Summary
Subaraknoidalblødning fortsetter å bære en høy byrde av dødelighet og sykelighet hos mennesker. For å lette videre forskning på tilstanden og dens patofysiologi, presenteres en pre-chiasmatisk, enkeltinjeksjonsmodell.
Abstract
Til tross for fremskritt i behandlingen de siste tiårene, fortsetter subaraknoidalblødning (SAH) å bære en høy byrde av sykelighet og dødelighet, i stor grad plager en ganske ung befolkning. Flere dyremodeller av SAH er utviklet for å undersøke de patofysiologiske mekanismene bak SAH og for å teste farmakologiske inngrep. Den pre-chiasmatiske, enkeltinjeksjonsmodellen i rotte presentert i denne artikkelen er en eksperimentell modell av SAH med et forhåndsbestemt blodvolum. Kort fortalt blir dyret bedøvet, intubert og holdt under mekanisk ventilasjon. Temperaturen reguleres med en varmepute. Et kateter er plassert i halearterien, noe som muliggjør kontinuerlig blodtrykksmåling samt blodprøvetaking. Den atlantooccipitale membranen snittes og et kateter for trykkregistrering plasseres i cisterna magna for å muliggjøre intracerebral trykkmåling. Dette kateteret kan også brukes til intratekale terapeutiske inngrep. Rotta er plassert i en stereotaktisk ramme, et burrhull bores fremre for bregma, og et kateter settes inn gjennom burrhullet og plasseres like foran den optiske chiasmen. Autologt blod (0,3 ml) trekkes ut av halekateteret og injiseres manuelt. Dette resulterer i en økning av intracerebral trykk og en reduksjon av cerebral blodstrøm. Dyret holdes bedøvet i 30 min og gis subkutan saltvann og smertestillende midler. Dyret er ekstubert og returnert til buret. Den pre-chiasmatiske modellen har høy reproduserbarhetshastighet og begrenset variasjon mellom dyr på grunn av det forhåndsbestemte blodvolumet. Det etterligner SAH hos mennesker, noe som gjør det til en relevant modell for SAH-forskning.
Introduction
Ikke-traumatisk subaraknoidalblødning (SAH) er en form for hjerneslag, som representerer rundt 5% av alle tilfeller. Den vanligste årsaken til ikke-traumatisk SAH er den plutselige brudd på en aneurisme (aSAH), som står for 85% av SAH. Andre årsaker inkluderer brudd på en arteriovenøs misdannelse, koagulopatier og brudd på vener i perimesencephalic blødning1. Insidensraten er 9 per 100 000 personår, med dødelighet rundt en av tre og en annen tredjedel som krever støtte fra dagliglivet etter SAH 2,3.
Etter innledende stabilisering og diagnosebekreftelse avhenger behandlingen av alvorlighetsgraden av blødningen. De hardest rammede pasientene vil få inn et ekstraventrikkeldren i ventriklene for å redusere det intracerebrale trykket (ICP) og bli innlagt på nevrointensivavdelingen, hvor de overvåkes nøye. Pasienter vil gjennomgå en angiografi for å identifisere (sannsynlig) aneurisme og etterpå har aneurisme kveilet eller klippet for å hindre ny blødning4. Til tross for mange studier av farmakologiske terapier, har bare nimodipin, en kalsiumkanalantagonist, vist seg å forbedre resultatene5. Flere kliniske studier er for tiden i gang. Se gjennomgangen av Daou og kolleger for en omfattende liste6.
Brudd på en aneurisme har blitt beskrevet som den plutselige utbruddet av den verste hodepine noensinne opplevd eller en tordenskrall hodepine. Bruddet resulterer i en bratt økning i ICP etterfulgt av en reduksjon i cerebral blodstrøm (CBF). Denne reduksjonen resulterer i global iskemi i hjernen, noe som kan føre til tap av bevissthet. Denne mer mekanistiske banen, sammen med den initierte nedbrytningen av de ekstravaserte elementene i blodet, gir opphav til cytokinfrigjøring og aktivering av det medfødte immunsystemet som resulterer i steril nevroinflammasjon. Videre observeres ofte nedbrytning av blod-hjernebarrieren, noe som resulterer i cerebralt ødem og forstyrrelse i ionhomeostasen. Alle disse endringene og mer, myntet tidlig hjerneskade (EBI), forekommer i løpet av de første par dagene og resulterer i nevrontap og apoptose7.
Omtrent 1/3 av pasientene som er rammet av aSAH vil utvikle forsinket cerebral iskemi (DCI) mellom dag 4-148. DCI er definert som enten debut av fokal, nevrologisk svekkelse eller et fall på minimum to punkter på komaskalaen i Glasgow som varer i minimum 1 time, når andre årsaker, inkludert kramper og ny blødning er utelukket. DCI er forbundet med økt risiko for død og redusert funksjonsutfall etter aSAH9. Cerebral vasospasme (CVS), innsnevring av cerebrale arterier, har vært kjent for å være assosiert med DCI i flere tiår og ble tidligere antatt å være den eneste årsaken til DCI. Det har siden blitt vist at CVS kan oppstå uten utvikling av DCI og flere faktorer, inkludert mikrovaskulær trombose og innsnevring, kortikal spredningsdepresjon og en inflammatorisk respons av EBI har siden blitt identifisert10,11,12.
