A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisande av proteinaggregering med fluorescenskorrelationsspektroskopi
Chapters
Summary April 25th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi inför här ett förfarande för att mäta protein oligomerer och aggregering i cell lysat och levande celler med fluorescens korrelation spektroskopi.
Transcript
Den bästa principen för Fluorescenskorrelationsspektroskopi, FCS, uppfanns ursprungligen på 1970-talet. På 1990-talet inrättades viktiga och många förbättringar för FCS genom att kombineras med en konfokal apparatmikroskopi. Sedan dess har FCS använts för många kemiska och virushärdande applikationer, såsom molekylära interaktioner och proteinaggregeringsanalys.
Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa störningar. Fluorescensens ljusstyrka är enstaka partiklar i funktion av molekylära storlekar som förklaras av diffusionsegenskaper. Det är mycket viktigt vid mätning av proteinaggregeringar eftersom det kan bestämma projicerade livscykler av molekyler, men också skilja homo eller heteropolymerisering.
Här introducerar vi ett förfarande för att mäta diffusion av amyotrofisk laterala skleros är associerad med aggregerat formprotein med FCS i cell lysates och levande celler. Förbered 100 millimeters plasträtt som växer Neuro2a-cell som sitter bekvämt i det normala tillväxtmediet. Bekräfta cellkonfluensen.
Ta bort mediet. Tillsätt 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-lösning i den tredje patronskålen och inkubera dem vid 37 grader celsius i en minut. Tillsätt 9,5 milliliter normalt tillväxtmedium i skålen och häng upp dem.
Cellupphängningen blandas med trypanblått för att färga de döda cellerna. Lägg till fjädring i cellräkningsbilden. Räkna antalet celler som använder cellräknaren eller manuellt.
Kontrollera det levande cellnumret och deras livskraft. Späd cellen i det räknade mediet vid 1,0 gånger 10 till kraften av 5 per milliliter. Tillsätt två milliliter cellfjädring i den 35 millimeter stora plastformen för celllys eller tillväxtutrymmesform för levande cellmätning.
Inkubera skålen vid 37 grader celsius för en dag. Nästa dag, förbered blandningen av plasmid-DNA och transfection reagenserna. Tillsätt transfektionsblandningen i det cellräknade mediet och inkubera cellerna i 24 timmar.
En dag senare. Kontrollera GFP-uttrycket med ett rutinmikroskop. Du kan se de mycket ljusa TDP25-ingredienskropparna i celler.
Celllys bör utföras på den biokemiska bänken. Ta bort mediet i skålen. Tillsätt två milliliter PBS vid 25 grader celsius för att tvätta som medium.
Ta bort PBS.Remove the PBS. Placera skålen på en aluminiumplatta ovanpå den krossade isen. Tillsätt omedelbart 200 mikroliterlysbufferten i skålen.
Skrapa skålen med en cellskrapa. Återvinn lysatet med olöst cellskräp i ett nytt 1,5 millimeters rör. Centrifugera lysatet vid fyra grader celsius.
För levande cellmätningar, byt ut mediet mot ett nytt före mätningen. Kontrollera celltillbehöret med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Kontrollera också GFP-uttrycket med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
Använd ett konfokalt mikroskop-kombinerat FCS-system. Slå på lasern på 488 nanometer. Stabilisera systemet i minst 30 minuter.
Ställ in den optiska banan. Använd en laser på 488 nanometer för direktljuset. Använd en lämplig strålklytare och dichroiska mätare.
Och även fluorescenssäkringar. Vanligtvis använder vi täckglaskammare för kalibrering och lösningsmätningar. Ta försiktigt täckglaskammaren.
Placera glasytan på linsens sållningspapper. Häll FCS-kalibreringen. Tillsätt rhodamin 6G-lösningen också.
Tillsätt ultrapurevatten på målet. Använd inte oljan. Ställ in kammaren på mikroskopstadiet.
Flytta scenen till rätt position. Skapa pinhole-justeringen och öppna guiden för justering av pinhole. Övervaka fotonantalet som grov rörelse av pinhålet för x-riktningen.
Den ljusaste positionen var med rätta bestämd. Övervaka sedan fotonräkningshastigheten som fin rörelse. Den ljusaste positionen har fastställts Detta är pinhole-positionen för x-riktning.
På samma sätt söker du i pinhålets ljusaste position efter y-riktning. Den ljusaste positionen för y-riktning fastställdes också framgångsrikt. Förvärra pinhålets x- och y-läge.
