, gevolgd door perfusie van zoutoplossing voor het hele lichaam gedurende 30 minuten na de injectie. Figuur 5B toont de verdeling van 25 μL van 20 mM Evans Blue (in water oplosbaar) en Figuur 5C toont de verdeling van 25 μL van 10 mM Oil Red O (onoplosbaar in water). Beide kleurstoffen bleken te worden verdeeld in de subarachnoïdale ruimte na de injectie in de cisterna magna, wat bevestigt dat dit een haalbaar model is van intrathecale injectie van zowel in water oplosbare als onoplosbare verbindingen. Vermeldenswaard is de vorming van afzettingen rond de slagaders voor de in water onoplosbare verbinding.
Figuur 1: Analyse van sensorisch-motorische cognitie in de eerste 2 dagen na SAH bij mannelijke en vrouwelijke ratten. Roterende paaltest werd uitgevoerd op dag 1 en dag 2 na SAH. Ratten van beide geslachten hadden aanzienlijke tekorten in vergelijking met schijnratten van hetzelfde geslacht. Statistische verschillen in gedrag tussen groepen werden getest door 2-weg ANOVA op dag 0, dag 1 en dag 2. Vrouw geen rotatie en 3 rpm: p < 0,05. Vrouwelijke 10 rpm en alle mannelijke gegevens: p < 0,01. Waarden zijn middelen ± SEM. Opnieuw gepubliceerd met toestemming van Spray, S. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van verhoogde gevoeligheid voor ET-1 en 5-CT geïnduceerde contracties in de basilaire slagader (BA) en middelste hersenslagader (MCA) 2 dagen na SAH bij mannelijke en vrouwelijke ratten . (A,B) 60 mM K+-opgewekte (K+max) contractiele responsen werden gebruikt als referentiewaarden voor normalisatie van agonist-geïnduceerde responsen. De gevoeligheid voor ET-1 was 2 dagen na SAH significant verhoogd in vergelijking met schijnratten van hetzelfde geslacht in zowel de BA als de MCA. (C,D) De gevoeligheid voor 5-CT was 2 dagen na SAH significant verhoogd in vergelijking met schijn-geopereerde ratten van hetzelfde geslacht in zowel de BA als MCA. De concentratie-responscurven werden statistisch vergeleken met tweerichtings-ANOVA. Alle gegevens: p < 0,001. Waarden zijn middelen ± SEM. Opnieuw gepubliceerd met toestemming van Spray, S. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Overzicht van de opstelling vóór inductie van SAH. Merk vanaf de bovenkant van de afbeelding op dat de 1) injectienaald, 2) laser-Doppler-sonde en 3) de ICP-sonde allemaal op hun plaats zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Monsterspoor na intrathecale injectie. De rode grafiek toont de bloeddruk in mmHg. De blauwe grafiek toont de ICP in mmHg en de groene grafiek toont de CBF in de willekeurige eenheid FU. De piek in ICP is het gevolg van bloedinjectie. Merk op dat dit resulteert in een daling van het CBF > 50% van de basislijn gedurende meer dan 5 minuten. De ICP-stijging resulteert bovendien in een kleine stijging van de bloeddruk die binnen enkele seconden normaliseert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verdeling van intrathecaal geïnjecteerd bloed en gekleurde kleurstoffen. (A) Verdeling van autoloog bloed 30 min na SAH-inductie. (B) Distributie van 25 μL 20 mM Evans Blue na intrathecale injectie via ICP-katheter. (C) Distributie van 25 μL 10 mM Oil Red O na intrathecale injectie via ICP-katheter. Alle dieren werden verdoofd met een intraperitoneaal ketamine/xylazine mengsel gevolgd door zoutoplossing perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het pre-chiasmatische single injection model van SAH bootst verschillende belangrijke elementen van menselijke SAH na, waaronder de piek in ICP, reductie van CBF, voorbijgaande globale ischemie, upregulatie van neuro-inflammatoire markers en CVS 14,15,16,18,19,20. De ICP-sonde werd ook gebruikt als poort voor intrathecale toediening (figuur 5). Verder blijkt uit het onderzoek dat het model op vergelijkbare wijze presteert bij mannelijke en vrouwelijke dieren21. Het model omvat niet de ontwikkeling van en de daaropvolgende breuk van een aneurysma. Een reeks modellen heeft geprobeerd SAH te produceren uit een gescheurd aneurysma door inductie van systemische hypertensie, hetzij chirurgisch of farmacologisch en door de arteriële wand te verzwakken met behulp van elastase25,26,27. Alle pogingen hebben aneurysmale SAH geproduceerd in een subset van dieren, maar deze modellen hebben een inherente variabiliteit, waaronder het onvermogen om te voorspellen wanneer het aneurysma zal scheuren. De modellen zijn niet erg geschikt voor preklinisch onderzoek naar SAH18,28.