På grunn av den store innflytelsen fra EBI og DCI på sykdomsforløpet og utfallet av pasientene som rammes, må dyremodeller etterligne disse i størst mulig grad, samtidig som de er reproduserbare. Forskere har brukt et bredt spekter av forskjellige modeller i en rekke dyr fra mus til ikke-menneskelige primater for å prøve å simulere aSAH. Sprague-Dawley og Wistar villtyperotter er for tiden de mest brukte laboratoriedyrene, og de vanligste modellene er endovaskulær perforasjonsmodell, cisterna-magna dobbeltinjeksjonsmodell, og til slutt den pre-chiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen, som vil bli beskrevet i denne artikkelen13.
Den pre-chiasmatiske, enkeltinjeksjonsmodellen ble opprinnelig utviklet av Prunell og kolleger for å motvirke noen av manglene i de andre eksperimentelle modellene14. Operasjonen, når den mestres, er svært reproduserbar og minimerer variasjon mellom dyr. Modellen etterligner SAH hos mennesker på flere punkter, inkludert den plutselige økningen i ICP etter injeksjon av blod, noe som resulterer i forbigående global iskemi på grunn av et fall i CBF15,16. Det påvirker den fremre sirkulasjonen, som er der de fleste aSAH hos mennesker forekommer17. Dødeligheten varierer fra 10% -33% avhengig av studien og mengden blod injisert14,18. Forsinket celledød og nevroinflammasjon kan påvises dag 2 og 7 og dermed gi variabler for å studere konsekvensene av EBI og DCI19,20.
Studien presenterer en oppdatert beskrivelse av den prechiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen hos rotte sammen med en beskrivelse av hvordan ICP-sonden kan brukes som en port for intratekal administrering av legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne prosedyren utføres i samsvar med EUs direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og godkjent av det danske dyreforsøkstilsynet (lisensnr. 2016-15-0201-00940). Kirurgi utføres ved hjelp av aseptisk teknikk i størst mulig grad, inkludert sterile instrumenter, hansker, katetre og suturer. Studien brukte mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley-rotter som veier 230-350 g, gruppe plassert i 12-timers lys / mørk syklus, med konstant temperatur på 22 ° C (± 2 ° C) og fuktighet på 55% (± 10%). Dyrene er utstyrt med standard chow og vann ad libitum. Dyrene oppbevares i enkeltbur etter operasjon, men kan returneres til gruppebur når ICP-sonden er fjernet. Bedøvelsen i denne protokollen er isofluran gass, men en 1,5 ml / kg 3: 2 intraperitoneal blanding av ketamin (100 mg / ml) og xylazin (20 mg / ml) er også effektiv21.
1. Forberedelser
- Modifiser et 16 G perifert venekateter for intubasjon. For å modifisere, forkort nålen med 1 cm og bøy de resterende distale 1 cm x 30° mot injeksjonsventilen. Fjern katetervingene (flerbruk).
- For å lage en ICP-sonde, kutt et 20 mm stykke polyetenrør (indre diameter (ID): 0,58 mm, ytre diameter (OD): 0,96 mm) og brenn den ene enden for å lage en sirkulær plate, og hold en åpen lumen. Omgå polyetenrøret med 1 mm silikonslange (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm) før du kobler 10 mm silikonslange (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) til enden av polyetenrøret.
- Slå på den bærbare datamaskinen og åpne datainnsamlingsprogramvaren. Kalibrer transduserne for blodtrykk (BP) og intracerebrert trykk (ICP), og laserdoppleren i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered blodgassanalysatorapparatet.
FORSIKTIG: Forsikre deg om at det er nok isofluran i fordamperen. - Slå på O2 og atmosfærisk luftstrøm. Sett strømmen av O2 til 30% og atmosfærisk luft til 70%.
- Plasser varmeputen og sett temperaturen på 37 °C.
2. Anestesi
- Plasser rotta i anestesikammeret med en strøm på 30%O2 og 70% atmosfærisk luft. Administrer 5 % isofluran gass inn i kammeret. Tilstrekkelig anestesi vil ta rundt 4 min. Kontroller pusten nøye.
- Når du er bedøvet, legg rotta i liggende stilling på en tung plate omgått av et gummibånd. Plasser fortennene på rotta under gummibåndet.
- Trekk tungen forsiktig ut med buede tang. Rengjør strupehodet med en bomullsspiss. Plasser et eksternt lys i midtlinjen av halsen for å visualisere stemmebåndene.
- Intuber under inspirasjon ved hjelp av det modifiserte 16 G perifere venekateteret. Når den er riktig satt inn, fjern stilettoen. Koble kateteret til ventilatoren.
MERK: Korrekt plassering av røret bekreftes av brystbevegelser synkronisert med respirasjonshastigheten. Hvis det ses bevegelser i magen, ekstuberer og gjeninnfører rotta i anestesiklokken. Ikke gjenta prosedyren mer enn tre ganger på grunn av risikoen for å skade luftveiene. - Når det er intubert, hold dyret på kunstig åndedrett med 30%O2 og 70% atmosfærisk luft. Oppretthold anestesien på 1,5%-3% isofluran. Juster isofluran for å holde blodtrykket mellom 80-100 mmHg.
