Summary
Vi inför här ett förfarande för att mäta protein oligomerer och aggregering i cell lysat och levande celler med fluorescens korrelation spektroskopi.
Abstract
Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och så vidare. För att upptäcka och analysera lösliga eller diffusa proteinoligomer eller aggregat har fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektera diffusionshastigheten och ljusstyrkan hos en enda partikel med en enda molekylkänslighet, använts. Det korrekta förfarandet och know-how för proteinaggregeringsdetektering har dock inte delats i stor utsträckning. Här visar vi ett standardförfarande för FCS-mätning för diffusionsegenskaper hos aggregeringsbenägna proteiner i celllyat och levande celler: ALS-associerade 25 kDa karboxylterminalfragment av TAR DNA/ RNA-bindande protein 43 kDa (TDP25) och superoxiddemutas 1 (SOD1). De representativa resultaten visar att en del av aggregat av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt TDP25 var något ingår i den lösliga fraktionen av murin neuroblastom Neuro2a cell lysat. Dessutom visar GFP-märkta SOD1 bär ALS-associerade mutation en långsammare diffusion i levande celler. Följaktligen introducerar vi här proceduren för att upptäcka proteinaggregeringen via dess diffusionsegenskap med FCS.
Introduction
Proteinaggregeringar som involverar neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och såvidare 1 är kända för att vara giftiga och skulle störa proteinhomeostas (proteostas) i cellerna och organen, som sedan kan leda till åldrande2. Clearance av proteinaggregering förväntas som en terapeutisk strategi; Kemikalier som förhindrar proteinaggregeringsbildning och bryter ned proteinaggregat (t.ex. små molekyler eller läkemedel) har dock ännu inte fastställts. Dessutom är hur proteinaggregering utövar toxicitet fortfarande svårfångad. För att främja forskningsprojekt relaterade till proteinaggregering är det därför viktigt att införa förfaranden med hög genomströmning för att helt enkelt upptäcka proteinaggregering. Protein aggregering upptäckt med antikroppar som erkänner konformation av protein aggregering och aggregering-specifika fluorescerande färgämne har använts i stor utsträckning3. Det är dock svårt att upptäcka aggregeringen, särskilt i levande celler med sådana klassiska procedurer.
Förster resonans energiöverföring (FRET) är ett förfarande för att upptäcka proteinaggregering och strukturell förändring. FRET kan dock inte analysera proteindynamik (t.ex. diffusion och oligomerisering av protein i levande celler)3. Därför introducerar vi här ett enkelt protokoll för att upptäcka proteinaggregering i lösning (t.ex. celllyat) och levande celler med fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som mäter diffusionsegenskapen och ljusstyrkan hos fluorescerande molekyler med en molekylkänslighet4. FCS är en fotonräkningsmetod med hjälp av ett lsm(laser scan confocal microscope). Med hjälp av en mycket känslig fotondetektor och beräkning av autokorrelationsfunktion (ACF) av foton ankomsttid mäts genom tiden och ljusstyrkan hos fluorescerande molekyler i detektionsvolymen. Diffusionen saktar med en ökning av molekylvikten; Intermolecular interaktion kan således uppskattas med FCS. Ännu kraftfullare är att en ökning av ljusstyrkan hos den fluorescerande molekylen indikerar homo-oligomerisering av molekylerna. Därför är FCS ett kraftfullt verktyg för att upptäcka sådan proteinaggregering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Material och reagenser
- Använd pyrogena fria lösningar och medium för cellkultur (tabell 1).
- Förbered lösningar för det biokemiska experimentet med ultrapurevatten och använd som DNase / RNase gratis.
- Välj en lämplig FBS för cellkulturen med mycket kontrollprocess. Eftersom det valda FBS-partiet ändras regelbundet kan katalogen och partinumret för FBS inte representeras här.
- Plasmid DNA
- Förbered pmeGFP-N15 för eGFP monomer uttryck; PmeGFP-C1-TDP256 för GFP-TDP25-uttryck. PmeGFP-N1-SOD1-G85R7 för SOD1-G85R-GFP-uttryck. och pCAGGS8 som transportör.