Onder andere murine, SAH-modellen, omvat het endovasculaire perforatiemodel de breuk van een vat, enigszins nabootsend de breuk van een aneurysma, maar vatbaar voor hoge variabiliteit en mortaliteit. Het hier beschreven model is beter traceerbaar en beter reproduceerbaar omdat het bloedvolume vooraf is bepaald en de injectiedruk kan worden gecontroleerd. Het model met dubbele injectie heeft een grotere kans op het produceren van vertraagde CVS, maar beïnvloedt voornamelijk de posterieure circulatie en omvat een onfysiologische tweede bloedinjectie. Ter vergelijking: dit model lijkt op SAH bij mensen omdat het een enkele injectie van de voorste circulatie is en het een reproduceerbare ICP-stijging produceert18.
De invloed van verschillende anesthesieregimes op experimentele SAH is onduidelijk en de experimentele gegevens zijn tegenstrijdig. Eén studie rapporteerde mogelijke remming van cytokines en algemene neuro-inflammatie in een endovasculaire perforatiemodel bij muizen bij gebruik van isofluraaninhalaties29. Een ander knaagdiermodel resulteerde in verminderde ademhalingsparameters en verhoogd hersenoedeem samen met verminderde regionale CBF bij gebruik van isofluranen30. Een meta-analyse waarin de mortaliteit in muismodellen werd vergeleken, toonde echter geen verschil in mortaliteit tussen isofluraan en andere soorten anesthesie31. In overeenstemming is het bovenstaande protocol met succes isofluraaninhalatie of een intraperitoneaal ketamine / xylazine-mengsel gebruikt met vergelijkbare resultaten in beide groepen21.
Om een hoge reproduceerbaarheid en een goede gegevensverzameling te garanderen, ligt de algemene nadruk op de stappen met betrekking tot de plaatsing van de bewakingsapparatuur. De juiste plaatsing van de staartkatheter vergemakkelijkt een continue controle van de bloeddruk en de mogelijkheid om bloedgasanalyses uit te voeren. Een juiste plaatsing van de ICP-katheter zorgt voor een correcte ICP-monitoring en de daaropvolgende mogelijkheid van intrathecale interventie. De juiste plaatsing van de Laser-Doppler-sonde zorgt ervoor dat de reductie van CBF kan worden bewaakt, waarbij een vermindering van 50% of lager van de baselinescore gedurende ten minste 5 minuten na SAH-inductie zorgt voor een sterke ischemie32. Door ervoor te zorgen dat alle monitoringstappen in orde zijn, kan de onderzoeker zorgen voor een correcte gegevensverzameling na de SAH-inductie.