- Hold åndedrettsvernets inspirasjonsvolum på 3 ml og frekvensen på 40-45 inspirasjoner/min. Juster inspirasjonsvolumet i henhold til blodgassanalysen.
- Lag en søm gjennom det indre myke vevet i kinnet med en 2-0 sutur. Bind suturen rundt injeksjonsslangen og injeksjonsventilen til det perifere venekateteret for å feste kateteret.
- Flytt rotta til operasjonsfeltet og legg den i liggende stilling med halen vendt mot kirurgen.
- Påfør øyegelen når det er nødvendig for å motvirke tørre øyne.
- Utfør en tåklemme for å bekrefte en tilstrekkelig dybde av anestesi. Vurdere og opprettholde anestesidybde under operasjonen.
3. Hale kateter
- Desinfiser den proksimale 3-4 cm av halen med 0,5% klorhexidinetanol.
MERK: Fra nå av, bruk det kirurgiske mikroskopet etter kirurgens skjønn. - Gjør et 15-20 mm hudsnitt i den proksimale enden av halen på ventralsiden. Vær forsiktig så du ikke snitter arterien.
- Løsne huden fra det underliggende bindevevet ved hjelp av en buet tang.
- Forsiktig trenge inn i fascia utsette arterien.
- Slipp forsiktig halearterien fra det underliggende vevet ved hjelp av en buet tang.
- Slipp tre svarte silketråder under fartøyet. Plasser en tråd så distalt som mulig og bind en kirurgisk knute tett rundt arterien. Hold de løse endene av tråden med en hemostat.
- Bind de to gjenværende trådene løst rundt arterien.
- Skyv den proksimale tråden så proksimalt som mulig. Påfør en hemostat for å holde endene av den proksimale tråden. Trekk hemostaten lett, men nok til å begrense og blokkere blodstrømmen. Plasser hemostaten på magen.
- Klipp tuppen av kateteret i en 45° vinkel. Klipp det skarpe punktet for å forhindre penetrasjon av arterieveggen.
- Bruk en Vannas-saks til å lage et arteriesnitt 1/3 av arteriens diameter i en 30° vinkel, 3-5 mm fra den distale knuten.
- Sett kateteret inn i arterien ved hjelp av to rette tang. Bruk en tang for å holde kateteret og den andre til å forsiktig trekke arterien over kateteret.
- Sett kateteret opp fartøyet til den proksimale knuten og løsne knuten fra hemostaten. Visualiser blodstrømmen i kateteret. Fest den midterste tråden løst til kateteret.
- Fortsett innsetting til, og om mulig, like utover, det punktet hvor arterien er dekket igjen av fascia.
- Kontroller kateterplasseringen og mulig lekkasje ved å skylle med saltvann.
- Fest de to proksimale trådene ved hjelp av kirurgiske knuter.
MERK: Blodtrykksmålingen må være pulsatil; Hvis ikke, er kateteret ikke riktig plassert. - Fest kateteret på slutten av snittet ved å knytte en kirurgisk knute ved hjelp av den distale tråden.
- Sy hudsnittet løst sammen med to ikke-resorberbare monofilament 4-0 sutur. Vær forsiktig så du ikke trenger inn i kateteret.
MERK: Gjennom hele operasjonen være oppmerksom på amplitude av pulsering. Hvis dette er lavt, skyll kateteret med saltvann. - Løsne det arterielle kateteret fra trykktransduseren for å tillate blodstrøm for blodprøvetaking av blodgass. Plasser et mikrokapillærrør på slutten av kateteret. La blodet strømme inn i røret. Fest kateteret til transduseren igjen etter blodoppsamling og skyll kateteret.
- Sett kapillærrøret inn i blodgassanalysatoren. Mål pH, pCO2 og pO2 og noter dem ned
NOTAT: Avhengig av blodgass- og blodtrykksverdiene, endre ventilasjonshastigheten. Hvis gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) er for lavt, prøv å skru ned strømningshastigheten for isofluran . Test refleksene for å sikre riktig dybde av anestesi.
4. ICP-sonde
- Plasser rotta i den stereotaktiske rammen. Det er viktig å plassere rotta symmetrisk.
- Plasser en sylindrisk pute under den stereotaktiske rammen for å skape fremre fleksjon i nakken.
- Barber rottens hodebunn, nakke og området bak ørene. Fjern overflødig hår.
- Desinfiser området med 0,5% klorhexidinetanol.
- Bedøv lokalt med 0,7 ml 10 mg/5 μg/ml lidokain med adrenalin, stikk nålen i den kaudale enden av skallen i midtlinjen. Injiser i muskulaturen i nakken med 0,3-0,4 ml. Injiser resten subkutant rundt og foran bregma.
- Lag et hudsnitt fra nålepunkteringen ~8 mm kaudalt i midtlinjen.
- Dissekere alle musklene sløvt i lag for å identifisere atlantooccipital membran (marmorfarget trekant kaudalt til skallen i midtlinjen).
- Bruk Alm retractor for å holde igjen nakkemuskulaturen. Plasser den utstikkede retractoren kaudalt om nødvendig.
- Kontroller om den sterile ICP-sonden er koblet til ICP-svingeren. Skyll ICP-sonden med saltvann. Forsikre deg om at det ikke er luftbobler i ICP-sonden.