OBS: meGFP är en monomerisk variant som bär A206K mutation av förbättrad GFP (eGFP). TDP25 är ett ALS-associerat C-terminalfragment av TDP-43. SOD1-G85R är en ALS-associerad mutant av SOD1.
- Förbered pmeGFP-N15 för eGFP monomer uttryck; PmeGFP-C1-TDP256 för GFP-TDP25-uttryck. PmeGFP-N1-SOD1-G85R7 för SOD1-G85R-GFP-uttryck. och pCAGGS8 som transportör.
- Cellstam
- Använd murine neuroblastom Neuro2a celler.
OBS: Neuro2a celler har hög transfection effektivitet och mycket uttryckliga exogena proteiner. För TDP25-uttryck krävs cellstammar med hög uttryckseffektivitet som Neuro2a- eller HEK293-celler. I HeLa-celler kunde TDP25 inte uttryckas effektivt.
- Använd murine neuroblastom Neuro2a celler.
2. Cellkultur och transfection
- Förbered en 100 mm plastform som växer Neuro2a-celler halvkonfluently i normalt tillväxtmedium.
OBS: Det är nödvändigt att inkubera vid 37 °C i cirka 48-72 timmar efter föregående sådd tills halvkonfluensen har uppnåtts. - Ta bort mediet.
- Tillsätt 0,5 ml trypsin-EDTA-lösning i cellkulturrätten och inkubera dem vid 37 °C i 1 minut.
- Tillsätt 9,5 ml normalt tillväxtmedium i skålen och häng upp de fristående cellerna.
- Använd Trypan blue för att färga de döda cellerna, räkna antalet celler med hjälp av en cellräknare eller manuellt. Späd sedan cellerna i odlingsmedium (1,0 × 105/ml).
- Tillsätt 2 ml cellfjädring i en 35 mm plastform för celllys eller en glasbasform för levande cellmätning.
- Inkubera skålen vid 37 °C i 1 dag.
- Påbörja följande förberedelser 15 minuter före transfectiondagen.
- Förbered två 1,5 ml-rör och tillsätt 100 μL Opti-MEM I till varje rör.
- Blanda 1,0 μg plasmid-DNA (lösning A) i det första röret. Blanda 2,5 μL lipofectamin 2000 (lösning B) i det andra röret.
OBS: För att bibehålla transfection effektivitet, håll den totala DNA-mängden densamma. För att minska uttrycksnivån för FCS-mätning i levande celler bör fraktionen av plasmid-DNA för proteinuttryck minska (t.ex. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R och 0,8 μg pCAGGS-blandning). Dessutom behålla samma förhållande mellan volymen lipofectamin 2000 och mängden plasmid-DNA. - Blanda försiktigt lösning A och B genom att tillsätta en i båda rören och inkubera den sedan i 1 minut vid rumstemperatur (lösning C).
- Lägg till lösning C i odlingsmediet; och inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C.
3. Celllys och medium utbyte
- Kontrollera GFP-uttrycket med ett rutinmikroskop.
- Ta bort mediet i skålen.
- Tillsätt 2 ml PBS vid 25 °C för att tvätta bort mediet. Ta bort PBS.Remove the PBS.
- Placera skålen på en aluminiumplatta ovanpå den krossade isen.
OBS: Vi använder en 1 mm tjock aluminiumplatta skuren i en söndagsverktygsbutik eller kommersiellt tillgänglig som laboratorieutrustning. - Tillsätt 200 μL lysbuffert vid 4 °C. Skaka skålen milt så att bufferten fördelas jämnt i botten av skålen.
- Skrapa skålen med en cellskrapa och återvinn lysatet med olöst cellskräp i ett nytt 1,5 ml-rör.
- Centrifugera lösningen vid 20 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Återvinn supernaten i ett nytt 1,5 ml-rör och håll den vid 4 °C eller på is.
