Summary
Subaraknoidalblödning fortsätter att bära en hög börda av dödlighet och sjuklighet hos människa. För att underlätta vidare forskning om tillståndet och dess patofysiologi presenteras en pre-chiasmatisk modell med en injektion.
Abstract
Trots framsteg inom behandling under de senaste decennierna fortsätter subaraknoidalblödning (SAH) att bära en hög börda av sjuklighet och dödlighet, vilket till stor del drabbar en ganska ung befolkning. Flera djurmodeller av SAH har utvecklats för att undersöka de patofysiologiska mekanismerna bakom SAH och för att testa farmakologiska interventioner. Den pre-chiasmatiska modellen med en injektion hos råtta som presenteras i denna artikel är en experimentell modell av SAH med en förutbestämd blodvolym. Kortfattat bedövas djuret, intuberas och hålls under mekanisk ventilation. Temperaturen regleras med en värmepanna. En kateter placeras i svansartären, vilket möjliggör kontinuerlig blodtrycksmätning samt blodprovstagning. Atlantooccipitalmembranet skärs och en kateter för tryckregistrering placeras i cisterna magna för att möjliggöra intracerebral tryckmätning. Denna kateter kan också användas för intratekala terapeutiska ingrepp. Råttan placeras i en stereotaxisk ram, ett borrhål borras framåt mot bregma och en kateter sätts in genom borrhålet och placeras precis framför den optiska chiasmen. Autologt blod (0,3 ml) dras ut från svanskatetern och injiceras manuellt. Detta resulterar i en ökning av intracerebralt tryck och en minskning av cerebralt blodflöde. Djuret hålls nedsövt i 30 minuter och ges subkutan saltlösning och smärtstillande medel. Djuren extuberas och återförs till sin bur. Den pre-chiasmatiska modellen har en hög reproducerbarhet och begränsad variation mellan djur på grund av den förutbestämda blodvolymen. Det efterliknar SAH hos människor vilket gör det till en relevant modell för SAH-forskning.
Introduction
Icke-traumatisk subaraknoidalblödning (SAH) är en form av stroke, som representerar cirka 5% av alla fall. Den vanligaste orsaken till icke-traumatisk SAH är den plötsliga bristningen av en aneurysm (aSAH), som står för 85% av SAH. Andra orsaker inkluderar bristning av en arterio-venös missbildning, koagulopatier och bristning av vener i perimesencefalisk blödning1. Incidensen är 9 per 100 000 årsverken med dödlighet omkring en av tre och ytterligare en tredjedel som kräver stöd i det dagliga livet efter SAH 2,3.
Efter initial stabilisering och diagnosbekräftelse beror behandlingen på blödningens svårighetsgrad. De svårast drabbade patienterna kommer att ha en extraventrikulär dränering insatt i ventriklerna för att minska det intracerebrala trycket (ICP) och läggas in på neurointensivvårdsavdelningen, där de övervakas noggrant. Patienterna kommer att genomgå en angiografi för att identifiera den (troliga) aneurysmen och därefter få aneurysmen lindad eller klippt för att förhindra återblödning4. Trots många studier av farmakologiska terapier har endast nimodipin, en kalciumkanalantagonist, visat sig förbättra resultaten5. Flera kliniska prövningar pågår för närvarande. Se recensionen av Daou och kollegor för en omfattande lista6.
Bristningen av en aneurysm har beskrivits som den plötsliga uppkomsten av den värsta huvudvärk som någonsin upplevts eller en åskklapphuvudvärk. Brottet resulterar i en brant ökning av ICP följt av en minskning av cerebralt blodflöde (CBF). Denna minskning resulterar i global ischemi i hjärnan, vilket kan leda till förlust av medvetande. Denna mer mekanistiska väg, tillsammans med den initierade nedbrytningen av de extravaserade elementen i blod, ger upphov till cytokinfrisättning och aktivering av det medfödda immunsystemet vilket resulterar i steril neuroinflammation. Vidare observeras ofta nedbrytning av blod-hjärnbarriären, vilket resulterar i hjärnödem och störningar i jonhomeostasen. Alla dessa förändringar och mer, myntade tidig hjärnskada (EBI), inträffar inom de första dagarna och resulterar i neuronal förlust och apoptos7.
Cirka 1/3 av patienterna som lider av aSAH kommer att utveckla fördröjd cerebral ischemi (DCI) mellan dag 4-148. DCI definieras som antingen debuten av en fokusal, neurologisk funktionsnedsättning eller en droppe på minst två poäng på Glasgows komaskala som varar i minst 1 timme, när andra orsaker, inklusive anfall och återblödning är uteslutna. DCI är förknippat med en ökad risk för död och minskat funktionellt utfall efter aSAH9. Cerebral vasospasm (CVS), förträngningen av hjärnartärerna, har varit känd för att vara associerad med DCI i årtionden och ansågs tidigare vara den enda orsaken till DCI. Det har sedan dess visats att CVS kan uppstå utan utveckling av DCI och fler faktorer, inklusive mikrovaskulär trombos och förträngning, kortikal spridningsdepression och ett inflammatoriskt svar på EBI har sedan identifierats10,11,12.