- Snitt den atlantooccipitale membranen med en 23 G nål. Lag et hull for å lokke ICP-sonden gjennom membranen.
- Lokk sonden forsiktig gjennom den atlantooccipitale membranen. Trekk sonden lett og sørg for at den viser en pulserende kurve mellom 0-5 mmHg. Hvis ikke, fjern sonden, kontroller tilkoblingen til transduseren og bekreft strømmen gjennom lumen.
- Påfør to dråper av vevslimet. Flytt silikonslangen på 1 mm fremover til membranen og påfør ekstra lim for å minimere risikoen for ICP-sondeforskyvning.
- Fjern retractoren(e).
- Lag en horisontal madrass sutur til cephalic enden av snittet og en enkel avbrutt sutur til den kaudale enden ved hjelp av en ikke-resorberbar monofilament 4-0 sutur.
5. Plassering av kanylen og laserdopplersonden
- Lag et snitt i midtlinjen like foran øynene, 15 mm kaudalt.
- Fjern bindevevet og musklene med tang. Bruk enden av en steril bomullspinne som rougin, noe som gjør det mulig å identifisere bregma og koronale suturer.
- Plasser Alm-retraktoren.
- Plasser en 25 G spinalnål i den stereotaktiske rammen. Plasser nålen nøyaktig på bregma og noter posisjonen.
MERK: Plasser midtlinjeleddet i den stereotaktiske rammen ved 30° mot dyret i vertikalplanet. - Fjern nålen fra bregmaen, beveg rammen 65 mm anteriort og sett deretter kanylen i midtlinjen igjen for å markere borestedet.
- Bor til dura materen er identifisert under beinet. Fjern forsiktig beinfragmentene med rette tang og fyll hulrommet med beinvoks.
- Bor et nytt hull 3-4 mm lateralt til høyre for bregma og like foran koronal sutur for laserdoppler. Det er ikke nødvendig å bore hele veien gjennom beinet. Vær forsiktig så du ikke trenger inn i dura materen.
- Se etter fartøyene der laserdoppleren kan måle blodstrømmen. Plasser laserdoppleren og kontroller verdiene. En minimumsverdi på 100 FU kreves. Fjern mikroskopet (kunstig lys).
- Hvis verdiene fortsatt er akseptable, legg til en dråpe lim for å fikse sonden.
- Kontroller på nytt for å bekrefte om verdien er over 80 FU. Hvis verdien er under 80 FU, fjerner og flytter du sonden for å nå en verdi over 80 FU.
MERK: Verdien, FU, er en vilkårlig enhet som viser cerebral blodstrøm (CBF).
6. Induksjon av SAH
- Sett nålen forsiktig gjennom skallen i midtlinjen mellom halvkule til motstand av bunnen av skallen er følt. Trekk nålen inn med 1 mm for å sikre riktig plassering like foran chiasma opticum.
- Vri nålen 90° med klokken slik at nålespissen peker mot høyre for å sikre det mest homogene resultatet når blodet injiseres. Fjern stilettoen (figur 3).
- Likevekt i 15 minutter og juster anestesinivået for å oppnå et gjennomsnittlig arterielt blodtrykk i området 80-100 mmHg.
- Utfør en blodgassanalyse. Juster nivået av anestesi tilsvarende.
- Trekk opp 500 mikrol blod fra halekateteret ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en butt 23 G kanyle.
- Fyll det døde rommet i spinal nål kammer med blod for å unngå injeksjon av luft. Fjern 23 G kanylen fra den blodfylte sprøyten og bekreft at sprøyten inneholder 300 mikroliter blod.
- Koble sprøyten til spinalnålen. Ta et godt tak og injiser blodet manuelt for å overgå MAP.
- Observer en bratt økning i ICP og et bratt fall i CBF på den bærbare datamaskinen.
MERK: CBF bør være 50% eller lavere sammenlignet med baseline score i minst 5 minutter for at operasjonen skal lykkes, se figur 4. Sham rotter gjennomgår ikke trinnene 6,1-6,7, og utelater dermed innføringen av spinalnålen i storhjernen, minimerer mulig spontan blødning og iatrogen hjerneskade.
7. Gjenoppretting og oppvåkning
- Administrer 0,1 ml/100 g dyrevekt på 5,0 mg/ml karprofen og 1 ml/100 g animalsk vekt av isoton saltoppløsning subkutant. Forsikre deg om at væskene er minst romtempererte før administrering.
- Hold deretter rotta under anestesi i 30 min etter SAH.
- Fjern nålen, laserdopplersonden, og fyll deretter hulrommene med beinvoks. Lukk snittet med to horisontale madrasssuturer med ikke-resorberbar monofilament 4-0 sutur.
- For å bruke ICP-sonden til injeksjoner i cisterna magna, fjern silikonslangen og sett inn en spissadapter til polyetenrøret.
- Hvis ingen inngrep er planlagt, kutt den enkle, avbrutte suturen. Forkort ICP-sonden så mye som mulig ved hjelp av en saks og lim deretter enden for å forhindre lekkasje av cerebrospinalvæske (CSF). Lukk snittet med en ikke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Fjern rotta fra den stereotaksiske rammen og sett i en liggende stilling. Fjern de løse suturene fra halesnittet.
- Plasser en enkelt sutur proksimalt og dypt til arterielt kateter. Fjern kateteret og bind suturen for å forhindre blødning. Sutur halesnittet med en ikke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Slå av isofluran.
