Summary
Præsenteret her er en protokol til implantation af et kronisk kranievindue til langsgående billeddannelse af hjerneceller i vågne, hovedbeherskede mus.
Abstract
For fuldt ud at forstå den cellulære fysiologi af neuroner og glia i at opføre dyr, er det nødvendigt at visualisere deres morfologi og registrere deres aktivitet in vivo i at opføre mus. Dette papir beskriver en metode til implantation af et kronisk kranievindue for at muliggøre langsgående billeddannelse af hjerneceller i vågne, hovedbeherskede mus. I kombination med genetiske strategier og virale injektioner er det muligt at mærke specifikke celler og regioner af interesse med strukturelle eller fysiologiske markører. Denne protokol viser, hvordan man kombinerer virale injektioner for at mærke neuroner i nærheden af GCaMP6-ekspressiv astrocytter i cortex til samtidig billeddannelse af begge celler gennem et kranievindue. Multifotonbilleddannelse af de samme celler kan udføres i dage, uger eller måneder i vågen, opførende dyr. Denne tilgang giver forskere en metode til at se cellulær dynamik i realtid og kan anvendes til at besvare en række spørgsmål inden for neurovidenskab.
Introduction
Evnen til at udføre in vivo multifotonfluorescensmikroskopi i musebarken er altafgørende for undersøgelsen af cellulær signalering og struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sygdomspatologi 10,11 og cellulær udvikling12,13 . Med implantation af kroniske kranievinduer er langsgående billeddannelse mulig, hvilket muliggør gentagen billeddannelse af kortikale områder i dage, uger eller måneder13,14 hos levende dyr. Multifotonmikroskopi er ideel til in vivo, gentagen billeddannelse på grund af forbedret dybdesondering og reduceret fotoskade forbundet med den anvendte infrarøde laser. Dette gør det muligt at studere molekylær og cellulær dynamik af specifikke celler i forskellige kortikale regioner.
Multifotonmikroskopi er blevet anvendt til in vivo-billeddannelse af neuronale og glialceller i mus 15,16,17,18,19,20. Forskellige strategier kan implementeres for at mærke bestemte celletyper og interesseområder. En almindelig tilgang er at drive ekspressionen af genetisk kodede fluorescerende proteiner på en cellespecifik måde ved hjælp af Cre-Lox-rekombinationssystemet. Dette kan udføres med genetisk modificerede mus, f.eks. krydsning af tdTomato "floxed" mus (Ai14) med en mus, der udtrykker Cre-recombinase under en promotor af interesse21. Alternativt kan celle- og stedspecifik mærkning opnås med virale injektioner. Her injiceres en virus, der koder for Cre-rekombinase under en cellespecifik promotor, og en virus, der koder for et floxet gen af interesse, i en defineret region. Passende celletyper, der modtager begge virale vektorer, vil derefter udtrykke det eller de ønskede gener. Disse gener kan være strukturelle markører, såsom tdTomato, for at se ændringer i cellulær morfologi22 eller genetisk kodede calciumindikatorer (GECIS'er), såsom GCaMP og / eller RCaMP, for at undersøge calciumdynamik23. Metoder til genetisk rekombination kan anvendes individuelt eller i kombination til mærkning af en eller flere celletyper. En tredje tilgang, der ikke kræver transgene mus eller virale konstruktioner (som har begrænset emballagekapacitet), er in utero elektroporation af DNA-konstruktioner24. Afhængigt af tidspunktet for elektroporationen kan forskellige celletyper målrettes 25,26,27.
Når du udfører multifotonbilleddannelse, kan mus afbildes, mens de er vågne eller anæstetiserede. Billeddannelse af vågne mus kan udføres ved at fastgøre musen via en vedhæftet hovedplade28. Denne fremgangsmåde gøres mindre stressende ved at tillade relativt fri bevægelighed for dyret ved hjælp af metoder, såsom fritsvævende, luftunderstøttede styrofoamkugler29, fritsvævende løbebånd1 eller et luftløftet hjemmebursystem, hvor mus fastgøres med en fastgjort hovedplade og får lov til at bevæge sig i et åbent kammer30. For hver af disse billeddannelsesbetingelser vil det først være nødvendigt at vænne musene til billeddannelsesopsætningen. Dette papir beskriver tilvænnings- og billeddannelsesproceduren ved hjælp af et luftløftet hjemmebursystem.