OBS: Frys inte lysatet. - För levande cellmätningar, byt ut mediet före mätningen. Kontrollera celltillbehöret med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Bekräfta uttrycket med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
4. Kalibrering av fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)
- Starta systemet och kör driftprogrammet. Slå på Argon+ laser (458/477/488/514 nm). Stabilisera systemet åtminstone i 30 minuter.
- Ställ in den optiska banan: Helljusdelare: HFT488; Tärande spegel: NFT600; Fluorescensbarriärfilter: ett bandpassfilter 505-540 (BP505-540); Detektor: lavinfotodiod (APD)).
- Ställ in pinhole-storleken genom att ange värdet direkt (66 μm; 1 luftig enhet).
- Tillsätt Rhodamine 6G-lösningen (Rh6G) i en brunn i täckglaskammaren på scenen.
- Tillsätt nedsänknings ultrapure vatten på målet. Använd inte nedsänkningsoljan.
- Ställ in kammaren på mikroskopstadiet. Flytta scenen till rätt position.
- Fokusera på den övre glasytan genom att mäta det spridda ljuset från glasytan. När objektivet har sänkts nedtill vrider du fokusratten medurs för att justera.
OBS: Kontrollera vridriktningen på fokusratten eftersom den är motsatt mellan de som tillverkas i Japan och Tyskland. - Lyft upp brännpunkten 200 μm över den övre glasytan för att observera lösningens insida.
- Klicka på räkningen och övervaka antalet fotoner.
- Öka gradvis AOTF-värdet (AOTF) (t.ex. excitationslaseröverföring) så att räknehastighetsvärdet är mer än 10 kHz.
- Klicka på pinholejusteringen och öppna guiden för justering av pinhole. Hitta pinhole-positionen med det högsta (en topp) antalet fotoner i både x- och y-axeln.
- Vrid objektivets korrigeringsring så att antalet per molekyl (CPM) är högst.
OBS: Eftersom tjockleken på täckglaset på den kammare som anges här är 0,12-0,17 mm, är korrigeringsringen runt sitt minimum eller bara några varv från den, där CPM: en är som mest. - Minska AOTF-värdet gradvis så att CPM-värdet blir 2-3 kHz.
- Skaffa autokorrelationsfunktionen (ACF) för Rh6G för 90 s.
- När mätningen är klar klickar du på Anpassa för att utföra kurvmonteringsanalys.
- Välj en modell för tredimensionell diffusion med en komponent (3D) med trillingtillstånd.
OBS: Rh6G är monodisperse och enkomponent diffus med ett trillingtillstånd. - Ställ in monteringsstarttiden genom att flytta den röda linjen. Klicka på Anpassa alla och kontrollera passformsavvikelsen. När du har utfört kurvkopplingen, se till att diffusionstiden (DT) och strukturparametern (SP) är ungefär inom intervallet 20-30 μs respektive 4-8.
- Kom ihåg det strukturella parametervärdet. Använd SP-värdet för kurvmonteringsanalys av alla ACF-filer som mäts samma dag, under samma optiska förhållanden, och använd samma typ av glasbasform eller kammarens täckglas som ställts in på mikroskopstadiet.
5. FCS-mätning i celllyat
- Förbered celllyssen (se ovan).
- Placera lysatet på täckglaskammaren. Placera ett lock för att undvika torkning och scenlocket för lätt skuggning.
- Ställ in förvärvsvillkor, laserkraft, mättid och upprepningar.
- Klicka på Räkna hastighet och justera laserns AOTF-värde så att CPM-värdet blir mer än 1 kHz.
- Utför en provmätning i 1 minut. Kontrollera om den beräknade ACF visar en positiv amplitud och jämnt förfall.
- Utför huvudmätningen i 5 minuter.
OBS: Den totala mättiden ökas gradvis tills formen på ACF inte ändras även om mättiden ökas. - Klicka på Anpassa för att utföra kurvmonteringsanalys.
- Välj en modell för 3D-diffusion med två komponenter med trillingtillstånd. Kom ihåg att ange SP-värdet och ändra dess inställning till "Fast" inte "Ledig" innan du klickar på Anpassa alla.
- Exportera den monterade tabellen som en flikavgränsad textfil.
