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फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाना
Chapters
Summary April 25th, 2021
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हम यहां फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिका ओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन ओलिगोमर और एकत्रीकरण को मापने के लिए एक प्रक्रिया शुरू करते हैं।
Transcript
फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी, एफसीएस का सबसे अच्छा सिद्धांत शुरू में 1970 के दशक में आविष्कार किया गया था। नब्बे के दशक में, एफसीएस के लिए महत्वपूर्ण और कई सुधार एक कॉन्फोकल उपकरण माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन द्वारा स्थापित किए गए थे। तब से, एफसीएस का उपयोग आणविक इंटरैक्शन और प्रोटीन एकत्रीकरण विश्लेषण जैसे कई रासायनिक और वायरस इलाज अनुप्रयोगों के लिए किया गया है।
प्रोटीन एकत्रीकरण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों की एक बानगी है। फ्लोरेसेंस ब्राइटनेस प्रसार गुणों द्वारा समझाए गए आणविक आकारों की कार्रवाई में एकल कण हैं। यह प्रोटीन एकत्रीकरण को मापने में बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अणुओं के अनुमानित जीवन चक्र निर्धारित कर सकता है, लेकिन यह भी होमो या हेट्रो बहुलीकरण भेद ।
यहां, हम कोशिका ओं और जीवित कोशिकाओं में एफसीएस का उपयोग करके एकत्रित रूप प्रोटीन से जुड़े एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस के प्रसार को मापने के लिए एक प्रक्रिया शुरू करते हैं। सामान्य ग्रोथ मीडियम में आराम से बैठे न्यूरो2ए सेल को बढ़ाने वाले 100 मिलीमीटर प्लास्टिक डिश तैयार करें। सेल में नरमी की पुष्टि करें।
माध्यम निकालें। तीसरे कारतूस डिश में ट्रिप्पसिन-EDTA समाधान के 3.5 मिलीलीटर जोड़ें और उन्हें एक मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। डिश में 9.5 मिलीलीटर सामान्य विकास माध्यम जोड़ें और उन्हें निलंबित करें।
कोशिका निलंबन मृत कोशिकाओं को दाग करने के लिए ट्राइपैन नीले रंग के साथ मिलाया जाता है। सेल-काउंटिंग स्लाइड में निलंबन जोड़ें। सेल काउंटर, या मैन्युअल रूप से उपयोग करने वाली कोशिकाओं की संख्या गिनें।
लाइव सेल नंबर और उनकी व्यवहार्यता की जांच करें। गिनती के माध्यम में कोशिका को 1.0 गुना 10 से कमजोर कर 5 प्रति मिलीलीटर की शक्ति। लाइव सेल मापन के लिए सेल लाइसिस या विकास अंतरिक्ष पकवान के लिए 35 मिलीमीटर प्लास्टिक डिश में सेल निलंबन के दो मिलीलीटर जोड़ें।
एक दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान इनक्यूबेट। अगले दिन प्लाज्मिड डीएनए और ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स का मिश्रण तैयार करें। कोशिका की गणना वाले माध्यम में ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें और कोशिकाओं को 24 घंटे तक इनक्यूबेट करें।
एक दिन बाद। नियमित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें। आप कोशिकाओं में बहुत उज्ज्वल TDP25 घटक निकायों को देख सकते हैं।
कोशिका लाइसिस जैव रासायनिक पीठ पर किया जाना चाहिए। डिश में मीडियम निकालें। एक माध्यम के रूप में धोने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें ।
पीबीएस निकालें। पिसी हुई बर्फ के शीर्ष पर एक एल्यूमीनियम प्लेट पर पकवान रखें। तुरंत, डिश में 200 माइक्रोलीटर लाइसिस बफर जोड़ें।