Det är bättre att justera pinhole-läget före varje dags mätning. När huvudbanan ändras måste pinhole-läget justeras igen. Skapa en räkningshastighet och övervaka antalet telefoner.
Ändra till CPM-övervakningsläget. Räkna korrigeringsringen för objektet du körde så att CPM-värdet är det högsta. Stäng fönstret för räknehastighet.
Börja med mätningen av Rhodamine 6G-lösningen. När mätningen är klar klickar du på passformen för att utföra kurvmonteringsanalys. Välj en modell för montering av den gamla korrelationsfunktionen.
För Rhodamine 6G, välj modell för 1-komponent, 3-dimensionell diffusion med trillingtillstånd. Ställ in monteringsstarttiden genom att flytta den röda linjen. Klicka på Anpassa alla för att starta monteringsberäkningen.
Kontrollera passformsavvikelsen. Se till att sidorna är bokförda och negativa, runt noll. Kontrollera de monterade värdena.
Se till att diffusionstiden är ungefär inom intervallet 20-30 mikroseseconds. Dessutom är strukturell parameter från fyra till åtta. Öppna passformspanelen och välj en modell för mätningen.
Ange samma strukturella parametervärde i modellen för exemplet på panelen Passa. Kontrollera att typen ska ställas in som Fast. GFP-TDP25-mätning i celllysat.
Placera lysatet i täckglaskammaren. Placera locket för att undvika att lyset torkas upp. Placera scenlocket för lätt skuggning.
Ställ in lasereffekten, mättiden och dess upprepningar i förvärvspanelen. Starta förvärvet. En spik observerades.
En spik observerades igen. Spiken indikerar ljusa molekyler som passerar genom detektionskroppen. Spikar indikerar lösliga oligomerer eller aggregat.
Skapa en passform för att utföra kurvmonteringsanalys. Välj modell för 2-komponents, 3-dimensionell diffusion med trillingtillstånd. Ställ in monteringsstarttiden.
Klicka på Anpassa alla. Kontrollera de monterade värdena. SOD1-G85R märkt med GFP-mätning i en levande cell.
Till skillnad från lösningsmätning rekommenderar jag att du använder värmestegsinkubatorn. Ställ in cellodlingsskålen på mikroskopstadiet. Bekräfta fokus och position med hjälp av okulären.
Markera en mätcell. Zooma in och justera cellpositionen med ett snabbt skanningsläge. Hämta ögonblicksbilden av cellerna med hjälp av läget långsam skanningshastighet.
Välj en FCS-mätposition med hjälp av positionsverktyget. Hårkorset anger mätpositionen. Starta mätningen.
Den lilla minskningen av fotonräkningshastigheten tyder på fotoblekning av GFP. Utför kurvkopplingen. Representativa resultat av GFP-TDP25 i celllyat visas.
Det översta diagrammet är en post med antal fotoner. Där det finns pilar är en spik, vilket tyder på lösliga oligomerer och aggregat. Det mellersta diagrammet representerar den gamla korrelationsfunktionen.
Den grå linjen visar den låga, gamla korrelationsfunktionen. Magentalinjen visar den monterade funktionen. De prickade linjerna anger start- och sluttiderna för montering.
Den nedre tabellen visar det monterade värdet. Därefter visas representativa resultat av SOD1-G85R-GFP i en levande cell. Det översta diagrammet representerar en post över vår fotonräkningshastighet.
Den gradvisa minskningen av den registrerade fotonräkningshastigheten observerades, vilket tyder på fotobleaching av GFP-tillväxt för olika mätningar. Detta beror på den långsamma diffusionshastigheten i levande celler. Det mellersta diagrammet representerar den gamla korrelationsfunktionen för SOD1.
Den grå linjen visar den låga, gamla korrelationsfunktionen. Magentalinjen visar den monterade funktionen. De prickade linjerna anger start- och sluttiderna med montering.
Den nedre tabellen visar monterade värden. Här visar vi dig denna procedur för att mäta diffusion från varje cell associerad TDP-25 i cell lysat och allt mutant av SOD1 i levande celler med FCS. Lösliga oligomerer och aggregering i celllyat kan ofta observeras som spikar eller skurar.
Å andra sidan, i levande celler observeras sådana spikar sällan, förutom möjligen uppenbara levande strukturer. En långsamt spridande art av mutant SOD1: s lägger till medelljus för enstaka partiklar som SOD1 homopolymerisering inuti för oss. Förfarandet som visas här är enkelt och värdefullt.
FCS innehåller ingen strålning;direkt vilande tillstånd. Det är bara din, och vår, fantasi empati.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