På grund av EBI:s och DCI:s stora inflytande på sjukdomsförloppet och utfallet hos de patienter som drabbats, måste djurmodeller efterlikna dessa i största möjliga utsträckning, samtidigt som de är reproducerbara. Forskare har använt ett brett spektrum av olika modeller i en mängd olika djur från möss till icke-mänskliga primater för att försöka simulera aSAH. Sprague-Dawley och Wistar vildtypsråttor är för närvarande de vanligaste laboratoriedjuren, och de vanligaste modellerna är den endovaskulära perforeringsmodellen, cisterna-magna dubbelinjektionsmodellen och slutligen den pre-chiasmatiska enkelinjektionsmodellen, som kommer att beskrivas i denna artikel13.
Den pre-chiasmatiska modellen med enkel injektion utvecklades ursprungligen av Prunell och kollegor för att motverka några av bristerna i de andra experimentella modellerna14. Operationen, när den behärskas, är mycket reproducerbar och minimerar variationen mellan djur. Modellen efterliknar SAH hos människor på flera punkter, inklusive den plötsliga ökningen av ICP efter injektion av blod, vilket resulterar i övergående global ischemi på grund av en minskning av CBF15,16. Det påverkar den främre cirkulationen, vilket är där de flesta aSAH hos människor förekommer17. Dödligheten varierar från 10% -33% beroende på studien och mängden blod injicerat14,18. Fördröjd celldöd och neuroinflammation kan detekteras på dag 2 och 7, vilket ger variabler för att studera konsekvenserna av EBI och DCI19,20.
Studien presenterar en uppdaterad beskrivning av den pre-chiasmatiska single injection-modellen i råtta tillsammans med en beskrivning av hur ICP-proben kan användas som port för intratekal administrering av farmaci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta förfarande görs i enlighet med Europeiska unionens direktiv 2010/63 / EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och godkänt av den danska djurförsöksinspektionen (licensnummer 2016-15-0201-00940). Kirurgi utförs med aseptisk teknik i största möjliga utsträckning, inklusive sterila instrument, handskar, katetrar och suturer. Studien använde manliga och kvinnliga Sprague-Dawley-råttor som väger 230-350 g, grupp inrymda i 12-timmars ljus / mörk cykel, med konstant temperatur på 22 ° C (± 2 ° C) och fuktighet på 55% (± 10%). Djuren är försedda med standard chow och vatten ad libitum. Djuren hålls i enskilda burar efter operationen men kan återföras till gruppbur när ICP-sonden har tagits bort. Narkosmedlet i detta protokoll är isoflurangas men en 1,5 ml/kg 3:2 intraperitoneal blandning av ketamin (100 mg/ml) och xylazin (20 mg/ml) är också effektfull21.
1. Förberedelser
- Ändra en 16 G perifer venkateter för intubation. För att modifiera, förkorta nålen med 1 cm och böj den återstående distala 1 cm x 30° mot injektionsventilen. Ta bort katetervingarna (flergång).
- För att göra en ICP-sond, skär en 20 mm bit polyetenrör (innerdiameter (ID): 0,58 mm, ytterdiameter (OD): 0,96 mm) och bränn ena änden för att göra en cirkulär platta och håll en öppen lumen. Kringgå polyetenslangen med 1 mm silikonslang (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm) innan du ansluter 10 mm silikonslang (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) till änden av polyetenslangen.
- Slå på den bärbara datorn och öppna datainsamlingsprogramvaran. Kalibrera blodtrycks- (BP) och intracerebralt tryck (ICP) och laserdopplern enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered blodgasanalysatorapparaten.
VARNING: Se till att det finns tillräckligt med isofluran i vaporizern. - Slå på O2 och atmosfäriskt luftflöde. Ställ in flödet avO2 på 30% och atmosfärisk luft på 70%.
- Placera värmedynan och ställ in temperaturen på 37 °C.
2. Bedövning
- Placera råttan i anestesikammaren med ett flöde av 30%O2 och 70% atmosfärisk luft. Administrera 5% isoflurangas in i kammaren. Tillräcklig anestesi tar cirka 4 min. Kontrollera andningen noggrant.
- När den bedövas, placera råttan i ryggläge på en tung platta som kringgås av ett gummiband. Placera råttans framtänder under gummibandet.
- Dra försiktigt ut tungan med böjda pincett. Rengör struphuvudet med en bomullsspets. Placera ett yttre ljus i mitten av halsen för att visualisera stämbanden.
- Intubera under inspiration med den modifierade 16 G perifera venkatetern. När du är korrekt isatt, ta bort stiletten. Anslut katetern till ventilatorn.
OBS: Korrekt placering av röret bekräftas av bröströrelser synkroniserade med andningsfrekvensen. Om rörelser i buken ses, extubera och återinföra råttan i anestesiklockan. Upprepa inte proceduren mer än tre gånger på grund av risken för skador på luftvägarna. - Vid intubering, håll djuret på konstgjord andning med 30%O2 och 70% atmosfärisk luft. Håll anestesin vid 1,5% -3% isofluran. Justera isofluran för att hålla blodtrycket mellan 80-100 mmHg.