- Rengjør rotta og pelsen så mye som mulig.
- Når pedalens tilbaketrekningsrefleks er gjenvunnet og rotta har spontan respirasjon når den kobles fra ventilatoren, ekstuberer den.
- Plasser rotta i et enkelt bur med mat og vann ad libitum. Plasser halvparten av buret under en varmeplate og plasser rotta i dette området av buret.
- Utfør intratekal administrering ved å tilpasse pinportinjektoren til en presisjonssprøyte og administrere behandlingen gjennom pinportadapteren. Denne intervensjonen er mulig hos dyr som er våken. Se figur 5.
8. ICP-sonde fjerning (hvis ikke fjernet under operasjonen)
MERK: Bruk et kirurgisk mikroskop etter kirurgens skjønn.
- Plasser rotta i anestesikammeret som beskrevet tidligere.
- Når du er bedøvet, plasser rotta i liggende stilling i driftsfeltet med varmepute.
- Plasser nesen i anestesimasken. Sett nivåene av O 2 til 30%, atmosfærisk luft til 70% og isofluran til2 %.
- Påfør øyegeleen kontinuerlig for å motvirke tørre øyne.
- Klipp den kaudale enkle avbrutte suturen. Åpne snittet og fjern mulig nekrotisk vev eller blodpropper.
- Forkort ICP-sonden så mye som mulig ved hjelp av en saks og lim enden for å forhindre lekkasje av cerebrospinalvæske (CSF). Lukk snittet med en ikke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Slå av isofluran.
- Når rotta begynner å bevege seg, plasser den i et enkelt bur med mat og vann ad libitum. Plasser halvparten av buret over en varmeplate og plasser rotta i dette området.
- Når de returneres til vanlig tilstand, gjeninnfør dyrene til hverandre i et felles bur under tilsyn de første 15 minuttene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvinner har økt risiko for aSAH sammenlignet med menn. Til tross for dette brukes mannlige gnagere primært i eksperimenter på grunn av mulig skjevhet fra heterogenitet av østrussyklus hos kvinner. De representative resultatene som presenteres her er fra en nylig publikasjon som sammenligner hunn- og hannrotter, og bekrefter at modellen gir lignende resultater hos hunndyr sammenlignet med hannrotter21. Studien inkluderte 34 kvinnelige Sprague-Dawley-rotter (18 SAH og 16 humbug). Shams hadde ikke spinalnålen ned til optisk chiasme eller blod injisert. Alle andre prosedyrer ble utført på Shams identisk med SAHs. Alle fysiologiske parametere mellom gruppene var sammenlignbare. Til slutt ble det gjort en metaanalyse av data fra tidligere eksperimenter på hannrotter og sammenlignet med resultatene fra denne studien21.
Den roterende poltesten er en test av grov sensorimotorisk funksjon. Dyret er plassert på den ene enden av en 150 cm ved 45 mm stolpe, som kan rotere opp til 10 o / min. Målet er å nå den ytterste enden av stolpen hvor et bur er plassert. SAH-rotter gjorde det signifikant dårligere på dag 1 og 2, sammenlignet med narredyr på den roterende polen (figur 1).
Etter SAH oppreguleres både ET-1- og 5-HT-reseptorfamilien i cerebrale arterier, noe som resulterer i økt sammentrekning når den stimuleres og dermed bidrar til CVS22,23. Arteria basilaris (BA) og arteria cerebri media media (MCA) ble fjernet etter halshugging og brukt til myografforsøk. Både endotelin 1 (ET-1), en agonist for ET-1-reseptorfamilien og 5-karboksamidotryptamin (5-CT), en agonist for 5-HT-reseptorfamilien, ga signifikant økt vaskulær sammentrekning i SAH sammenlignet med simulering (figur 2). Følsomhet kan observeres ved de lavere konsentrasjonene som trengs for å fremkalle sammentrekning etter SAH hos begge kjønn.
Økt vanninnhold (ødem) etter SAH er et mål på redusert funksjonsutfall hos mennesker24. Signifikant økt cerebralt ødem ble funnet ved SAH sammenlignet med simulering på dag 2. Det var også tendens til økt ødem i hippocampus, men dette var ikke statistisk signifikant (p = 0,0508)21.
Når man sammenligner de ovennevnte dataene med historiske mannlige data, er resultatene sammenlignbare. Metadataene viser økt kontraktilitet hos mannlige SAH etter tillegg av ET-1 eller 5-CT (figur 2). Videre presterte SAH-rottene betydelig dårligere sammenlignet med humbug når de gjorde den roterende stangtesten. Resultatet tydet på nedsatt sensorimotorisk funksjon (figur 1).
Figur 5A viser fordelingen av det autologe, injiserte blodet etter saltvannsperfusjon 30 minutter etter induksjon av SAH. Figuren viser at blodet har blitt fordelt i subaraknoidalrommet etter pre-chiasmatisk injeksjon.