Denne protokol beskriver implantationen af et kronisk kranievindue til langsgående in vivo-billeddannelse i cortex. Her vil vi bruge mus, der betinget udtrykker GCaMP6f i astrocytter til at overvåge calciumsignaldynamikken. Endvidere beskriver dette papir proceduren for virale injektioner ved hjælp af tdTomato som en etiket for neuroner. Dette gør det muligt at bestemme ændringer i neuronal synaptisk struktur og / eller tilgængeligheden som en strukturel markør, der muliggør gentagen billeddannelse af den samme astrocyt. I hele protokollen vil afgørende trin blive fremhævet for at sikre den bedst mulige kvalitet af billeder opnået ved multifotonmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjer godkendt af IACUC ved University of Nebraska Medical Center.
1. Før operationen
- Forbered pipetter til virale injektioner. Træk borosilikatglaskapillærer ved hjælp af en pipettetrækker, og begle pipetten i en 20 ° vinkel. Steriliser pipetterne natten over.
- Forbered friske stykker sterilt gelskum ved at skære dem i små firkanter. Nedsænk gelskummet i et sterilt mikrofugerør indeholdende 0,5 ml saltvand. Blødgør gelskummet i saltvand i mindst 30 minutter før brug.
- Forbered friske stykker svampestrimler ved at skære dem i tynde strimler.
- Tyve minutter før operationen injiceres 4-6 uger gamle GLAST-CreER/GCaMP6f-mus intraperitonealt med 0,2 mg/kg dexamethason for at forhindre hævelse i hjernen og 5 mg/kg carprofen for at reducere inflammation.
BEMÆRK: For at inducere rekombination og ekspression af GCaMP6f i ca. 40 % af astrocytterne blev GLAST-CreER/GCaMP6f-mus injiceret med 100 mg/kg tamoxifen efter 3 uger i 5 på hinanden følgende dage.
2. Start af operationen
- Efter 20 min bedøber musene med 3% isofluran med ilt ved en strømningshastighed på 1 L/min i ca. 1,5 min.
- Når musen er anæstesi, skal du placere musen på en stereotaxisk ramme, der sidder på et vandrecirkulationstæppe for at opretholde en kropstemperatur på 37 ° C under hele operationen. Fastgør musen til rammen ved hjælp af snudklemmen og ørestængerne. Sørg for, at snudklemmen og ørestængerne er stabile nok til, at hovedet ikke bevæger sig under proceduren, men ikke så stramt, at kraniet er beskadiget.
- Oprethold anæstesi med 1-1,5% isofluran med ilt ved en strømningshastighed på 1-2 l / min. Bemærk, at nogle dyr kan have brug for mere eller mindre isofluran for at opretholde sedation. Overvåg dyrets vejrtrækning samt dets reflekser til tå- og haleklemme, og juster isofluranen korrekt.
- Påfør øjensalve på hvert øje ved hjælp af en applikator til bomuldsspidser for at forhindre øjnene i at tørre ud under proceduren.
- Brug gnavertrimmere til at barbere håret fra nakken til lige forbi øjnene. Vær forsigtig for at sikre, at dyrets whiskers ikke ved et uheld trimmes.
- Rengør det barberede område med en jodforberedelsespude efterfulgt af en alkoholforberedelsespude.
- Brug steril vævstarmaturk og kirurgisk saks til at klippe og fjerne huden fra de frontale suturer forrest til bregma helt bagud til lambda.
- Når huden er fjernet, tilsættes ca. 0,1 ml 1% xylocain (lidokain med epinephrin 1:200.000) til kraniet for at minimere blødning af kraniet.
- Brug et sterilt kirurgisk blad i kulstofstål, der er fastgjort til et håndtag, til forsigtigt at skrabe bindevævet fra kraniet. Vær ekstra forsigtig, når du fjerner bindevævet nær kanten af kraniet, da eventuelt resterende væv kan forhindre stærk vedhæftning af glasset eller hovedpladen senere.
- Brug sterile vævspapir til at fjerne løst bindevæv fra kraniet.
- Brug sterile bomuldsspidsapplikatorer til at rense eventuelle resterende xylocain fra kraniet.