- Håll andningsskyddets inandningsvolym på 3 ml och frekvensen på 40-45 inspirationer/min. Justera inandningsvolymen enligt blodgasanalysen.
- Gör ett stygn genom kindens inre mjukvävnad med en 2-0 sutur. Bind suturen runt injektionsröret och injektionsventilen i perifer venkateter för att fästa katetern.
- Flytta råttan till operationsfältet och placera den i ryggläge med svansen vänd mot kirurgen.
- Applicera ögongelen vid behov för att motverka torra ögon.
- Utför en tåknäpa för att bekräfta ett tillräckligt djup av anestesi. Bedöm och behåll anestesidjupet under operationen.
3. Svanskateter
- Desinficera den proximala 3-4 cm av svansen med 0,5% klorhexidinetanol.
OBS: Från och med nu, använd det kirurgiska mikroskopet efter kirurgens gottfinnande. - Gör ett 15-20 mm hudsnitt i den proximala änden av svansen på den ventrala sidan. Var försiktig så att du inte snittar artären.
- Lossa huden från den underliggande bindväven med hjälp av en krökt pincett.
- Penetrera försiktigt fascia som exponerar artären.
- Släpp försiktigt svansartären från den underliggande vävnaden med hjälp av en krökt pincett.
- Släpp tre svarta silketrådar under kärlet. Placera en tråd så distalt som möjligt och knyt en kirurgisk knut tätt runt artären. Håll trådens lösa ändar med en hemostat.
- Bind de två återstående trådarna löst runt artären.
- Tryck den proximala tråden så nära som möjligt. Applicera en hemostat för att hålla ändarna på den proximala tråden. Dra hemostaten lätt, men tillräckligt för att begränsa och blockera blodflödet. Placera hemostaten på buken.
- Skär kateterns spets i 45° vinkel. Skär den skarpa punkten för att förhindra penetration av artärväggen.
- Använd en Vannas sax, gör ett artärsnitt 1/3 av artärens diameter i 30 ° vinkel, 3-5 mm från den distala knuten.
- Sätt in katetern i artären med två raka pincett. Använd en pincett för att hålla katetern och den andra för att försiktigt dra artären över katetern.
- Sätt in katetern upp i kärlet till den proximala knuten och lossa knuten från hemostaten. Visualisera blodflödet i katetern. Fäst mitttråden löst på katetern.
- Fortsätt insättningen till, och om möjligt, strax bortom, den punkt där artären täcks igen av fascia.
- Kontrollera kateterns placering och eventuellt läckage genom att spola med saltlösning.
- Fäst de två proximala trådarna med kirurgiska knutar.
OBS: Blodtrycksmätningen måste vara pulserande; Om inte, är katetern inte korrekt placerad. - Fäst katetern i slutet av snittet genom att binda en kirurgisk knut med den distala tråden.
- Sy ihop hudsnittet löst med två icke-resorberbara 4-0 suturer av monofilament. Var försiktig så att du inte tränger igenom katetern.
OBS: Under hela operationen var medveten om amplituden av pulsering. Om detta är lågt, spola katetern med saltlösning. - Lossa artärkatetern från tryckgivaren för att tillåta blodflöde för blodgasprovtagning. Placera ett mikrokapillärrör i slutet av katetern. Låt blodet strömma in i röret. Sätt tillbaka katetern på givaren efter bloduppsamling och spola katetern.
- Sätt in kapillärröret i blodgasanalysatorn. Mät pH, pCO2 och pO2 och notera dem
OBS: Beroende på blodgas och blodtrycksvärden, ändra ventilationshastigheten. Om det genomsnittliga arteriella trycket (MAP) är för lågt, försök att sänka flödet av isofluran. Testa reflexerna för att säkerställa korrekt anestesidjup.
4. ICP-sond
- Placera råttan i den stereotaxiska ramen. Det är viktigt att placera råttan symmetriskt.
- Placera en cylindrisk kudde under den stereotaxiska ramen för att skapa främre flexion i nacken.
- Raka råttans hårbotten, nacke och området bakom öronen. Ta bort det överflödiga håret.
- Desinficera området med 0,5% klorhexidinetanol.
- Bedöva lokalt med 0,7 ml 10 mg / 5 μg / ml lidokain med adrenalin, sätt in nålen vid den kaudala änden av skallen i mittlinjen. Injicera i muskulaturen i nacken med 0,3-0,4 ml. Injicera resten subkutant runt och främre till bregma.
- Gör ett hudsnitt från nålpunkteringen ~ 8 mm kaudalt i mittlinjen.
- Dissekera alla muskler rakt på sak i lager för att identifiera atlantooccipitalmembranet (marmorfärgad triangel kaudalt till skallen i mittlinjen).
- Använd Alm-upprullaren för att hålla fast nackmuskulaturen. Placera upprullningsdonet saudalt om det behövs.
- Kontrollera om den sterila ICP-sonden är ansluten till ICP-givaren. Spola ICP-sonden med saltlösning. Se till att inga luftbubblor finns i ICP-sonden.
- Skär atlantooccipitalmembranet med en 23 G nål. Gör ett hål för att lirka ICP-sonden genom membranet.