- Om det behövs exporterar du posten ACF och Count rate som en tabbavgränsad textfil.
6. FCS-mätning i levande celler
- Byt ut mediet mot ett nytt före mätningen.
- Använd en inkubator för värmesteg. Ställ in cellkulturskålen på mikroskopstadiet.
- Bekräfta fokus och position med hjälp av confocal micrope. Markera mätcellen. Zooma in och justera cellpositionen. Skaffa fluorescensbilder av en GFP-uttryckscell med hjälp av läget långsam skanningshastighet.
- Välj en FCS-mätposition med position i avsnittet "FCS".
- Välj minst en FCS-mätpunkt med ett hårkors (figur 1).
- Mät ACF i 1 minut.
OBS: Eftersom fluorescerande proteiner tenderar att vara fotobleached i levande celler på grund av långsam rörelse jämfört med lösningen, bör mättiden vara minimal. Det är i allmänhet svårt att få ACF i cellen lika smidigt som lösningsmätningar eftersom långvarig mätning leder till fotoblekning av fluorescerande proteiner. - Klicka på Anpassa för att utföra kurvpassningsanalys med hjälp av en modell för 3D-diffusion med två komponenter med trillingtillstånd.
OBS: För levande cellmätningar skulle en modell för tvåkomponents 3D-diffusion med trillingtillstånd vara bättre eftersom det är empiriskt svårt att minska chi-kvadratvärdet med en 3D-diffusionsmodell med en komponent på grund av förekomsten av olika mobila komponenter i levande cell. Men även med hjälp av en modell för trekomponents 3D-diffusion separeras diffusionskomponenterna vanligtvis inte jämfört med att använda modellen för tvåkomponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde FCS mätning av GFP-TDP25 i cell lysat och SOD1-G85R-GFP i levande celler. I båda fallen kunde en positiv amplitud och smidiga ACFs förvärvas. Vi har visat att en del av GFP-TDP25 uttryckt i Neuro2a celler återfanns i lösliga fraktion under det angivnavillkoret 6. I den lösliga fraktionen av celllysatet upptäcktes extremt ljusa fluorescensmolekyler i fotonräkningshastigheten med FCS (Figur 2A, topp, pil). Sådana "spikar (även kallade burst)" observerades inte i GFP monomerer och monodisperse kemisk fluorescerande färglösning, vilket tyder på att spikarna indikerar oligomeric proteiner9. Kurvmonteringsanalys med hjälp av en modell som antar tvåkomponents 3D-diffusion med trillingtillstånd visade att de snabba diffusionsmolekylerna (DTFast = 186 μs) var ~ 90% och de återstående 10% var 2,3 ms (Figur 2A, botten; och tabell 2).
Under SOD1-G85R-GFP-mätningen i levande celler visade fotonräkningshastigheten en gradvis minskning, vilket tyder på att den fotoblekade i detekteringsvolymen (Figur 2B, överst). Även om bidraget från fotobleaching visades i ett längre än 1 s intervall i ACF, observerades en positiv amplitud och smidigt sönderfall av ACF(figur 2B,botten). Kurvmonteringsanalys med en modell som antar tvåkomponents 3D-diffusion med trillingtillstånd visade att de snabba diffusionsmolekylerna (DTFast = 397 μs) var ~93,4% och de återstående 6,6% var 12,3 ms (tabell 2). ALS-linked mutation, G85R, i SOD1 tillät inte en dramatisk skillnad i diffusionsegenskap jämfört med vild typ. Proteasomhämning minskade dock diffusionshastigheten endast i G85R-mutanten av SOD1 icytoplasman 7.
