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Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Chapters
Summary April 25th, 2021
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Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.
Transcript
Das beste Prinzip der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, FCS, wurde ursprünglich in den 1970er Jahren erfunden. In den 1990er Jahren wurden wichtige und viele Verbesserungen für FCS durch die Kombination mit einer konfokalen Apparatmikroskopie etabliert. Seitdem wird FCS für viele chemische und Virusheilanwendungen eingesetzt, wie z. B. molekulare Wechselwirkungen und Proteinaggregationsanalysen.
Die Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen. Fluoreszenzhelligkeit sind einzelne Partikel in Aktion molekularer Größen, die durch Diffusionseigenschaften erklärt werden. Es ist sehr wichtig bei der Messung von Proteinaggregationen, weil es projizierte Lebenszyklen von Molekülen bestimmen kann, aber auch die Homo- oder Heteropolymerisation unterscheiden kann.
Hier führen wir ein Verfahren zur Messung der Diffusion von amyotropher Lateralsklerose im Zusammenhang mit aggregiertem Formprotein mit FCS in Zelllysaten und lebenden Zellen ein. Bereiten Sie 100 Millimeter Kunststoffschale wachsen Neuro2a Zelle bequem sitzend im normalen Wachstumsmedium. Bestätigen Sie die Zellkonfluenk.
Entfernen Sie das Medium. Fügen Sie 3,5 Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung in die dritte Patronenschale und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für eine Minute. Fügen Sie 9,5 Milliliter normales Wachstumsmedium in die Schale und suspendieren Sie sie.
Die Zellsuspension wird mit Trypanblau gemischt, um die abgestorbenen Zellen zu färben. Fügen Sie der Zellzählfolie eine Suspension hinzu. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Zellenzähler verwenden, oder manuell.
Überprüfen Sie die Live-Zellennummer und ihre Lebensfähigkeit. Verdünnen Sie die Zelle im gezählten Medium mit 1,0 mal 10 auf die Leistung von 5 pro Milliliter. Fügen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in die 35-Millimeter-Kunststoffschale für Zelllyse oder Wachstumsraumschale für die Live-Zellmessung ein.
Bebrüte das Gericht bei 37 Grad Celsius für einen Tag. Am nächsten Tag die Mischung aus Plasmid-DNA und den Transfektionsreagenzien zubereiten. Fügen Sie die Transfektionsmischung dem zellgezählten Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.
Einen Tag später. Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem Routinemikroskop. Sie können die sehr hellen TDP25 Zutat Körper in Zellen zu sehen.
Die Zelllyse sollte an der biochemischen Bank durchgeführt werden. Entfernen Sie das Medium in der Schale. Fügen Sie zwei Milliliter PBS bei 25 Grad Celsius als Medium zu waschen.
Entfernen Sie die PBS. Legen Sie die Schale auf eine Aluminiumplatte auf der Oberseite des zerkleinerten Eises. Sofort den 200 Mikroliter-Lysepuffer in die Schale geben.
Scrape die Schale mit einem Zellschaber. Das Lysat mit ungelöstem Zellmüll in einem neuen 1,5-Millimeter-Rohr wiederherstellen. Zentrifugieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius.
Ersetzen Sie bei Live-Zellmessungen das Medium vor der Messung durch ein frisches Medium. Überprüfen Sie die Zellbefestigung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Überprüfen Sie auch die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Verwenden Sie ein konfokales, mit Mikroskop kombiniertes FCS-System. Schalten Sie den 488-Nanometer-Laser ein. Stabilisieren Sie das System mindestens 30 Minuten lang.
Richten Sie den optischen Pfad ein. Verwenden Sie einen 488 Nanometer Laser für das sofortige Licht. Verwenden Sie einen geeigneten Strahlsplitter und dichroitische Zähler.
Und auch Fluoreszenz-Fuser. Normalerweise verwenden wir Deckglaskammern für Kalibrierungen und Lösungsmessungen. Nehmen Sie vorsichtig die AbdeckungGlaskammer.
Legen Sie die Glasoberfläche auf das Linsensiebpapier. Gießen Sie die FCS-Kalibrierung. Fügen Sie auch die Rhodamine 6G Lösung hinzu.
Fügen Sie das reines Wasser auf das Ziel. Verwenden Sie das Öl nicht. Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe.
Verschieben Sie die Bühne an die entsprechende Position. Erstellen Sie die Lochanpassung und öffnen Sie den Lochanpassungsassistenten. Überwachen Sie die Photonenanzahl als grobe Bewegung des Lochs für die x-Richtung.
Die hellste Position wurde zu Recht bestimmt. Überwachen Sie als Nächstes die Photonenanzahl als feine Bewegung. Die hellste Position wurde erfolgreich ermittelt Dies ist die Lochposition für x-Richtung.
Suchen Sie auf die gleiche Weise die hellste Position des Lochs nach y-Richtung. Die hellste Position für y-Richtung wurde ebenfalls erfolgreich ermittelt. Die x- und y-Position des Lochs verdichten.
Es ist besser, die Lochposition vor der Messung eines jeden Tages einzustellen. Wenn der Live-Pfad geändert wird, muss die Lochposition erneut angepasst werden. Erstellen Sie eine Zählrate und überwachen Sie die Telefonanzahl.
Wechseln Sie in den CPM-Überwachungsmodus. Zählen Sie den Korrekturring des ausgeführten Objekts, sodass der CPM-Wert der höchste ist. Schließen Sie das Fenster mit der Zählrate.