- Locka sonden försiktigt genom atlantooccipitalmembranet. Dra sonden lätt och se till att den visar en pulserande kurva som sträcker sig mellan 0-5 mmHg. Om inte, ta bort sonden, kontrollera anslutningen till givaren och bekräfta flödet genom lumen.
- Applicera två droppar av vävnadslimmet. Flytta 1 mm silikonslangen framåt till membranet och applicera ytterligare lim för att minimera risken för ICP-sondförskjutning.
- Ta bort upprullningsdonet/upprullningsdonen.
- Gör en horisontell madrasssutur till snittets cephaliska ände och en enkel avbruten sutur till den kaudala änden med en icke-resorberbar monofilament 4-0 sutur.
5. Placering av nålen och laserdopplersonden
- Gör ett snitt i mittlinjen precis framför ögonen, 15 mm kaudalt.
- Ta bort bindväven och musklerna med pincett. Använd änden av en steril bomullspinne som en rougine som gör det möjligt att identifiera bregma och koronala suturer.
- Placera Alm-upprullningsdonet.
- Placera en 25 G spinalnål i den stereotaktiska ramen. Placera nålen exakt på bregma och notera positionen.
OBS: Placera mittlinjen på den stereotaxiska ramen vid 30 ° mot djuret i vertikalplanet. - Ta bort nålen från bregma, flytta ramen 65 mm framåt och sätt sedan tillbaka nålen i mittlinjen för att markera borrplatsen.
- Borra tills dura mater identifieras under benet. Ta försiktigt bort benfragmenten med raka pincett och fyll hålrummet med benvax.
- Borra ett annat hål 3-4 mm lateralt till höger om bregma och precis framför koronalsuturen för Laser-Doppler. Det är inte nödvändigt att borra hela vägen genom benet. Var försiktig så att du inte tränger igenom dura materen.
- Leta efter kärlen där laserdopplern kan mäta blodflödet. Placera laserdopplern och kontrollera värdena. Ett minimivärde på 100 FU krävs. Ta bort mikroskopet (artificiellt ljus).
- Om värdena fortfarande är acceptabla, tillsätt en droppe lim för att fixa sonden.
- Kontrollera igen om värdet är över 80 FU. Om värdet är under 80 FU tar du bort och flyttar avsökningen så att den når ett värde över 80 FU.
OBS: Värdet, FU, är en godtycklig enhet som visar cerebralt blodflöde (CBF).
6. Induktion av SAH
- Sätt in nålen försiktigt genom skallen i mittlinjen mellan halvkärmen tills motståndet från skallbasen känns. Dra in nålen med 1 mm för att säkerställa korrekt placering precis framför den optiska chiasmen.
- Vrid nålen 90° medurs så att nålspetsen pekar åt höger för att säkerställa det mest homogena resultatet vid injektion av blodet. Ta bort stiletten (figur 3).
- Balansera i 15 minuter och justera anestesinivån för att erhålla ett genomsnittligt arteriellt blodtryck i intervallet 80-100 mmHg.
- Utför en blodgasanalys. Justera anestesinivån i enlighet därmed.
- Dra upp 500 μl blod från svanskatetern med en 1 ml spruta med en trubbig 23 G nål.
- Fyll det döda utrymmet i ryggmärgsnålkammaren med blod för att undvika injektion av luft. Ta bort 23 G nålen från den blodfyllda sprutan och bekräfta att sprutan innehåller 300 μl blod.
- Anslut sprutan till ryggmärgsnålen. Ta ett fast grepp och injicera blodet manuellt för att överträffa MAP.
- Observera en brant ökning av ICP och ett brant fall i CBF på den bärbara datorn.
OBS: CBF bör vara 50% eller lägre jämfört med baslinjepoängen i minst 5 minuter för att operationen ska lyckas, se figur 4. Sham råttor genomgår inte stegen 6.1-6.7, vilket utelämnar införandet av ryggradsnålen i storhjärnan, vilket minimerar eventuell spontan blödning och iatrogen hjärnskada.
7. Återhämtning och uppvaknande
- Administrera 0,1 ml/100 g djurvikt av 5,0 mg/ml karprofen och 1 ml/100 g djurvikt isoton saltlösning subkutant. Se till att vätskorna är minst vid rumstemperatur innan de administreras.
- Håll sedan råttan under anestesi i 30 minuter efter SAH.
- Ta bort nålen, laserdopplersonden och fyll sedan hålrummen med benvax. Stäng snittet med två horisontella madrasssuturer med icke-resorberbar monofilament 4-0 sutur.
- För att använda ICP-sonden för injektioner i cisterna magna, ta bort silikonslangen och sätt in en exakt adapter i polyetenslangen.
- Om inget ingrepp är planerat, klipp den enkla, avbrutna suturen. Förkorta ICP-sonden så mycket som möjligt med en sax och lim sedan änden för att förhindra läckage av cerebrospinalvätska (CSF). Stäng snittet med en icke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Ta bort råttan från den stereotaxiska ramen och placera den i ryggläge. Ta bort de lösa suturerna från svanssnittet.
- Placera en enda sutur proximalt och djupt till artärkatetern. Ta bort katetern och binda suturen för att förhindra blödning. Suturera svanssnittet med en icke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Stäng av isofluran.
- Rengör råttan och dess päls så mycket som möjligt.