Het protocol beschrijft het pre-chiasmatische enkelvoudige injectiemodel van subarachnoïdale bloeding met updates en modificatie. Het model is waardevol geweest voor SAH-onderzoek en zal waarschijnlijk blijven bijdragen aan een beter begrip van subarachnoïdale bloedingen, inclusief vroeg hersenletsel en vertraagde cerebrale ischemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te melden.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door de Lundbeck Foundation en de Lundbeck Grant of Excellence (nr. R59-A5404). Financiers hadden geen rol in enig deel van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G peripheral vein catheter | BD Venflon | 393229 | Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed |
| Anesthesia bell/ chamber | Unknown | ||
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL80 | |
| Blood pressure (BP) monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Curved forceps, 12 cm x 3 | F.S.T | 11001-12 | For anesthesia |
| Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm | Homemade | Made from surgical towels | |
| Data acquisition hardware | Adinstruments | ML870 Powerlab | |
| Data acquistion software | Adinstruments | LabChart 6.0 | |
| Drill | KMD | 1189 | |
| Drill controller | Silfradent | 300 IN | |
| Flexible light | Schott | KL200 | |
| Heating pad | Minco | 1135 | |
| Hypodermic needle, 20 G | KD Medical | 301300 | Connects to stereotaxic frame |
| ICP monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | TEC3 | |
| Laptop | Lenovo | T410 | |
| Laser doppler monitor | Adinstruments | ML191 | |
| Laser doppler probe | Oxford Optronics | MSF100XP | Connects to laser doppler monitor |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | For anesthesia |
| Precision syringe, 0.025 mL | Hamilton | 547407 | |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | M900 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss | F170 | |
| Suture needle | Allgaier | 1245 | For anesthesia |
| Temperaure controller | CWE,INC. | TC-1000 | |
| Transducer x 2 | Adinstruments | MLT0699 | Connects to BP and ICP monitor |
| Ventilator | Ugo Basile | 7025 | |
| Veterinary clipper | Aesculap | GT421 | |
| 3-pronged Blair retractor, 13.5 cm | Agnthos | 17022--13 | |
| Blunt Alm retractor | F.S.T | 17008-07 | |
| Curved forceps, 12 cm x 2 | F.S.T | 11001-12 | |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | |
| Straight Dumont forceps, 11 cm | F.S.T | 11252-00 | |
| Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2 | F.S.T | 13008-12 | |
| Straight Iris scissor, 9 cm | F.S.T | 14090-09 | |
| Straight Vannas scissor, 10.5 cm | F.S.T | 15018-10 | |
| Absorpable swabs | Kettenbach | 31603 | |
| Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm | Vömel | 14757 | |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | |
| Carbomer eye gel 2 mg/g | Paranova | ||
| Cotton swab | Heinz Herenz | WA-1 | |
| Cotton tipped applicator x 4 | Selefa | 120788 | |
| Hypodermic needle, 23 G x2 | KD Medical | 900284 | Connects to stopcock. Remove distal end |
| Hypodermic needle, 23 G x3 | KD Medical | 900284 | Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe |
| ICP probe: | Homemade | Made of the following: | |
| Polythene tubing, 20 mm | Smiths medical | 800/100/200 | Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm. |
| Silicone tubing, 10 mm | Fisher | 15202710 | ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm. |
| Silicone tubing, 2 mm | Fisher | 11716513 | ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm. |
| Micro hematocrit tubes | Brand | 7493 11 | |
| OP-towel, 45 cm x75 cm | Mölnlycke | 800430 | |
| PinPort adapter, 22 G | Instech | PNP3F22 | |
| PinPort injector | Instech | PNP3M | |
| Polythene tubing, 2 x 20 cm | Smiths medical | 800/100/200 | Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm. |
| Rubberband | Unknown | ||
| Scalpel, 10 blade | Kiato | 23110 | |
| Spinalneedle, 25 G x 3.5'' | Braun | 5405905-01 | |
| Stopcock system, Discofix x 2 | Braun | 16494C | Connects to transducer |
| Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3 | Ethicon | EH7145H | |
| Syringe, 1 mL | BD Plastipak | 1710023 | |
| Syringe, luer-lock, 10 mL x 4 | BD Plastipak | 305959 | Connects to transducer |
| Tissue adhesive glue | 3M | 1469SB | |
| 0.5% Chlorhexidine spirit | Faaborg Pharma | 210918 | |
| Carprofen 50 mg/mL | ScanVet | 43715 | Diluted 1:10 |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isotonic saline | Amgros | 16404 | |
| Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL | Amgros | 16318 |
References
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), London, England. 306-318 (2007).
- de Rooij, N. K., Linn, F. H. H., vander Plas, J. A., Algra, A., Rinkel, G. J. E. Incidence of subarachnoid haemorrhage: a systematic review with emphasis on region, age, gender and time trends. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (12), 1365-1372 (2007).
- Feigin, V. L., Lawes, C. M., Bennett, D. A., Barker-Collo, S. L., Parag, V. Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies: a systematic review. The Lancet, Neurology. 8 (4), 355-369 (2009).
- Maher, M., Schweizer, T. A., Macdonald, R. L. Treatment of spontaneous subarachnoid hemorrhage: guidelines and gaps. Stroke. 51 (4), 1326-1332 (2020).