Figur 5B og figur 5C viser fordelingen av intratekalt injiserte fargestoffer, etterfulgt av saltvannsperfusjon i hele kroppen i 30 minutter etter injeksjonen. Figur 5B viser fordelingen av 25 μL på 20 mM, Evans Blue (vannløselig) og figur 5C viser fordelingen av 25 μL av 10 mM Oil Red O (vannuløselig). Begge fargestoffene ble funnet å være fordelt i subaraknoidalrommet etter injeksjonen i cisterna magna, noe som bekrefter at dette er en mulig modell for intratekal injeksjon av både vannløselige og uoppløselige forbindelser. Verdt å merke seg er dannelsen av avsetninger rundt arteriene for den vannuoppløselige forbindelsen.
Figur 1: Analyse av sensorisk-motorisk kognisjon de første 2 dagene etter SAH hos hann- og hunnrotter. Roterende stavtest ble utført dag 1 og dag 2 etter SAH. Rotter av begge kjønn hadde betydelige underskudd sammenlignet med skamopererte rotter av samme kjønn. Statistiske forskjeller i atferd mellom gruppene ble testet med 2-veis ANOVA på dag 0, dag 1 og dag 2. Kvinne ingen rotasjon og 3 rpm: p < 0,05. Kvinne 10 rpm og alle mannlige data: p < 0,01. Verdier er midler ± SEM. Republisert med tillatelse fra Spray, S. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Analyse av økt sensitivitet for ET-1- og 5-CT-induserte kontraksjoner i arteria basilaris (BA) og arteria cerebri media (MCA) 2 dager etter SAH hos hann- og hunnrotter. (A,B) 60 mM K+-fremkalte (K+max) kontraktile responser ble brukt som referanseverdier for normalisering av agonistinduserte responser. Sensitiviteten for ET-1 var signifikant økt 2 dager etter SAH sammenlignet med narreopererte rotter av samme kjønn i både BA og MCA. (C,D) Sensitiviteten for 5-CT økte signifikant 2 dager etter SAH sammenlignet med narreopererte rotter av samme kjønn i både BA og MCA. Konsentrasjon-responskurvene ble statistisk sammenlignet med toveis ANOVA. Alle data: p < 0,001. Verdier er midler ± SEM. Republisert med tillatelse fra Spray, S. et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oversikt over oppsettet før induksjon av SAH. Legg merke til at 1) injeksjonsnålen, 2) laserdopplersonden og 3) ICP-sonden er på plass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Prøvespor etter intratekal injeksjon. Den røde grafen viser blodtrykket i mmHg. Den blå grafen viser ICP i mmHg og den grønne grafen viser CBF i den vilkårlige enheten FU. Økningen i ICP er et resultat av blodinjeksjon. Legg merke til at dette resulterer i et fall i CBF > 50% av baseline i mer enn 5 minutter. ICP-økningen resulterer dessuten i en liten økning i blodtrykket som normaliseres i løpet av sekunder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Fordeling av intratekalt injisert blod og fargestoffer. (A) Distribusjon av autologt blod 30 minutter etter SAH-induksjon. (B) Distribusjon av 25 μL av 20 mM Evans Blue etter intratekal injeksjon gjennom ICP-kateter. (C) Distribusjon av 25 μL 10 mM olje rød O etter intratekal injeksjon gjennom ICP-kateter. Alle dyrene ble bedøvet med intraperitoneal ketamin/xylazinblanding etterfulgt av saltvannsperfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den pre-chiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen til SAH etterligner flere viktige elementer i human SAH, inkludert piggen i ICP, reduksjon av CBF, forbigående global iskemi, oppregulering av nevroinflammatoriske markører og CVS 14,15,16,18,19,20. ICP-sonden ble også brukt som port for intratekal administrering (figur 5). Videre viser studien at modellen fungerer likt hos hann- og hunndyr21. Modellen inkluderer ikke utvikling av og påfølgende brudd på en aneurisme. En rekke modeller har forsøkt å produsere SAH fra et sprukket aneurisme ved induksjon av systemisk hypertensjon enten kirurgisk eller farmakologisk og ved å svekke arterieveggen ved bruk av elastase25,26,27. Alle forsøk har produsert aneurysmal SAH i en delmengde av dyr, men disse modellene har en iboende variabilitet, inkludert manglende evne til å forutsi når aneurismen vil briste. Modellene er lite egnet for preklinisk forskning på SAH18,28.
Blant andre murine, SAH-modeller, inkluderer endovaskulær perforeringsmodell brudd på et fartøy, noe som etterligner brudd på en aneurisme, men utsatt for høy variabilitet og dødelighet. Modellen beskrevet her er bedre sporbar og mer reproduserbar ettersom blodvolumet er forhåndsbestemt og injeksjonstrykket kan kontrolleres. Dobbeltinjeksjonsmodellen har større sannsynlighet for å produsere forsinket CVS, men påvirker først og fremst den bakre sirkulasjonen og inkluderer en ufysiologisk andre blodinjeksjon. Til sammenligning ligner denne modellen SAH hos mennesker, da det er en enkelt injeksjon av den fremre sirkulasjonen, og den gir en reproduserbar ICP-økning18.
Innflytelsen av forskjellige anestesiregimer på eksperimentell SAH er uklar og eksperimentelle data er motstridende. En studie rapporterte mulig hemming av cytokiner og generell nevroinflammasjon i en endovaskulær perforasjonsmodell hos mus ved bruk av isofluran inhalasjoner29. En annen gnagermodell resulterte i reduserte respiratoriske parametere og økt hjerneødem sammen med redusert regional CBF ved bruk av isoflurer30. En metaanalyse som sammenlignet dødelighet i musemodeller viste imidlertid ingen forskjell i dødelighet mellom isofluran og andre typer anestesi31. I samsvar med dette har protokollen ovenfor med hell brukt enten isofluran inhalasjon eller en intraperitoneal ketamin/xylazinblanding med tilsvarende resultat i begge grupper21.