- När pedalabstinensreflexen återfås och råttan har spontan andning när den är frikopplad från ventilatorn, extubera den.
- Placera råttan i en enda bur med mat och vatten ad libitum. Placera hälften av buret under en värmeplatta och placera råttan i detta område av buret.
- Utför intratekal administrering genom att anpassa pinportinjektorn till en precisionsspruta och administrera behandlingen via pinportadaptern. Detta ingrepp är genomförbart hos djur som är vakna. Se figur 5.
8. Borttagning av ICP-sond (om den inte tas bort under operation)
OBS: Använd ett kirurgiskt mikroskop efter kirurgens gottfinnande.
- Placera råttan i anestesikammaren som beskrivits tidigare.
- När den bedövas, placera råttan i ryggläge i operationsfältet med värmedyna.
- Placera näsan i anestesimasken. Ställ in nivåerna påO2 till 30%, atmosfärisk luft till 70% och isofluran till 2%.
- Applicera ögongelen kontinuerligt för att motverka torra ögon.
- Skär den kaudala enkla avbrutna suturen. Öppna snittet och ta bort eventuell nekrotisk vävnad eller blodproppar.
- Förkorta ICP-sonden så mycket som möjligt med en sax och lim änden för att förhindra läckage av cerebrospinalvätska (CSF). Stäng snittet med en icke-absorberbar monofilament 4-0 sutur.
- Stäng av isofluran.
- När råttan börjar röra sig, placera den i en enda bur med mat och vatten ad libitum. Placera hälften av buret över en värmeplatta och placera råttan i detta område.
- När djuren återgår till vanligt tillstånd, återinsätt djuren i en gemensam bur under övervakning under de första 15 minuterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvinnor har en ökad risk för aSAH jämfört med män. Trots detta används manliga gnagare främst i experiment på grund av möjlig bias från heterogenitet av estruscykeln hos kvinnor. De representativa resultaten som presenteras här är från en nyligen publicerad publikation som jämför hon- och hanråttor, vilket bekräftar att modellen ger liknande resultat hos hondjur jämfört med hanråttor21. Studien omfattade 34 kvinnliga Sprague-Dawley-råttor (18 SAH och 16 shams). Shams hade inte ryggradsnålen nedsänkt till optisk chiasm eller blod injicerat. Alla andra procedurer utfördes på Shams identiska med SAH. Alla fysiologiska parametrar mellan grupperna var jämförbara. Slutligen gjordes en metaanalys av data från tidigare experiment på hanråttor och jämfördes med resultaten från den aktuella studien21.
Det roterande poltestet är ett test av grov sensorimotorisk funktion. Djuren placeras i ena änden av en 150 cm med 45 mm stolpe, som kan rotera upp till 10 rpm. Målet är att nå den bortre änden av stången där en bur är placerad. SAH-råttor gjorde signifikant sämre på dag 1 och 2, jämfört med skendjur på den roterande polen (figur 1).
Efter SAH uppregleras både ET-1- och 5-HT-receptorfamiljen i hjärnartärerna vilket resulterar i en ökad sammandragning när den stimuleras och därmed bidrar till CVS22,23. Basilärartären (BA) och mellersta cerebrala artärer (MCA) avlägsnades efter halshuggning och användes för myografexperiment. Både endotelin 1 (ET-1), en agonist för ET-1-receptorfamiljen och 5-karboxamidotryptamin (5-CT), en agonist för 5-HT-receptorfamiljen, gav signifikant ökad vaskulär kontraktion i SAH jämfört med sham (figur 2). Känslighet kan observeras av de lägre koncentrationer som behövs för att framkalla sammandragning efter SAH hos båda könen.
Ökad vattenhalt (ödem) efter SAH är ett mått på minskat funktionellt utfall hos människa24. Signifikant ökat hjärnödem hittades i SAH jämfört med sham på dag 2. Det fanns också en tendens till ökat ödem i hippocampus, men detta var inte statistiskt signifikant (p = 0,0508)21.
När man jämför ovan nämnda data med historiska manliga data är resultaten jämförbara. Metadata visar ökad kontraktilitet hos manliga SAH efter tillägg av ET-1 eller 5-CT (figur 2). Dessutom presterade SAH-råttorna signifikant sämre jämfört med shams när de gjorde det roterande poltestet. Resultatet indikerade en minskad sensomotorisk funktion (figur 1).
Figur 5A visar fördelningen av det autologa, injicerade blodet efter saltlösning 30 minuter efter induktion av SAH. Figuren visar att blodet har distribuerats i subaraknoidalrummet efter pre-chiasmatisk injektion.
Figur 5B och figur 5C visar fördelningen av intratekalt injicerade färgämnen, följt av helkroppsperfusion av saltlösning i 30 minuter efter injektionen. Figur 5B visar fördelningen av 25 μL av 20 mM Evans Blue (vattenlöslig) och figur 5C visar fördelningen av 25 μL av 10 mM Oil Red O (vatten olösligt). Båda färgämnena visade sig distribueras i subaraknoidalrummet efter injektionen i cisterna magna, vilket bekräftar att detta är en genomförbar modell för intratekal injektion av både vattenlösliga och olösliga föreningar. Värt att notera är bildandet av avlagringar runt artärerna för den vattenolösliga föreningen.