- Når det er færdigt, skal du grundigt affedte kraniet ved hjælp af en steril bomuldsspidsapplikator dyppet i acetone. Brug trykluft til straks at føntørre kraniet.
3. Craniotomi
- Brug en finpunktmarkør og en lineal til at måle den passende størrelse til åbningen på det ønskede sted. Bekræft åbningens størrelse ved at sammenligne den med størrelsen på dækglasset (3 eller 5 mm i diameter); Sørg for, at åbningen er lidt mindre end størrelsen på dækglasset.
- Brug en tandbor til gradvist at spore omridset af åbningen og tynde knoglen. Bor langsomt for at forhindre boring gennem knoglen, og bor i koncentriske cirkler for at lette jævn udtynding af knoglen.
- Efter hvert koncentrisk pas tilsættes en dråbe eller to sterilt saltvand til det borede område. Lad saltvandet sidde i mindst 10 s for at forhindre knoglen i at blive overophedet og beskadige den underliggende dura.
- Brug en steril applikator til bomuldsspids til at absorbere resterende saltvand. Blæs trykluft over området for at sikre, at al resterende saltvand er fordampet, inden boringen genoptages. Gør dette for at blæse væk knogleaffald, der er tilbage.
- Gentag trin 3.2-3.4, indtil knoglen er tilstrækkeligt tynd til fjernelse.
- Sørg for, at knoglen er tilstrækkeligt tynd til fjernelse ved forsigtigt at skubbe på det centrale område af knoglen med fine tang for at kontrollere, at det tynde kranium bevæger sig. Den underliggende vaskulatur skal være synlig, hvor boringen fandt sted. Bemærk, at knoglen kan se ud som om den vil revne, hvor udtynding fandt sted.
BEMÆRK: Træning på dette stadium er afgørende for at identificere, hvornår knoglen er blevet tyndet korrekt. - Før du forsøger at fjerne knoglen, skal du kontrollere musen for at sikre, at den er helt bedøvet. Hvis ikke, skal du gradvist øge isofluranvedligeholdelsen for at forhindre hjerne hævelse, når knoglen fjernes.
- Tilsæt et lille stykke gelskum mættet i saltvand til det tynde kranium. Tilsæt en eller to ekstra dråber saltvand til den tynde kraniet.
BEMÆRK: At have masser af saltvand over det tynde kranium hjælper med at reducere blødning og beskytte duraen, når du fjerner knogleklappen. - Brug et miniatureblad på 15° spids til forsigtigt at indsætte bladet i den tynde knogle og skære langs den tynde knogle. Hold gelskummet gennemblødt i saltvand, klar til at stoppe eventuelle blødninger, der måtte opstå.
- Brug tang til forsigtigt at løfte og fjerne knoglen. Vær så skånsom som muligt for at undgå skade på det underliggende væv og vaskulatur. Vær yderst forsigtig med ikke at beskadige dura mater.
- Når knogleklappen er fjernet, tilsættes et nyt stykke gelskum mættet i saltvand til cortex. Tilsæt et par dråber saltvand for at forhindre, at gelskummet tørrer ud, da dette vil forårsage skade på det underliggende væv.
4. Virale injektioner
- Udfør virale injektioner ved hjælp af et stereotaksisk apparat.
- Forbered AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titer af 3 × 1013 genomkopier (GC)/ml) ved 1:5.000 ved serielle fortyndinger i saltvand.
- Forbered blandingen af AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) og AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titer på 5 × 1012 GC/ml) på et lille stykke parafilm.
- Fyld en steril skrå glaspipette med en spidsstørrelse på 20 μm med virusblandingen ved forsigtigt at placere pipetten på opløsningen.
- Sænk pipetten, så den bare rører ved hjernens overflade, og fortsæt med at sænke for yderligere 200-300 μm til L2/3-injektioner. Ved hjælp af et intracellulært mikroinjektionsdispenseringssystem (se materialetabellen) trykinjiceres 12-15 gange over 2 minutter (20 psi, 9 ms pulsvarighed). Overhold menisken i pipettefaldet med hver injektion for at sikre, at pipetten ikke blokeres.
- Når pipetten er injiceret, skal du lade pipetten være i hjernen i 4-5 minutter for at forhindre tilbagestrømning. Træk pipetten langsomt tilbage.