For å sikre høy reproduserbarhet og riktig datainnsamling, legges det stor vekt på trinnene for plassering av overvåkingsutstyret. Riktig plassering av halekateteret muliggjør kontinuerlig overvåking av blodtrykk og muligheten til å gjøre blodgassanalyser. Riktig plassering av ICP-kateteret sikrer korrekt ICP-overvåking og påfølgende mulighet for intratekal intervensjon. Riktig plassering av laserdopplersonden sikrer at reduksjonen av CBF kan overvåkes, der en reduksjon på 50 % eller lavere av baseline score i minst 5 minutter etter SAH-induksjon sikrer en sterk iskemi32. Ved å sørge for at alle overvåkingstrinn er i orden, kan forskeren sikre korrekt datainnsamling etter SAH-induksjonen.
Protokollen beskriver den pre-chiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen for subaraknoidalblødning med oppdateringer og modifikasjoner. Modellen har vært verdifull for SAH-forskning og vil trolig fortsette å bidra til en bedre forståelse av subaraknoidalblødning, inkludert tidlig hjerneskade og forsinket cerebral iskemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å erklære.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Lundbeck Foundation og Lundbeck Grant of Excellence (nr. R59-A5404). Finansiører hadde ingen rolle i noen del av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G peripheral vein catheter | BD Venflon | 393229 | Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed |
| Anesthesia bell/ chamber | Unknown | ||
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL80 | |
| Blood pressure (BP) monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Curved forceps, 12 cm x 3 | F.S.T | 11001-12 | For anesthesia |
| Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm | Homemade | Made from surgical towels | |
| Data acquisition hardware | Adinstruments | ML870 Powerlab | |
| Data acquistion software | Adinstruments | LabChart 6.0 | |
| Drill | KMD | 1189 | |
| Drill controller | Silfradent | 300 IN | |
| Flexible light | Schott | KL200 | |
| Heating pad | Minco | 1135 | |
| Hypodermic needle, 20 G | KD Medical | 301300 | Connects to stereotaxic frame |
| ICP monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | TEC3 | |
| Laptop | Lenovo | T410 | |
| Laser doppler monitor | Adinstruments | ML191 | |
| Laser doppler probe | Oxford Optronics | MSF100XP | Connects to laser doppler monitor |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | For anesthesia |
| Precision syringe, 0.025 mL | Hamilton | 547407 | |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | M900 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss | F170 | |
| Suture needle | Allgaier | 1245 | For anesthesia |
| Temperaure controller | CWE,INC. | TC-1000 | |
| Transducer x 2 | Adinstruments | MLT0699 | Connects to BP and ICP monitor |
| Ventilator | Ugo Basile | 7025 | |
| Veterinary clipper | Aesculap | GT421 | |
| 3-pronged Blair retractor, 13.5 cm | Agnthos | 17022--13 | |
| Blunt Alm retractor | F.S.T | 17008-07 | |
| Curved forceps, 12 cm x 2 | F.S.T | 11001-12 | |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | |
| Straight Dumont forceps, 11 cm | F.S.T | 11252-00 | |
| Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2 | F.S.T | 13008-12 | |
| Straight Iris scissor, 9 cm | F.S.T | 14090-09 | |
| Straight Vannas scissor, 10.5 cm | F.S.T | 15018-10 | |
| Absorpable swabs | Kettenbach | 31603 | |
| Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm | Vömel | 14757 | |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | |
| Carbomer eye gel 2 mg/g | Paranova | ||
| Cotton swab | Heinz Herenz | WA-1 | |
| Cotton tipped applicator x 4 | Selefa | 120788 | |
| Hypodermic needle, 23 G x2 | KD Medical | 900284 | Connects to stopcock. Remove distal end |
| Hypodermic needle, 23 G x3 | KD Medical | 900284 | Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe |
| ICP probe: | Homemade | Made of the following: | |
| Polythene tubing, 20 mm | Smiths medical | 800/100/200 | Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm. |
| Silicone tubing, 10 mm | Fisher | 15202710 | ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm. |
| Silicone tubing, 2 mm | Fisher | 11716513 | ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm. |
| Micro hematocrit tubes | Brand | 7493 11 | |
| OP-towel, 45 cm x75 cm | Mölnlycke | 800430 | |
| PinPort adapter, 22 G | Instech | PNP3F22 | |
| PinPort injector | Instech | PNP3M | |
| Polythene tubing, 2 x 20 cm | Smiths medical | 800/100/200 | Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm. |
| Rubberband | Unknown | ||
| Scalpel, 10 blade | Kiato | 23110 | |
| Spinalneedle, 25 G x 3.5'' | Braun | 5405905-01 | |
| Stopcock system, Discofix x 2 | Braun | 16494C | Connects to transducer |
| Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3 | Ethicon | EH7145H | |
| Syringe, 1 mL | BD Plastipak | 1710023 | |
| Syringe, luer-lock, 10 mL x 4 | BD Plastipak | 305959 | Connects to transducer |
| Tissue adhesive glue | 3M | 1469SB | |
| 0.5% Chlorhexidine spirit | Faaborg Pharma | 210918 | |
| Carprofen 50 mg/mL | ScanVet | 43715 | Diluted 1:10 |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isotonic saline | Amgros | 16404 | |
| Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL | Amgros | 16318 |
References
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), London, England. 306-318 (2007).