Bild 1: Konfokal fluorescerande bild av Neuro2a-celler som uttrycker SOD1-G85R-GFP. Confocal fluorescerande bild av Neuro2a celler uttrycker SOD1-G85R-GFP. Hårkorset anger FCS mätposition i cytoplasman. Bar = 10 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Typiska FCS-resultat och monterade kurvor förautokorrelationsfunktionerna. (A och B) Överst: Inspelad fotonräkningshastighet i FCS-mättidsintervallet (grön linje). Nederkant: Beräknade autokorrigeringsfunktioner (ACF; Råa, grå linjer) och monterade ACF-kurvor med hjälp av en modell för tvåkomponents tredimensionell diffusion med trillingtillstånd (Fit, magenta-linjer). G(τ) för Y-axeln anger amplituden av ACF vid tidpunkten τ sek. för X-axel. Punkter visar passande start- och sluttidspunkter. Mörkblå pilar visar spiken med extremt ljusa proteiner som passerar genom detektionsvolymen (dvs. lösliga oligomer/aggregat). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Namn på material/utrustning | Komponenter | Kommentarer/Beskrivning |
| 0,1 mM Rhodamin 6G lösning. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M natriumklorid (NaCl) | ||
| Lysis buffert | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1× proteashämmarcocktail | Proteashämmarcocktail bör blandas precis innan celllysen. |
| Normalt tillväxtmedium | DMEM kompletterat med 10% FBS och 100 U/mL penicillin G och 100 mg/mL Streptomycin | Partikontroll för FBS bör krävas. |
| Fosfatbuffert saltlösning (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 |
Tabell 1: Lösningskompositioner
| CPM (kHz) | SnabbtDT (ms) | Snabb komponent (%) | DTLångsam (ms) | Långsam komponent (%) | |
| GFP-TDP25 i lysat | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP i levande cell | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tabell 2: Typiska monterade värden för autokorrigeringsfunktionerna
Monterade värden för autokorrigeringsfunktionerna representeras i figur 2 med hjälp av en modell för tvåkomponents tredimensionell diffusion med trillingtillstånd. Räkningar per molekyl (CPM), snabb och långsam diffusionstid (DTFast respektive DTSlow)och deras komponenter (Fast and Slow component) är representerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När det gäller systemkalibrering före mätningar bör samma glas som det som används för att mäta provet användas (t.ex. täcker 8-brunnarna glaskammaren för celllyat och 35 mm glasbasform för levande celler). På grund av adsorptionen av Rh6G på glaset kan dess effektiva koncentration ibland minska. I så fall bör en högkoncentrerad Rh6G-lösning som 1 μM användas endast för pinhole-justeringen. Extremt höga fotonantal måste undvikas för att skydda detektorn (t.ex. mer än 1000 kHz). Dessutom är den koncentrerade lösningen inte lämplig för förvärv av autokorrigeringsfunktion (behåll mindre än 100 kHz). Kalibreringen av pinhole-positionen är viktig. Om det optiska systemet används ofta är det sällsynt för dramatisk förskjutning av pinhålet; Således är det ofta inga problem att använda "Fine" i början för att hitta rätt position. Om ingen toppposition för räknehastigheterna med "Fine" hittas, använd "Grov" för att flytta pinhole från ena änden av rörelseområdet till den andra före positionsinfinnningen med "Fine". Om ACF:s amplitud var platt kontrollerar du om fokus och position är lämpliga.
Efter Rh6G-mätningen och dess montering, om DT och/eller SP ligger utanför det angivna intervallet, försök med justeringen av pinhole- och korrigeringsringen igen. När du fortfarande visar utanför intervallet rekommenderar vi att du kontaktar tillverkarens support eftersom det är troligt på grund av misstänkt avhopp av det optiska systemet. Med hjälp av den uppmätta DT och SP utöver den kända diffusionskoefficienten rh6G (414 μm2/s) i vatten kan den effektiva strål midjan beräknas eftersom DT är beroende av strålmidjan 10. Eftersom SP är förhållandet mellan strål midja och höjden på den effektiva detektionsvolymen kan detektionsvolymen dessutom beräknas. Volymberäkningen krävs för att bestämma absolut koncentration. Mer beskrivning av principen och felsökning under kalibreringen finns också i protokoll som rapporterats tidigare11,12,13.