- Gentag injektionerne på 2-3 steder (ca. 500 μm fra hinanden).
- Kassér de brugte glaspipetter, parafilm, pipettespidser og mikrofugerør, der anvendes til serielle fortyndinger af Cre-viruset, i 10% blegemiddel.
5. Implantation af kranievindue
- Fjern gelskum, og brug en lille strimmel svampestrimler til at opsuge eventuel resterende saltvand.
- Tilsæt et par dråber af antibiotika enrofloxacin (22,7 μg/ml) til åbningen og lad det forblive der i 1 min. Efter 1 minut skal du bruge et nyt stykke svampestrimmel til at absorbere eventuel resterende enrofloxacin. Gentag denne proces to gange mere.
- Efter den tredje vask tilsættes et par dråber saltvand til åbningen og lad det forblive der i 1 minut. Efter 1 minut skal du bruge et frisk stykke svampestrimmel til at absorbere eventuelt resterende saltvand. Gentag denne vaskeproces to gange mere, og efter den tredje vask tilsættes en lille dråbe saltvand til åbningen.
- Placer dækglasset over åbningen. Brug tang til at sikre, at glasset skyller ud over åbningen for at få billeder af god kvalitet.
- Mens du forsigtigt holder glasset på plads, skal du anvende cyanoacrylatklæbende gel (Table of Materials) omkring glasets omkreds for at forsegle vinduets kanter til kraniet. Sørg for ikke at lade limen sive ind under dækglasset, og hold så meget lim væk fra dækglassets overflade som muligt.
- Påfør et lag superlim over klæbegelen. Tilsæt et lag tandcementvæske over limen for at lade den hærde.
- Tag en helikopter-type hovedplade af passende størrelse og påfør et tyndt lag lim omkring den centrale åbning. Placer hovedpladen over dækglasset, og lad limen tørre kort.
- I et 1,5 ml mikrofugerør tilsættes tandcementpulver til 0,1 ml-mærket på røret. Tilsæt 7-8 dråber hurtighærdende, øjeblikkeligt klæbemiddel og bland. Træk i en 1 ml sprøjte med en 19 G nål, der er skåret for at skabe en større åbning.
- Blandingen injiceres gennem helikopterstangens sidehuller, indtil den siver fra begge sider. Påfør tandcement / klæbemiddelblandingen på resten af det udsatte kranium for at fastgøre hovedpladen til kraniet, hvilket vil reducere bevægelsesartefakter under billeddannelse.
- Lad blandingen lufttørre i mindst 15 minutter.
- Injicer musen med 0,5 ml saltvand subkutant for at hjælpe med genopretning.
6. Efter operationen
- Fjern musen fra den stereotaksiske ramme og returner den til buret.
- Placer en del af buret på et vandrecirkulationstæppe, rumgelvarmepuder eller isotermiske puder for at hjælpe med genopretning.
- Giv dyret en lille hjælp af madpiller og vådfoder ud over deres regelmæssige kost for yderligere at hjælpe med genopretning. Tilsæt ny madpille og våd mad hver dag efter operationen i løbet af genopretningen.
- Dagen efter operationen injiceres mus én gang med 5 mg/kg carprofen og 5 mg/kg enrofloxacin.
- På dag 2-6 injiceres musene én gang med 5 mg/kg carprofen og to gange med 5 mg/kg enrofloxacin, indtil den lokale IACUC har godkendt det. Adskil enrofloxacininjektionerne med mindst 8 timer.
- På dag 7-20 injiceres musene dagligt med 5 mg/kg carprofen.
7. Dyrs tilvænning til billeddannelse
- På dag 14 efter operationen skal du undersøge kranievinduet for optisk klarhed. Brug ikke mus med uklare eller på anden måde beskadigede vinduer (dvs. overdreven angiogenese).
- Kontroller for tdTomato-ekspression under et fluorescensmikroskop. Hvis mærkede celler kan identificeres, skal du fortsætte med dyrevanering.
- Første tilvænningsdag (håndtering)
- Hold musen i et par minutter, og returner den til buret efter håndtering. Gentag håndteringen tre gange med et interval på 15 minutter mellem sessionerne.
- Efter det tredje forsøg skal du vænne musen ved at pakke dyret ind i et lille stykke klud.
