A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi
Chapters
Summary April 25th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi introducerer her en procedure til måling af protein oligomerer og sammenlægning i celle lysat og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi.
Transcript
Det bedste princip i Fluorescenskorrelationsspektroskopi, FCS, blev oprindeligt opfundet i 1970'erne. I 1990'erne blev der etableret vigtige og mange forbedringer for FCS ved at kombinere med en konfokal apparatmikroskopi. Siden da har FCS været brugt til mange kemiske og virus helbrede applikationer, såsom molekylære interaktioner og protein sammenlægning analyse.
Proteinsammenlægning er kendetegnende for neurodegenerative lidelser. Lysstyrken lysstyrke er enkelte partikler i virkning af molekylære størrelser forklaret af diffusion egenskaber. Det er meget vigtigt at måle proteinsammenlægninger, fordi det kan bestemme forventede livscyklus for molekyler, men også skelne mellem homo eller hetero polymerisering.
Her introducerer vi en procedure til måling af diffusion af amyotrofisk lateral sklerose forbundet med aggregeret formprotein ved hjælp af FCS i cellelysater og levende celler. Forbered 100 millimeter plast parabol voksende Neuro2a celle sidder komfortabelt i den normale vækst medium. Bekræft cellekonfluens.
Fjern mediet. Tilsæt 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-opløsning i den tredje patronskål og inkuber dem ved 37 grader celsius i et minut. Tilsæt 9,5 milliliter normal vækst medium i fadet og suspendere dem.
Celleaffjedringen blandes med trypanblå for at plette de døde celler. Føj affjedring til celleoptællingsdiaset. Tæl antallet af celler ved hjælp af celletælleren, eller manuelt.
Tjek det levende cellenummer og deres levedygtighed. Cellen fortyndes i det optalte medium ved 1,0 gange 10 til en effekt på 5 pr. milliliter. Tilsæt to milliliter celleaffjedring i 35 millimeter plastfad til celle lysis eller vækstrumsskål til måling af levende celler.
Inkuber skålen ved 37 grader celsius i en dag. Den næste dag skal du forberede blandingen af plasmid DNA og transfekturereagenserne. Tilsæt transfektblandingen til det celleoptalte medie, og inkubter cellerne i 24 timer.
En dag senere. Kontroller GFP-udtrykket ved hjælp af et rutinemæssigt mikroskop. Du kan se de meget lyse TDP25 ingrediens organer i celler.
Celle lysis skal udføres på den biokemiske bænk. Fjern mediet i skålen. Tilsæt to milliliter PBS ved 25 grader celsius for at vaske som et medium.
Fjern PBS. Placer skålen på en aluminium plade på toppen af den knuste is. Tilsæt straks 200 mikroliter lysis bufferen i skålen.
Skrab skålen ved hjælp af en celleskraber. Gendan lysatet med uopløste cellerester i et nyt 1,5 millimeter rør. Centrifuge lysatet ved fire grader celsius.
Til målinger af levende celler skal mediet udskiftes med et nyt før målingen. Kontroller den vedhæftede fil i cellen ved hjælp af et mikroskop med fasekontrast. Kontroller også GFP-udtrykket ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
Brug et confocal mikroskop-kombineret FCS-system. Tænd for 488 nanometerlaseren. Stabilisere systemet, i det mindste, i 30 minutter.
Konfigurer den optiske sti. Brug en 488 nanometer laser til det øjeblikkelige lys. Brug en passende stråle splitter og dichroic meter.
Og også fluorescens fusers. Normalt bruger vi coverglaskamre til kalibrering og løsningsmålinger. Forsigtigt, tage coverglass kammer.
Placer glasoverfladen på linsescreeningspapiret. Hæld FCS kalibrering. Tilsæt også Rhodamine 6G-opløsningen.
Tilsæt ultrapure vand på målet. Brug ikke olien. Sæt kammeret på mikroskop scenen.
Flyt stadiet til den relevante position. Opret justeringen af pinhole, og åbn guiden til justering af pinhole. Overvåg fotontællingshastigheden som grov bevægelse af pinhole for x-retningen.
Den lyseste position blev med rette bestemt. Derefter skal du overvåge fotontællingshastigheden som fin bevægelse. Den lyseste position blev bestemt Med succes Dette er pinhole position for x-retning.
På samme måde skal du søge i pinholets lyseste position efter y-direction. Den lyseste position for y-direction blev også med succes bestemt. Sammensatte x og y position pinhole.
Det er bedre at justere pinhole position før hver dags måling. Når den strømførende sti ændres, skal pinhole-positionen justeres igen. Opret en optællingsrate, og overvåg telefontællingsfrekvensen.