Figur 1: Analys av sensorisk-motorisk kognition under de första 2 dagarna efter SAH hos han- och honråttor. Roterande poltest utfördes dag 1 och dag 2 efter SAH. Råttor av båda könen hade signifikanta underskott jämfört med skamdrivna råttor av samma kön. Statistiska skillnader i beteende mellan grupper testades med 2-vägs ANOVA dag 0, dag 1 och dag 2. Hona ingen rotation och 3 rpm: p < 0,05. Hona 10 rpm och alla manliga data: p < 0,01. Värden är medel ± SEM. Återpublicerad med tillstånd från Spray, S. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av ökad känslighet för ET-1 och 5-CT-inducerade sammandragningar i basilärartären (BA) och mellersta cerebrala artären (MCA) 2 dagar efter SAH hos han- och honråttor . (A,B) 60 mM K+-framkallade (K+max) kontraktila svar användes som referensvärden för normalisering av agonistinducerade svar. Känsligheten för ET-1 ökade signifikant 2 dagar efter SAH jämfört med bluffopererade råttor av samma kön i både BA och MCA. (C,D) Känsligheten för 5-CT ökade signifikant 2 dagar efter SAH jämfört med bluffopererade råttor av samma kön i både BA och MCA. Koncentrations-responskurvorna jämfördes statistiskt med tvåvägs ANOVA. Alla uppgifter: p < 0,001. Värden är medel ± SEM. Återpublicerad med tillstånd från Spray, S. et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Översikt över installationen före induktion av SAH. Observera från toppen av bilden att 1) injektionsnålen, 2) laserdopplersonden och 3) ICP-sonden är alla på plats. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Provspår efter intratekal injektion. Den röda grafen visar blodtrycket i mmHg. Den blå grafen visar ICP i mmHg och den gröna grafen visar CBF i den godtyckliga enheten FU. Spiken i ICP är resultatet av blodinjektion. Observera att detta resulterar i en minskning av CBF > 50% av baslinjen i mer än 5 minuter. ICP-ökningen resulterar dessutom i en liten ökning av blodtrycket som normaliseras inom några sekunder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Fördelning av intratekalt injicerat blod och färgade färgämnen . (A) Distribution av autologt blod 30 min efter SAH-induktion. (B) Fördelning av 25 μl 20 mM Evans Blue efter intratekal injektion genom ICP-kateter. c) Fördelning av 25 μl 10 mM Oil Red O efter intratekal injektion genom ICP-kateter. Alla djur bedövades med intraperitoneal ketamin/xylazinblandning följt av saltlösningsperfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den pre-chiasmatiska enda injektionsmodellen av SAH efterliknar flera viktiga delar av human SAH, inklusive spiken i ICP, minskning av CBF, övergående global ischemi, uppreglering av neuroinflammatoriska markörer och CVS 14,15,16,18,19,20. ICP-sonden användes också som en port för intratekal administrering (figur 5). Vidare visar studien att modellen presterar på liknande sätt hos han- och hondjur21. Modellen inkluderar inte utvecklingen av och den efterföljande bristningen av en aneurysm. En rad modeller har försökt producera SAH från en brusten aneurysm genom induktion av systemisk hypertoni antingen kirurgiskt eller farmakologiskt och genom att försvaga artärväggen med elastas25,26,27. Alla försök har producerat aneurysmal SAH i en delmängd av djur, men dessa modeller har en inneboende variabilitet inklusive oförmågan att förutsäga när aneurysmen kommer att brista. Modellerna är inte särskilt lämpliga för preklinisk forskning på SAH18,28.
Bland andra murin-, SAH-modeller innefattar den endovaskulära perforeringsmodellen brottet av ett kärl, något som efterliknar brottet av en aneurysm, men utsatt för hög variabilitet och dödlighet. Modellen som beskrivs här är bättre spårbar och mer reproducerbar eftersom blodvolymen är förutbestämd och injektionstrycket kan kontrolleras. Dubbelinjektionsmodellen har en högre sannolikhet att producera fördröjd CVS, men påverkar främst den bakre cirkulationen och inkluderar en ofysiologisk andra blodinjektion. I jämförelse liknar denna modell SAH hos människor eftersom det är en enda injektion av den främre cirkulationen och den producerar en reproducerbar ICP-ökning18.
Påverkan av olika anestesiregimer på experimentell SAH är oklar och experimentella data är motsägelsefulla. En studie rapporterade möjlig hämning av cytokiner och allmän neuroinflammation i en endovaskulär perforationsmodell hos möss vid användning av isofluraninhalationer29. En annan gnagarmodell resulterade i minskade andningsparametrar och ökat hjärnödem tillsammans med minskad regional CBF vid användning av isofluraner30. En metaanalys som jämförde mortalitet i musmodeller visade dock ingen skillnad i mortalitet mellan isofluran och andra typer av anestesi31. I överensstämmelse har ovanstående protokoll framgångsrikt använt antingen isofluran inhalation eller en intraperitoneal ketamin/xylazinblandning med liknande resultat i båda grupperna21.