- Hold musen pakket ind i klud i ca. 1 min.
- Efter forsøget skal du returnere musen til sit bur. Gentag denne proces to gange mere, hvilket giver et interval på 15 minutter mellem hvert forsøg.
- Anden tilvænningsdag
- Vej og registrer musens vægt.
- Pak musen ind i klud, og fastgør den via hovedpladen til hovedfikseringsarmen i det luftløftede hjemmebur.
- Lad hjemmeburet være udsat for lyset.
- Lad musen forblive fastgjort i mobilhome-buret i 15 minutter.
- Efter tilvænning skal du fjerne musen fra hjemmeburet og slukke for luftstrømmen.
- Vej musen og returner den til sit bur. Pas på kun at inkludere mus, der ikke taber mere end 10% af deres kropsvægt. Ekskluder mus, der taber mere end 10% af deres vægt i løbet af en hvilken som helst tilvænningsdag fra billeddannelsesforsøg.
- Dag tre af tilvænning og videre
- Vej og registrer musens vægt, før du fastgør den til det luftløftede hjemmebur.
- Fastgør musen til det luftløftede hjemmebur.
- Dæk hjemmeburet med noget, der giver et mørkt interiør, såsom en kasse, og lad musen forblive fastgjort i 30 minutter.
- Efter 30 minutter skal du afdække hjemmeburet, fjerne musen og slukke for luftstrømmen.
- Vej og registrer musens vægt efter tilvænning.
- Gentag denne proces hver dag, og øg musens varighed fastgjort til hjemmeburet med 15 minutter. Fortsæt denne proces, indtil musen kan fastgøres til hjemmeburet i 1,5 time, da dette er den omtrentlige varighed af en to-foton-billeddannelsessession.
- For at vænne musen til støj skal du udføre nogle tilvænningssessioner på mikroskopet for at akklimatisere musen til lyden af laserscanningsspejlene. Ekskluder mus, der ikke vænner sig tilstrækkeligt (dvs. vokaliseringer og stressinduceret afføring).
8. Multifoton-billeddannelse
- Begynd billeddannelse 3 uger efter operationen for at give mulighed for vinduet at rydde.
- Udfør billeddannelse på et specialfremstillet eller kommercielt tilgængeligt multifotonmikroskop udstyret med en Ti:Sapphire-laser. Få billeder ved hjælp af et mål for vandnedsænkning med høj numerisk blænde (NA).
BEMÆRK: To-kanals billeddannelse opnås ved hjælp af et 565 nm dikroisk spejl og to eksterne fotomultiplikatorrør. Et 535/50 båndpasfilter bruges til at detektere GCaMP6f-emission, og et 610/75 båndpasfilter bruges til at detektere tdTomato. Et 25x vandnedsænkningsmål (1,05 NA) og resonansscannere blev brugt til at erhverve billeder vist i figur 1 og figur 2. Hver region af interesse bestod af en stak billeder adskilt aksialt med 1 μm. Hver optisk sektion blev indsamlet ved 512 x 512 pixels, 0,18 μm / pixel. Billeder blev erhvervet fra forbenet i den primære motoriske cortex som bestemt af stereotaksiske koordinater. - Indstil laserens bølgelængde til 920 nm (990 nm, hvis der anvendes en rødforskudt GECI).
- Placer musen på mobilhome-buret, og fastgør hovedpladen til hovedfikseringsarmen.
- Tilsæt et par dråber vand til midten af vinduet.
- Brug mikroskopets vidvinkeltilstand til at vælge 2-3 positioner af let identificerbar vaskulatur. Gem billederne af disse blodkar, og optag X- og Y-koordinaterne, der vises på motorcontrolleren, for at flytte de tdTomato-mærkede dendritter til efterfølgende billeddannelsessessioner. Juster X- og Y-koordinaterne hver gang for at tilpasse sig de gemte billeder af blodkarrene.
- Når vaskulaturen er blevet afbildet og positioner registreret, skal du lokalisere regionerne med neuroner, der udtrykker tdTomato (figur 1). Forestil dig de synaptiske strukturer (dendritter og axoner) af neuroner og GCaMP6f-aktivitet i astrocytter.