Vissa spikar observerades i FCS-mätningen av GFP-TDP25 i celllyat(figur 2A,överst). Vi visar att sådana spikar observerades i FCS-mätning av aggregerad benägen huntingtin inklusive expanderade polyglutaminrepetitioner märkta med GFP eller gult fluorescerande protein (YFP) (HttQ78 och HttQ143)9; Det föreslår således lösliga oligomerer/aggregat av GFP-TDP25 i den lösliga fraktionen av celllysatet. Men en sådan spikpopulation var sällsynt; ACF och dess kurvmonteringsresultat kanske således inte innehåller något större bidrag från sådana spikar. En möjlig orsak till att endast en liten mängd aggregat ingår i den lösliga fraktionen är sannolikt eftersom TDP25 är mycket aggregeringsbenägen och dess aggregat fraktioneras i den olösliga fraktionen som visas med hjälp av en fraktionering av celllyatet följt av western blotting detektering6. Fenomenet med tendensen att återhämta sig till den olösliga fraktionen av aggregeringsbenäget protein har oftaobserverats 6,9. Sådana lösliga oligomer/aggregat kan inte lätt detekteras med konventionella biokemiska metoder såsom SDS-PAGE följt av western blotting. FCS har således en fördel. Att analysera flera komponenter med konventionell FCS är dock svårt eftersom det mäter den genomsnittliga befolkningen. Mer utvecklingsmässiga förfaranden i kombination med bayesisk icke-parametrisk analys skulle fastställa multikomponenterna i provet utan några antaganden för komponenterna14.
Diffusionstiden i levande celler var relativt långsam jämfört med celllyaten. Eftersom viskositeten i cellen är känd för att vara högre än i lösningar som PBS och tvättmedelshaltigbuffert 15, blir diffusionstiden i levande celler teoretiskt 2,5-3 gånger längre. På grund av denna långsamma diffusion i levande celler som jämförs i lösning kan fotoblekning av fluorescerande taggar ofta orsakas. För att korrigera fotoblekningseffekten på ACF:er har vissa procedurer såsom exponentiellt sönderfallsantagande16 och brusfiltrering med vågfunktionföreslagits 17. Även om sådana korrigeringar tros vara effektiva, har det fortfarande inte varit så enkelt för allmänna användare eftersom det kräver programmeringsfärdigheter. Vid levande cellmätningar bör dessutom monteringsområdet bestämmas mer noggrant så att det chi-kvadratiska värdet på den monterade kurvan blir litet. Som visas i figur 2Buteslöts inte intervallet där G(τ) var mindre än 1 från monteringsområdet. Alternativt krävs fler fotonbara fluorescerande taggar för att analysera långsamt diffuserande / rörliga molekyler. GFP är lätt att använda som märkningsetikett, och dess stabilitet är bra, men den är ofta fotobleached under FCS-mätningar. För att övervinna denna fotobara egenskap har HaloTag med tetramethylrhodamine (TMR) som kemiskt fluorescerande färgämne varit tillgängligt18. Ofullständig märkning av fluorescerande ligands (t.ex. TMR-ligand) och fångade färgpooler är dock problematiska frågor för specifik märkning av proteiner av intresse19; Således skulle exogena uttryck för protein av intresse märkta med fluorescerande proteiner vara förstahandsvalet för fluorescerande märkning i levande celler.
Det finns många typer av fluorescerande proteiner, liksom kemiska fluorescerande färgämnen; Emellertid, som visas i denna artikel, monomeric förbättrad GFP (meGFP) är en lättanvänd tagg för FCS samt andra fluorescensmikroskopi eftersom dess biokemiska och fluorescens egenskaper är välkända. Därför är meGFP i våra studier förstahandsvalet och används i allmänhet för att märka aggregeringsbenägna proteiner för FCS-mätningar6,7,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dessa författare har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
A.K. stöddes av ett bidrag från Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av ett stöd från Nakatani Foundation for Countermeasures mot nya coronavirusinfektioner, genom ett bidrag från Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) och ett bidrag i bistånd från Hoansha Foundation. M. K. stöddes delvis av ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Kemi för multimolekylära crowdingbiosystem" (#20H04686) och ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Informationsfysik i levande frågor" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