För att säkerställa hög reproducerbarhet och korrekt datainsamling ligger den övergripande tonvikten på stegen för placering av övervakningsutrustningen. Korrekt placering av svanskatetern underlättar kontinuerlig övervakning av blodtryck och förmågan att göra blodgasanalyser. Korrekt placering av ICP-katetern säkerställer korrekt ICP-övervakning och efterföljande möjlighet till intratekal intervention. Lämplig placering av laserdopplersonden säkerställer att minskningen av CBF kan övervakas, där en minskning med 50% eller lägre av baslinjepoängen i minst 5 minuter efter SAH-induktion säkerställer en stark ischemi32. Genom att säkerställa att alla övervakningssteg är i ordning kan forskaren säkerställa korrekt datainsamling efter SAH-induktionen.
Protokollet beskriver den pre-chiasmatiska enda injektionsmodellen av subaraknoidalblödning med uppdateringar och modifiering. Modellen har varit värdefull för SAH-forskningen och kommer sannolikt att fortsätta bidra till en bättre förståelse av subaraknoidalblödning, inklusive tidig hjärnskada och fördröjd cerebral ischemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att deklarera.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av Lundbeck Foundation och Lundbeck Grant of Excellence (nr. R59-A5404). Finansiärer hade ingen roll i någon del av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G peripheral vein catheter | BD Venflon | 393229 | Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed |
| Anesthesia bell/ chamber | Unknown | ||
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL80 | |
| Blood pressure (BP) monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Curved forceps, 12 cm x 3 | F.S.T | 11001-12 | For anesthesia |
| Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm | Homemade | Made from surgical towels | |
| Data acquisition hardware | Adinstruments | ML870 Powerlab | |
| Data acquistion software | Adinstruments | LabChart 6.0 | |
| Drill | KMD | 1189 | |
| Drill controller | Silfradent | 300 IN | |
| Flexible light | Schott | KL200 | |
| Heating pad | Minco | 1135 | |
| Hypodermic needle, 20 G | KD Medical | 301300 | Connects to stereotaxic frame |
| ICP monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | TEC3 | |
| Laptop | Lenovo | T410 | |
| Laser doppler monitor | Adinstruments | ML191 | |
| Laser doppler probe | Oxford Optronics | MSF100XP | Connects to laser doppler monitor |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | For anesthesia |
| Precision syringe, 0.025 mL | Hamilton | 547407 | |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | M900 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss | F170 | |
| Suture needle | Allgaier | 1245 | For anesthesia |
| Temperaure controller | CWE,INC. | TC-1000 | |
| Transducer x 2 | Adinstruments | MLT0699 | Connects to BP and ICP monitor |
| Ventilator | Ugo Basile | 7025 | |
| Veterinary clipper | Aesculap | GT421 | |
| 3-pronged Blair retractor, 13.5 cm | Agnthos | 17022--13 | |
| Blunt Alm retractor | F.S.T | 17008-07 | |
| Curved forceps, 12 cm x 2 | F.S.T | 11001-12 | |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | |
| Straight Dumont forceps, 11 cm | F.S.T | 11252-00 | |
| Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2 | F.S.T | 13008-12 | |
| Straight Iris scissor, 9 cm | F.S.T | 14090-09 | |
| Straight Vannas scissor, 10.5 cm | F.S.T | 15018-10 | |
| Absorpable swabs | Kettenbach | 31603 | |
| Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm | Vömel | 14757 | |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | |
| Carbomer eye gel 2 mg/g | Paranova | ||
| Cotton swab | Heinz Herenz | WA-1 | |
| Cotton tipped applicator x 4 | Selefa | 120788 | |
| Hypodermic needle, 23 G x2 | KD Medical | 900284 | Connects to stopcock. Remove distal end |
| Hypodermic needle, 23 G x3 | KD Medical | 900284 | Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe |
| ICP probe: | Homemade | Made of the following: | |
| Polythene tubing, 20 mm | Smiths medical | 800/100/200 | Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm. |
| Silicone tubing, 10 mm | Fisher | 15202710 | ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm. |
| Silicone tubing, 2 mm | Fisher | 11716513 | ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm. |
| Micro hematocrit tubes | Brand | 7493 11 | |
| OP-towel, 45 cm x75 cm | Mölnlycke | 800430 | |
| PinPort adapter, 22 G | Instech | PNP3F22 | |
| PinPort injector | Instech | PNP3M | |
| Polythene tubing, 2 x 20 cm | Smiths medical | 800/100/200 | Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm. |
| Rubberband | Unknown | ||
| Scalpel, 10 blade | Kiato | 23110 | |
| Spinalneedle, 25 G x 3.5'' | Braun | 5405905-01 | |
| Stopcock system, Discofix x 2 | Braun | 16494C | Connects to transducer |
| Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3 | Ethicon | EH7145H | |
| Syringe, 1 mL | BD Plastipak | 1710023 | |
| Syringe, luer-lock, 10 mL x 4 | BD Plastipak | 305959 | Connects to transducer |
| Tissue adhesive glue | 3M | 1469SB | |
| 0.5% Chlorhexidine spirit | Faaborg Pharma | 210918 | |
| Carprofen 50 mg/mL | ScanVet | 43715 | Diluted 1:10 |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isotonic saline | Amgros | 16404 | |
| Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL | Amgros | 16318 |
References
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), London, England. 306-318 (2007).