BEMÆRK: Dendritterne vil tjene som landemærker for pålideligt at vende tilbage til de samme regioner og afbilde de samme dendritter og astrocytter over gentagne dage. Der blev ikke observeret noget påviseligt skift i billeddannelsesplanet med stabil hovedfiksering og efter tilvænning til hovedfiksering. Forskydning, der forekommer i X- og Y-retningen, er bevægelseskorrigeret. - Efter billeddannelse skal musen returneres til buret.
BEMÆRK: Mus holdes typisk på omfanget i højst 2 timer. Når billeddannelsen varer i lang tid, kan vandet under målet tørre. Vand skal tilsættes under forsøgene. Alternativt kan en ultralydsgel bruges i stedet for vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten af kranievinduet kan vurderes ud fra, hvor skarpe neuronale strukturer ser ud. I et godt vindue er dendritiske rygsøjler tydeligt synlige (figur 1). Med de strukturelle og positionelle data lagret kan det samme dyr afbildes gentagne gange i dage, uger eller måneder for at undersøge de samme celler (figur 1). Billederne i figur 1 blev opnået fra forbenet i den primære motoriske cortex (i et 5 mm vindue). En række parametre kan måles, herunder densitet og dynamik af dendritiske rygsøjler og aksonale boutons for at studere strukturel synaptisk plasticitet. Astrocytisk aktivitet kan studeres ved at analysere den spatiotemporale dynamik i calciumsignalering (figur 2). Afhængigt af mikroskopets kapacitet (dvs. resonansscannere, piezomotor, der styrer målet) og det eksperimentelle spørgsmål, kan time-lapse-billeddannelse udføres i et enkelt brændplan eller i et volumen eller multiregion for at overvåge calciumaktivitet ved den ønskede erhvervelsesfrekvens.
Figur 1: Gentagen billeddannelse af dendritter og astrocytter over dage. En dendrit, der udtrykker tdTomato (magenta), muliggør identifikation og gentagen billeddannelse af GCaMP6f-ekspressiv astrocytter (hvid) i umiddelbar nærhed. Ca2+ aktivitet inden for astrocytter vises på forskellige tidspunkter på forskellige dage. Synaptisk strukturel plasticitet kan afbildes samtidigt. To nye rygsøjler, der dukkede op på dag 2, er markeret med pile. Mens den ene rygsøjle vedvarede og var synlig på dag 5 (blå pil), blev den anden rygsøjle elimineret (grøn pil). Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeddannelse af astrocytisk calciumsignalering. Billeder, der viser Ca2+ aktivitet fra en astrocyt, der udtrykker GCaMP6f. Paneler viser Ca2+ aktivitet registreret fra et volumen på 4 μm på forskellige tidspunkter under erhvervelsen. Calciumsignalering i processer og mikrodomæner kan observeres i hvileperioderne. En global begivenhed, der omfatter hele cellen, kan observeres under en bevægelseskamp ved 188 s. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi præsenteret en protokol for implantation af kroniske kranievinduer til in vivo-billeddannelse af kortikale astrocytter og neuroner i vågne, hovedbeherskede mus på et luftløftet hjemmebur. Der er givet specifikke eksempler på kranievinduesapplikationen til billeddannelse af astrocytter, der udtrykker GECIS'er og neuronale synaptiske strukturer. Ved brug af multifotonmikroskopi kan astrocytisk calciumsignaldynamik og strukturel synaptisk dynamik registreres gentagne gange over dage.
Et kronisk kranievindue giver god optisk billedkvalitet og gør det muligt at udføre flere billeddannelsessessioner af de samme neuronale og glialstrukturer. Fremgangsmåden gør det også muligt at udføre intrakraniale virale injektioner, inden kraniotomien dækkes med et dækglas.
Brugerne bør være opmærksomme på en række begrænsninger, der opstår ved implantation af kroniske kranievinduer. Erfaring og megen øvelse er nødvendig for at opnå et vindue af høj kvalitet og for at sikre dyrs overlevelse. Desuden er operationen invasiv og kan resultere i en inflammatorisk reaktion. Farmakologisk behandling under kirurgi og postkirurgisk genopretning omfatter antiinflammatoriske lægemidler og antibiotika31. Anvendelsen af antiinflammatoriske lægemidler er muligvis ikke hensigtsmæssig i undersøgelser, der undersøger modeller for neuroinflammation, da disse lægemidler også kan påvirke fænomenet under undersøgelse.