Beginnen Sie mit der Rhodamine 6G Lösungsmessung. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Anpassung, um die Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen. Wählen Sie ein Modell zum Anpassen der alten Korrelationsfunktion aus.
Wählen Sie für Rhodamine 6G das Modell für die 1-Komponenten-, 3-dimensionale Diffusion mit einem Triplet-Zustand aus. Legen Sie die passende Startzeit fest, indem Sie die rote Linie verschieben. Klicken Sie auf Alle anpassen, um die Anpassungsberechnung zu starten.
Überprüfen Sie die Anpassungsabweichung. Stellen Sie sicher, dass die Seiten gebucht und negativ sind, um Null. Überprüfen Sie die angepassten Werte.
Stellen Sie sicher, dass die Diffusionszeit ungefähr im Bereich von 20-30 Mikrosekunden liegt. Darüber hinaus sind die strukturellen Parameter von vier bis acht. Öffnen Sie das Anpassungspanel, und wählen Sie ein Modell für die Messung aus.
Geben Sie denselben strukturellen Parameterwert in das Modell für das Beispiel im Anpassungsbereich ein. Stellen Sie sicher, dass der Typ als "Fest" festgelegt werden soll. GFP-TDP25-Messung im Zelllysat.
Legen Sie das Lysat in die Deckglaskammer. Legen Sie den Deckel, um das Austrocknen des Lysats zu vermeiden. Stellen Sie den Bühnendeckel für die leichte Schattierung auf.
Legen Sie im Erfassungspanel die Laserleistung, die Messzeit und ihre Wiederholungen fest. Starten Sie die Erfassung. Es wurde eine Spitze beobachtet.
Erneut wurde eine Spitze beobachtet. Die Spitze zeigt helle Moleküle an, die durch den Nachweiskörper geleitet werden. Spikes zeigen lösliche Oligomere oder Aggregate an.
Erstellen Sie eine Anpassung, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen. Wählen Sie das Modell für die 2-Komponenten- 3-dimensionale Diffusion mit Triplet-Zustand aus. Legen Sie die Anfangszeit des Fittings fest.
Klicken Sie auf "Alle anpassen". Überprüfen Sie die angepassten Werte. SOD1-G85R mit GFP-Messung in einer Lebenden Zelle markiert.
Im Gegensatz zur Lösungsmessung empfehle ich die Verwendung des Wärmestufen-Inkubators. Stellen Sie die zellkultivierende Schale auf die Mikroskopstufe. Bestätigen Sie den Fokus und die Position mit dem Okular.
Wählen Sie eine Messzelle aus. Zoomen Sie ein und passen Sie die Zellenposition mithilfe eines schnellen Scanmodus an. Erfassen Sie den Snapshot der Zellen mithilfe des langsamen Scangeschwindigkeitsmodus.
Wählen Sie mit dem Positionswerkzeug eine FCS-Messposition aus. Das Fadenkreuz zeigt die Messposition an. Starten Sie die Messung.
Der leichte Rückgang der Photonenzählung deutet auf photobleaching von GFP hin. Führen Sie die Kurvenanpassung aus. Repräsentative Ergebnisse von GFP-TDP25 in Zelllysat werden gezeigt.
Das obere Diagramm zeigt die Photonenanzahl auf. Wo es Pfeile gibt, ist eine Spitze, die auf lösliche Oligomere und Aggregate hindeutet. Das mittlere Diagramm stellt die alte Korrelationsfunktion dar.
Die graue Linie zeigt die niedrige, alte Korrelationsfunktion. Die Magenta-Linie zeigt die angepasste Funktion an. Die gepunkteten Linien geben die Anfangs- und Endzeiten für die Anpassung an.
Die untere Tabelle zeigt den angepassten Wert. Als nächstes werden repräsentative Ergebnisse von SOD1-G85R-GFP in einer Livezelle gezeigt. Das obere Diagramm stellt einen Datensatz unserer Photonenanzahl dar.
Der allmähliche Rückgang der aufgezeichneten Photonenzahl wurde beobachtet, was auf photobleichendes GFP-Wachstum für verschiedene Messungen hindeutet. Dies ist aufgrund der langsamen Diffusionsgeschwindigkeit in lebenden Zellen. Das mittlere Diagramm stellt die alte Korrelationsfunktion von SOD1 dar.
Die graue Linie zeigt die niedrige, alte Korrelationsfunktion. Die Magenta-Linie zeigt die angepasste Funktion. Die gepunkteten Linien geben die Anfangs- und Endzeiten mit Fitting an.
Die untere Tabelle zeigt angepasste Werte. Hier zeigen wir Ihnen dieses Verfahren zur Messung der Diffusion aus jeder Zell assoziierten TDP-25 in Zelllysat und alles Mutant von SOD1 in lebenden Zellen mit FCS. Die löslichen Oligomere und die Aggregation im Zelllysat können oft als Spitzen oder Ausbrüche beobachtet werden.
Andererseits werden solche Spitzen in lebenden Zellen selten beobachtet, mit Ausnahme möglicherweise offensichtlicher Lebendstrukturen. Eine langsam diffundierende Art von mutierten SOD1 fügt mittlere Helligkeit für einzelne Partikel wie SOD1 Homopolymerisation im Inneren für uns hinzu. Das hier gezeigte Verfahren ist einfach und lohnend.
FCS enthält keine Strahlung;direkt ruhender Zustand. Es ist nur Ihre und unsere Vorstellungskraft Empathie.
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