- de Rooij, N. K., Linn, F. H. H., vander Plas, J. A., Algra, A., Rinkel, G. J. E. Incidence of subarachnoid haemorrhage: a systematic review with emphasis on region, age, gender and time trends. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (12), 1365-1372 (2007).
- Feigin, V. L., Lawes, C. M., Bennett, D. A., Barker-Collo, S. L., Parag, V. Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies: a systematic review. The Lancet, Neurology. 8 (4), 355-369 (2009).
- Maher, M., Schweizer, T. A., Macdonald, R. L. Treatment of spontaneous subarachnoid hemorrhage: guidelines and gaps. Stroke. 51 (4), 1326-1332 (2020).
- Pickard, J. D., et al. Effect of oral nimodipine on cerebral infarction and outcome after subarachnoid haemorrhage: British aneurysm nimodipine trial. British Medical Journal (Clinical Research ed.). 298 (6674), 636-642 (1989).
- Daou, B. J., Koduri, S., Thompson, B. G., Chaudhary, N., Pandey, A. S. Clinical and experimental aspects of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. CNS Neuroscience and Therapeutics. 25 (10), 1096-1112 (2019).
- Fujii, M., et al. Early brain injury, an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research. Translational Stroke Research. 4 (4), 432-446 (2013).
- Roos, Y. B., et al. Complications and outcome in patients with aneurysmal subarachnoid haemorrhage: A prospective hospital based cohort study in the Netherlands. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 68 (3), 337-341 (2000).
- Vergouwen, M. D. I., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Brown, R. J., Kumar, A., Dhar, R., Sampson, T. R., Diringer, M. N. The relationship between delayed infarcts and angiographic vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 72 (5), 702-707 (2013).
- Dhar, R., et al. Relationship between angiographic vasospasm and regional hypoperfusion in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 43 (7), 1788-1794 (2012).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews. Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Svendgaard, N. -A. A new experimental model in rats for study of the pathophysiology of subarachnoid hemorrhage. Neuroreport. 13 (18), 2553-2556 (2002).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
- Prunell, G. F., et al. Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Cerebral blood flow and brain metabolism during the acute phase in three different models in the rat. Neurosurgery. 54 (2), 426-437 (2004).
- Velthuis, B. K., et al. Subarachnoid hemorrhage: Aneurysm detection and preoperative evaluation with CT angiography. Radiology. 208 (2), 423-430 (1998).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Inflammation in the brain after experimental subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 56 (5), 1082-1091 (2005).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Delayed cell death related to acute cerebral blood flow changes following subarachnoid hemorrhage in the rat brain. Journal of Neurosurgery. 102 (6), 1046-1054 (2005).
- Spray, S., Haanes, K. A., Edvinsson, L., Johansson, S. E. Subacute phase of subarachnoid haemorrhage in female rats: increased intracranial pressure, vascular changes and impaired sensorimotor function. Microvascular Research. 135, 104127 (2020).
- Ansar, S., Vikman, P., Nielsen, M., Edvinsson, L. Cerebrovascular ETB, 5-HT1B, and AT1 receptor upregulation correlates with reduction in regional CBF after subarachnoid hemorrhage. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), 3750-3758 (2007).
- Hansen-Schwartz, J., et al. Subarachnoid hemorrhage enhances endothelin receptor expression and function in rat cerebral arteries. Neurosurgery. 52 (5), 1188-1194 (2003).
- Hayman, E. G., Wessell, A., Gerzanich, V., Sheth, K. N., Simard, J. M. Mechanisms of global cerebral edema formation in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurocritical Care. 26 (2), 301-310 (2017).
- Miyata, H., et al. Vasa vasorum formation is associated with rupture of intracranial aneurysms. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2019).
- Tada, Y., et al. Roles of hypertension in the rupture of intracranial aneurysms. Stroke. 45 (2), 579-586 (2014).
- Nuki, Y., et al. Elastase-induced intracranial aneurysms in hypertensive mice. Hypertension. 54 (6), Dallas, Tex. 1337-1344 (1979).
- Marbacher, S., Wanderer, S., Strange, F., Grüter, B. E., Fandino, J. Saccular aneurysm models featuring growth and rupture: A systematic review. Brain Sciences. 10 (2), 101 (2020).
- Altay, O., et al. Isoflurane on brain inflammation. Neurobiology of Disease. 62, 365-371 (2014).
- Hockel, K., Trabold, R., Schöller, K., Török, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4 (1), 5 (2012).
- Kamp, M. A., et al. A Systematic and meta-analysis of mortality in experimental mouse models analyzing delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Translational Stroke Research. 8 (3), 206-219 (2017).
- Povlsen, G. K., Johansson, S. E., Larsen, C. C., Samraj, A. K., Edvinsson, L. Early events triggering delayed vasoconstrictor receptor upregulation and cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. BMC Neuroscience. 14, 34 (2013).