सेल स्क्रैपर का उपयोग करके पकवान को कुरेदें। एक नई 1.5 मिलीमीटर ट्यूब में अवमुक्त सेल मलबे के साथ lysate ठीक हो। सेंट्रीफ्यूज lysate चार डिग्री सेल्सियस पर ।
लाइव सेल माप के लिए, माप से पहले एक ताजा के साथ माध्यम की जगह । फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल अटैचमेंट की जांच करें। इसके अलावा, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें।
एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप-संयुक्त एफसीएस सिस्टम का उपयोग करें। 488 नैनोमीटर लेजर चालू करें। कम से कम 30 मिनट के लिए सिस्टम को स्थिर करें।
ऑप्टिकल पथ स्थापित करें। तत्काल प्रकाश के लिए एक 488 नैनोमीटर लेजर का प्रयोग करें। एक उपयुक्त बीम स्प्लिटर और डिक्रोइक मीटर का उपयोग करें।
और भी, फ्लोरेसेंस फ्यूजर्स। आमतौर पर, हम अंशांकन और समाधान माप के लिए कवरग्लास कक्षों का उपयोग करेंगे। ध्यान से, कवरग्लास चैंबर लें।
कांच की सतह को लेंस स्क्रीनिंग पेपर पर रखें। एफसीएस अंशांकन डालो। रोडामाइन 6G समाधान को भी जोड़ें।
उद्देश्य पर अल्ट्रापुरे पानी जोड़ें। तेल का प्रयोग न करें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर चैंबर सेट करें।
मंच को उपयुक्त स्थिति में ले जाएं। पिनहोल एडजस्टमेंट बनाएं और पिनहोल एडजस्टमेंट विजार्ड खोलें। एक्स-दिशा के लिए पिनहोल के मोटे आंदोलन के रूप में फोटॉन काउंट रेट की निगरानी करें।
प्रतिभाशाली स्थिति सही निर्धारित किया गया था । इसके बाद, फोटॉन गिनती दर को ठीक आंदोलन के रूप में मॉनिटर करें। प्रतिभाशाली स्थिति सफलतापूर्वक निर्धारित किया गया था यह एक्स दिशा के लिए पिनहोल स्थिति है ।
इसी तरह, वाई-डायरेक्शन के लिए पिनहोल की प्रतिभाशाली स्थिति की खोज करें। वाई-डायरेक्शन के लिए प्रतिभाशाली स्थिति का भी सफलतापूर्वक निर्धारण किया गया । पिनहोल की एक्स और वाई स्थिति को यौगिक करें।
प्रत्येक दिन के माप से पहले पिनहोल की स्थिति को समायोजित करना बेहतर है। जब लाइव पथ बदल जाता है, तो पिनहोल स्थिति को फिर से समायोजित किया जाना चाहिए। एक गिनती दर बनाएं और फोन की गिनती दर पर नजर रखें।
सीपीएम मॉनिटरिंग मोड में बदलें। आपके द्वारा चलाई गई वस्तु की सुधार अंगूठी को गिनें ताकि सीपीएम मूल्य सबसे अधिक हो। काउंट रेट विंडो बंद करें।
रोडामाइन 6G समाधान माप के साथ शुरू करें। माप पूरा होने के बाद, वक्र फिटिंग विश्लेषण करने के लिए फिट पर क्लिक करें। पुराने सहसंबंध समारोह की फिटिंग के लिए एक मॉडल का चयन करें।
रोडामाइन 6G के लिए, एक ट्रिपल राज्य के साथ 1-घटक, 3-आयामी प्रसार के लिए मॉडल का चयन करें। लाल रेखा को हिलाकर फिटिंग शुरू समय निर्धारित करें। फिटिंग गणना शुरू करने के लिए, सभी फिट पर क्लिक करें।
फिट विचलन की जांच करें। सुनिश्चित करें कि पक्षों को पोस्ट और नकारात्मक, शून्य के आसपास हैं। फिट मानों की जांच करें।
सुनिश्चित करें कि प्रसार समय मोटे तौर पर 20-30 माइक्रोसेकंड से की सीमा में है। इसके अलावा स्ट्रक्चरल पैरामीटर चार से आठ तक है। फिट पैनल खोलें, और माप के लिए एक मॉडल का चयन करें।
फिट पैनल में नमूने के लिए मॉडल में एक ही संरचनात्मक पैरामीटर मूल्य दर्ज करें। सुनिश्चित करें कि प्रकार को निश्चित रूप से सेट किया जाना चाहिए। सेल लंकेट में जीएफपी-टीडीपी25 माप।
lysate को कवरग्लास कक्ष में रखें। लिस् टो के सूखने से बचने के लिए ढक्कन रखें। प्रकाश छायांकन के लिए मंच ढक्कन रखें।