- Pickard, J. D., et al. Effect of oral nimodipine on cerebral infarction and outcome after subarachnoid haemorrhage: British aneurysm nimodipine trial. British Medical Journal (Clinical Research ed.). 298 (6674), 636-642 (1989).
- Daou, B. J., Koduri, S., Thompson, B. G., Chaudhary, N., Pandey, A. S. Clinical and experimental aspects of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. CNS Neuroscience and Therapeutics. 25 (10), 1096-1112 (2019).
- Fujii, M., et al. Early brain injury, an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research. Translational Stroke Research. 4 (4), 432-446 (2013).
- Roos, Y. B., et al. Complications and outcome in patients with aneurysmal subarachnoid haemorrhage: A prospective hospital based cohort study in the Netherlands. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 68 (3), 337-341 (2000).
- Vergouwen, M. D. I., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Brown, R. J., Kumar, A., Dhar, R., Sampson, T. R., Diringer, M. N. The relationship between delayed infarcts and angiographic vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 72 (5), 702-707 (2013).
- Dhar, R., et al. Relationship between angiographic vasospasm and regional hypoperfusion in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 43 (7), 1788-1794 (2012).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews. Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Svendgaard, N. -A. A new experimental model in rats for study of the pathophysiology of subarachnoid hemorrhage. Neuroreport. 13 (18), 2553-2556 (2002).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
- Prunell, G. F., et al. Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Cerebral blood flow and brain metabolism during the acute phase in three different models in the rat. Neurosurgery. 54 (2), 426-437 (2004).
- Velthuis, B. K., et al. Subarachnoid hemorrhage: Aneurysm detection and preoperative evaluation with CT angiography. Radiology. 208 (2), 423-430 (1998).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Inflammation in the brain after experimental subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 56 (5), 1082-1091 (2005).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Delayed cell death related to acute cerebral blood flow changes following subarachnoid hemorrhage in the rat brain. Journal of Neurosurgery. 102 (6), 1046-1054 (2005).
- Spray, S., Haanes, K. A., Edvinsson, L., Johansson, S. E. Subacute phase of subarachnoid haemorrhage in female rats: increased intracranial pressure, vascular changes and impaired sensorimotor function. Microvascular Research. 135, 104127 (2020).
- Ansar, S., Vikman, P., Nielsen, M., Edvinsson, L. Cerebrovascular ETB, 5-HT1B, and AT1 receptor upregulation correlates with reduction in regional CBF after subarachnoid hemorrhage. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), 3750-3758 (2007).
- Hansen-Schwartz, J., et al. Subarachnoid hemorrhage enhances endothelin receptor expression and function in rat cerebral arteries. Neurosurgery. 52 (5), 1188-1194 (2003).
- Hayman, E. G., Wessell, A., Gerzanich, V., Sheth, K. N., Simard, J. M. Mechanisms of global cerebral edema formation in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurocritical Care. 26 (2), 301-310 (2017).
- Miyata, H., et al. Vasa vasorum formation is associated with rupture of intracranial aneurysms. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2019).
- Tada, Y., et al. Roles of hypertension in the rupture of intracranial aneurysms. Stroke. 45 (2), 579-586 (2014).
- Nuki, Y., et al. Elastase-induced intracranial aneurysms in hypertensive mice. Hypertension. 54 (6), Dallas, Tex. 1337-1344 (1979).
- Marbacher, S., Wanderer, S., Strange, F., Grüter, B. E., Fandino, J. Saccular aneurysm models featuring growth and rupture: A systematic review. Brain Sciences. 10 (2), 101 (2020).
- Altay, O., et al. Isoflurane on brain inflammation. Neurobiology of Disease. 62, 365-371 (2014).
- Hockel, K., Trabold, R., Schöller, K., Török, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4 (1), 5 (2012).
- Kamp, M. A., et al. A Systematic and meta-analysis of mortality in experimental mouse models analyzing delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Translational Stroke Research. 8 (3), 206-219 (2017).
- Povlsen, G. K., Johansson, S. E., Larsen, C. C., Samraj, A. K., Edvinsson, L. Early events triggering delayed vasoconstrictor receptor upregulation and cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. BMC Neuroscience. 14, 34 (2013).