- de Rooij, N. K., Linn, F. H. H., vander Plas, J. A., Algra, A., Rinkel, G. J. E. Incidence of subarachnoid haemorrhage: a systematic review with emphasis on region, age, gender and time trends. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (12), 1365-1372 (2007).
- Feigin, V. L., Lawes, C. M., Bennett, D. A., Barker-Collo, S. L., Parag, V. Worldwide stroke incidence and early case fatality reported in 56 population-based studies: a systematic review. The Lancet, Neurology. 8 (4), 355-369 (2009).
- Maher, M., Schweizer, T. A., Macdonald, R. L. Treatment of spontaneous subarachnoid hemorrhage: guidelines and gaps. Stroke. 51 (4), 1326-1332 (2020).
- Pickard, J. D., et al. Effect of oral nimodipine on cerebral infarction and outcome after subarachnoid haemorrhage: British aneurysm nimodipine trial. British Medical Journal (Clinical Research ed.). 298 (6674), 636-642 (1989).
- Daou, B. J., Koduri, S., Thompson, B. G., Chaudhary, N., Pandey, A. S. Clinical and experimental aspects of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. CNS Neuroscience and Therapeutics. 25 (10), 1096-1112 (2019).
- Fujii, M., et al. Early brain injury, an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research. Translational Stroke Research. 4 (4), 432-446 (2013).
- Roos, Y. B., et al. Complications and outcome in patients with aneurysmal subarachnoid haemorrhage: A prospective hospital based cohort study in the Netherlands. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 68 (3), 337-341 (2000).
- Vergouwen, M. D. I., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Brown, R. J., Kumar, A., Dhar, R., Sampson, T. R., Diringer, M. N. The relationship between delayed infarcts and angiographic vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 72 (5), 702-707 (2013).
- Dhar, R., et al. Relationship between angiographic vasospasm and regional hypoperfusion in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 43 (7), 1788-1794 (2012).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews. Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Svendgaard, N. -A. A new experimental model in rats for study of the pathophysiology of subarachnoid hemorrhage. Neuroreport. 13 (18), 2553-2556 (2002).
- Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
- Prunell, G. F., et al. Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Cerebral blood flow and brain metabolism during the acute phase in three different models in the rat. Neurosurgery. 54 (2), 426-437 (2004).
- Velthuis, B. K., et al. Subarachnoid hemorrhage: Aneurysm detection and preoperative evaluation with CT angiography. Radiology. 208 (2), 423-430 (1998).
- Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Inflammation in the brain after experimental subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 56 (5), 1082-1091 (2005).
- Prunell, G. F., Svendgaard, N. A., Alkass, K., Mathiesen, T. Delayed cell death related to acute cerebral blood flow changes following subarachnoid hemorrhage in the rat brain. Journal of Neurosurgery. 102 (6), 1046-1054 (2005).
- Spray, S., Haanes, K. A., Edvinsson, L., Johansson, S. E. Subacute phase of subarachnoid haemorrhage in female rats: increased intracranial pressure, vascular changes and impaired sensorimotor function. Microvascular Research. 135, 104127 (2020).
- Ansar, S., Vikman, P., Nielsen, M., Edvinsson, L. Cerebrovascular ETB, 5-HT1B, and AT1 receptor upregulation correlates with reduction in regional CBF after subarachnoid hemorrhage. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), 3750-3758 (2007).
- Hansen-Schwartz, J., et al. Subarachnoid hemorrhage enhances endothelin receptor expression and function in rat cerebral arteries. Neurosurgery. 52 (5), 1188-1194 (2003).
- Hayman, E. G., Wessell, A., Gerzanich, V., Sheth, K. N., Simard, J. M. Mechanisms of global cerebral edema formation in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurocritical Care. 26 (2), 301-310 (2017).
- Miyata, H., et al. Vasa vasorum formation is associated with rupture of intracranial aneurysms. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2019).
- Tada, Y., et al. Roles of hypertension in the rupture of intracranial aneurysms. Stroke. 45 (2), 579-586 (2014).
- Nuki, Y., et al. Elastase-induced intracranial aneurysms in hypertensive mice. Hypertension. 54 (6), Dallas, Tex. 1337-1344 (1979).
- Marbacher, S., Wanderer, S., Strange, F., Grüter, B. E., Fandino, J. Saccular aneurysm models featuring growth and rupture: A systematic review. Brain Sciences. 10 (2), 101 (2020).
- Altay, O., et al. Isoflurane on brain inflammation. Neurobiology of Disease. 62, 365-371 (2014).
- Hockel, K., Trabold, R., Schöller, K., Török, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4 (1), 5 (2012).
- Kamp, M. A., et al. A Systematic and meta-analysis of mortality in experimental mouse models analyzing delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Translational Stroke Research. 8 (3), 206-219 (2017).
- Povlsen, G. K., Johansson, S. E., Larsen, C. C., Samraj, A. K., Edvinsson, L. Early events triggering delayed vasoconstrictor receptor upregulation and cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. BMC Neuroscience. 14, 34 (2013).