Skift til CPM-overvågningstilstand. Tæl rettelsesringen for det objekt, du kørte, så CPM-værdien er den højeste. Luk vinduet optællingshastighed.
Start med Rhodamine 6G-opløsningsmålingen. Når målingen er fuldført, skal du klikke på for at udføre kurvetilpasningsanalyse. Vælg en model til tilpasning af den gamle korrelationsfunktion.
For Rhodamine 6G skal du vælge modellen for 1-komponent, 3-dimensionel diffusion med en triplet tilstand. Indstil starttidspunktet for tilpasningen ved at flytte den røde linje. Klik på Tilpas til alle for at starte tilpasningsberegningen.
Kontroller tilpasningsafvigelsen. Sørg for, at siderne er udstationeret og negative, omkring nul. Kontroller de monterede værdier.
Sørg for, at diffusionstiden er omtrent i intervallet fra 20-30 mikrosekunder. Desuden er strukturelle parametre fra fire til otte. Åbn tilpasningspanelet, og vælg en model til målingen.
Angiv den samme strukturelle parameterværdi i modellen for eksemplet i fit-panelet. Sørg for, at typen skal angives som Fast. GFP-TDP25 måling i celle lysat.
Placer lysatet i dækglaskammeret. Læg låget på for at undgå udtørring af lysatet. Placer scenelåget for lysskygge.
I anskaffelsespanelet skal du indstille lasereffekten, måletiden og gentagelserne. Start købet. En spike blev observeret.
En spike blev observeret igen. Spiken indikerer lyse molekyler passeret gennem detektionskroppen. Pigge angiver opløselige oligomerer eller aggregater.
Opret en pasform til at udføre kurvetilpasningsanalyse. Vælg modellen til 2-komponent, 3-dimensionel diffusion med triplet tilstand. Indstil starttidspunktet for tilpasningen.
Klik på Tilpas alle. Kontroller de monterede værdier. SOD1-G85R mærket med GFP-måling i en levende celle.
I modsætning til løsningsmåling anbefaler jeg at bruge inkubatoren til varmestadiet. Sæt celle-dyrkning parabol på mikroskop scenen. Bekræft fokus og position ved hjælp af okulær.
Marker en målecelle. Zoom ind, og juster cellepositionen ved hjælp af en hurtig scanningstilstand. Hent øjebliksbilledet af cellerne ved hjælp af tilstanden med langsom scanningshastighed.
Vælg en FCS-måleposition ved hjælp af positionsværktøjet. Trådkorset angiver målepositionen. Start målingen.
Det lille fald i fotontalsrekorden antyder fotobleaching af GFP. Udfør kurvetilpasningen. Repræsentative resultater af GFP-TDP25 i celle lysat er vist.
Den øverste graf en registrering af photon tælle sats. Hvor der er pile er en spike, tyder opløselige oligomerer og aggregater. Den midterste graf repræsenterer den gamle korrelationsfunktion.
Den grå linje viser den lave, gamle korrelationsfunktion. Magentalinjen viser den monterede funktion. De syltede linjer angiver start- og sluttidspunkterne for montering.
Den nederste tabel viser den monterede værdi. Dernæst vises repræsentative resultater af SOD1-G85R-GFP i en levende celle. Den øverste graf repræsenterer en registrering af vores fotontællingsrate.
Det gradvise fald i den registrerede fotontællingsrate blev observeret, hvilket tyder på fotobleaching af GFP-vækst for forskellige målinger. Dette skyldes den langsomme diffusionshastighed i levende celler. Den midterste graf repræsenterer sod1's gamle korrelationsfunktion.
Den grå linje viser den lave, gamle korrelationsfunktion. Magentalinjen viser den monterede funktion. De syltede linjer angiver start- og sluttidspunkterne med montering.
Den nederste tabel viser monterede værdier. Her viser vi dig denne procedure til måling af diffusion fra hver celle associeret TDP-25 i celle lysat og alt mutant af SOD1 i levende celler ved hjælp af FCS. De opløselige oligomerer og sammenlægning i celle lysat kan ofte observeres som pigge eller brister.
På den anden side observeres sådanne pigge i levende celler sjældent, bortset fra muligvis åbenlyse levende strukturer. En langsomt spredende art af mutant SOD1's tilføje gennemsnitlig lysstyrke for enkelte partikler såsom SOD1 homopolymerisering inde for os. Den procedure, der vises her, er enkel og umagen værd.
FCS indeholder ingen stråling;direkte sovende tilstand. Det er bare din og vores fantasi empati.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