अधिग्रहण पैनल में, लेजर शक्ति, माप समय, और इसकी पुनरावृत्ति सेट करें। अधिग्रहण शुरू करें। एक स्पाइक देखा गया।
एक स्पाइक फिर से देखा गया । स्पाइक पता लगाने वाले शरीर के माध्यम से पारित उज्ज्वल अणुओं को इंगित करता है। स्पाइक्स घुलनशील ओलिगोमर या एग्रीगेट्स का संकेत देते हैं।
वक्र फिटिंग विश्लेषण करने के लिए एक फिट बनाएं। ट्रिपल राज्य के साथ 2-घटक, 3-आयामी प्रसार के लिए मॉडल का चयन करें। फिटिंग शुरू समय निर्धारित करें।
फिट ऑल पर क्लिक करें। फिट मानों की जांच करें। SOD1-G85R एक लाइव सेल में GFP माप के साथ टैग किया गया ।
समाधान माप के विपरीत, मैं हीट स्टेज इनक्यूबेटर का उपयोग करने की सलाह देता हूं। माइक्रोस्कोप स्टेज पर सेल-कल्चरिंग डिश सेट करें। नेत्र का उपयोग कर ध्यान और स्थिति की पुष्टि करें।
एक मापक कोशिका का चयन करें। फास्ट स्कैनिंग मोड का उपयोग करके सेल स्थिति को ज़ूम-इन और समायोजित करें। धीमी स्कैनिंग गति मोड का उपयोग कर कोशिकाओं के स्नैपशॉट प्राप्त करें।
स्थिति उपकरण का उपयोग करके एफसीएस-मापने की स्थिति का चयन करें। क्रॉसहेयर मापने की स्थिति को इंगित करता है। माप शुरू करें।
फोटॉन काउंट रेट रिकॉर्ड की मामूली कमी से जीएफपी की फोटोब्लैचिंग का पता चलता है । वक्र फिटिंग का प्रदर्शन करें। सेल लंकेट में जीएफपी-टीडीपी25 के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं।
शीर्ष ग्राफ फोटॉन काउंट रेट का रिकॉर्ड है। जहां तीर एक स्पाइक है, घुलनशील ओलिगोमर और समुच्चय का सुझाव देता है। मध्य ग्राफ पुराने सहसंबंध समारोह का प्रतिनिधित्व करता है।
ग्रे लाइन कम, पुराने सहसंबंध समारोह से पता चलता है। मजेंटा लाइन में लगे फंक्शन को दिखाया गया है। बिंदीदार रेखाएं फिटिंग के लिए शुरुआत और अंत के समय का संकेत देती हैं।
नीचे की मेज फिट मूल्य से पता चलता है । इसके बाद, लाइव सेल में एसओडी1-जी85आर-जीएफपी के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। शीर्ष ग्राफ हमारे फोटॉन गिनती दर के रिकॉर्ड का प्रतिनिधित्व करता है।
दर्ज फोटॉन गिनती दर की क्रमिक कमी देखी गई, जिसमें विभिन्न मापों के लिए जीएफपी वृद्धि की फोटोब्लैचिंग का सुझाव दिया गया । ऐसा लाइव कोशिकाओं में धीमी प्रसार गति के कारण होता है। मध्य ग्राफ SOD1 के पुराने सहसंबंध समारोह का प्रतिनिधित्व करता है।
ग्रे लाइन कम, पुराने सहसंबंध समारोह से पता चलता है। मजेंटा लाइन में लगे फंक्शन को दिखाया गया है। बिंदीदार रेखाएं फिटिंग के साथ शुरुआत और अंत के समय का संकेत देती हैं।
नीचे की मेज फिट मूल्यों को दर्शाता है । यहां हम आपको यह प्रक्रिया दिखाते हैं कि सेल लिसेट में टीडीपी-25 से जुड़ी हर कोशिका से प्रसार को मापने के लिए और एफसीएस का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में SOD1 के सब कुछ उत्परिवर्ती । सेल लिसेट में घुलनशील ओलिगोमर और एकत्रीकरण अक्सर स्पाइक्स या फटने के रूप में देखा जा सकता है।
दूसरी ओर, जीवित कोशिकाओं में, संभवतः स्पष्ट जीवित संरचनाओं को छोड़कर, इस तरह के स्पाइक्स शायद ही कभी देखे जाते हैं। उत्परिवर्ती एसओडी 1 के ऐड की धीरे-धीरे डिफ्यूजिंग प्रजातियों का मतलब हमारे लिए अंदर SOD1 होमोपॉलिमराइजेशन जैसे एकल कणों के लिए चमक है। यहां दिखाई गई प्रक्रिया सरल और सार्थक है ।
एफसीएस में कोई विकिरण नहीं होता है; सीधे निष्क्रिय स्थिति नहीं होती है। यह सिर्फ अपने, और हमारी, कल्पना सहानुभूति है ।
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