For nylig har meningeal lymfangiogenese vist sig at forekomme som reaktion på kranial vinduesimplantation32. Således er det kroniske kranievindue muligvis ikke acceptabelt for undersøgelser, der undersøger meningeale lymfekar. Det er vigtigt, at en 2-3-ugers ventetid efter operationen er nødvendig før billeddannelsesforsøg31,33. Derudover begrænser musenes alder såvel som restitutionstiden efter operationen evnen til at afbilde meget tidlige udviklingshændelser. Mens kranievinduer kan implanteres i yngre mus (P15-21)34, skal mulige bivirkninger, såsom betændelse, overvejes.
Som et alternativ til det kroniske kranievindue kan der også fremstilles tynde kraniepræparater. Denne metode resulterer i udtynding af kraniet over det område, der er af interesse, før billeddannelse. Et tyndt kranievindue er mindre invasivt og overvinder behovet for antiinflammatorisk lægemiddeladministration, hvilket gør det til et valg i undersøgelser, der undersøger modeller af neuroinflammation og neuroimmune interaktioner. Skulle gentagen billeddannelse dog ønskes, skal kraniet tyndes igen inden billeddannelse, og knoglen kan kun tyndes igen et begrænset antal gange, før billedkvaliteten forringes35.
Selvom en modificeret version af en forstærket tyndkraniumsmetode, der ikke kræver rethinning, er blevet beskrevet36, kan en ikke-ensartet kranietykkelse forårsage sfæriske aberrationer, hvilket resulterer i forvrængning af fluorescerende strukturer37. Når kvantitative målinger registreres, såsom calciumsignaldynamik38 eller niveauer af synaptiske proteiner27, i modsætning til identifikation af strukturer såsom dendritiske rygsøjler, giver det kroniske kranievindue således et mere optisk stabilt og pålideligt præparat. For langsgående in vivo-billeddannelse er indsættelsen af kraniale vinduer således den overlegne metode til undersøgelse af ændringer som følge af lægemiddelbehandling39, træning i et adfærdsparadigme 4,25 og synaptisk ombygning i neurologiske lidelser11,27.
Den beskrevne procedure er teknisk udfordrende og udgør en barriere for billedoptagelse af høj kvalitet. Der skal udvises ekstrem forsigtighed ved hvert trin for at sikre, at vinduet forbliver fri for infektion, og skader på det underliggende væv undgås. Dette omfatter skånsom skrabning af bindevæv på kraniet, tage tilstrækkelige pauser til afkøling af knoglen ved boring, sikre ensartet udtynding for at lette let knoglefjernelse, forhindre hjerne hævelse og ekstrem omhu for ikke at beskadige dura mater under operationen. Kun de bedste vinduespræparater forbliver optisk gennemsigtige i længere perioder med billeddannelse.
Mens ændringer i synaptiske strukturer kan afbildes i bedøvede mus over dage, foretrækkes dette ikke, når man undersøger astrocytcalciumsignalering, da anæstesi har vist sig at forstyrre astrocytcalciumsignalering in vivo40. For at udføre in vivo-billeddannelse i vågne, hovedbeherskede mus er det vigtigt at vænne dyret til billeddannelsesforholdene i mobilhome-buret, fritsvævende løbebånd, luftløftet styrofoamkugle eller andet apparat. Korrekt tilvænning vil ikke kun reducere stress under billeddannelse, men også virke for at minimere bevægelsesartefakter under billeddannelsessessionerne.
Sammenfattende er in vivo multifotonmikroskopi gennem et kronisk kranievindue et nyttigt værktøj til at studere strukturelle og funktionelle ændringer af celler i cortex. Ved hjælp af cellespecifikke fluorescerende farvestoffer og reportere er det muligt at studere cellulær morfologi, interaktioner og aktivitet. Med den langsgående billeddannelse, der er tilladt af kroniske kranievinduer, er det muligt at undersøge, hvordan synaptiske strukturer ændrer sig og udvikler sig over tid13,14. Ved hjælp af den protokol, der præsenteres her, er det muligt at undersøge calciumsignaldynamikken i astrocytter på grund af sensorisk stimulering 23,38, bevægelse eller forskrækkelse 6,41, sygdom15,42 eller andre parametre af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
