Summary
Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Davranış gösteren hayvanlarda nöronların ve gliaların hücresel fizyolojisini tam olarak anlamak için, morfolojilerini görselleştirmek ve davranışta bulunan farelerde in vivo aktivitelerini kaydetmek gerekir. Bu yazıda, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesine izin vermek için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Genetik stratejiler ve viral enjeksiyonlarla kombinasyon halinde, spesifik hücreleri ve ilgilenilen bölgeleri yapısal veya fizyolojik belirteçlerle etiketlemek mümkündür. Bu protokol, her iki hücrenin bir kraniyal pencereden eşzamanlı görüntülenmesi için korteksteki GCaMP6 eksprese eden astrositlerin yakınındaki nöronları etiketlemek için viral enjeksiyonların nasıl birleştirileceğini göstermektedir. Aynı hücrelerin çoklu foton görüntülemesi, uyanık, davranan hayvanlarda günlerce, haftalarca veya aylarca gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, araştırmacılara hücresel dinamikleri gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem sunar ve sinirbilimdeki bir dizi soruyu cevaplamak için uygulanabilir.
Introduction
Farelerin korteksinde in vivo multifoton floresan mikroskobu yapabilme yeteneği, hücresel sinyalizasyon ve yapı 1,2,3,4,5,6,7,8,9, hastalık patolojisi 10,11 ve hücresel gelişim 12,13 çalışması için çok önemlidir. . Kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu ile uzunlamasına görüntüleme mümkündür ve canlı hayvanlarda kortikal alanların günlerce, haftalarca veya aylarca tekrarlanan görüntülenmesine izin verir13,14. Multifoton mikroskopisi, gelişmiş derinlik sondalaması ve kullanılan kızılötesi lazerle ilişkili azaltılmış fotohasar nedeniyle in vivo, tekrarlanan görüntüleme için idealdir. Bu, çeşitli kortikal bölgelerdeki spesifik hücrelerin moleküler ve hücresel dinamiklerinin incelenmesine izin verir.
Multifoton mikroskopisi, farelerde nöronal ve glial hücrelerin in vivo görüntülenmesinde kullanılmıştır 15,16,17,18,19,20. Belirli hücre tiplerini ve ilgi alanlarını etiketlemek için çeşitli stratejiler uygulanabilir. Yaygın bir yaklaşım, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin ekspresyonunu, Cre-Lox rekombinasyon sistemini kullanarak hücreye özgü bir şekilde yönlendirmektir. Bu, genetiği değiştirilmiş farelerle gerçekleştirilebilir, örneğin, tdDomates "floxed" fareyi (Ai14) ilgi çekici bir destekleyicinin altında Cre-rekombinaz eksprese eden bir fare ile geçmek21. Alternatif olarak, viral enjeksiyonlarla hücre ve bölgeye özgü etiketleme sağlanabilir. Burada, hücreye özgü bir promotor altında Cre rekombinazını kodlayan bir virüs ve ilgilenilen flokslanmış bir geni kodlayan bir virüs, tanımlanmış bir bölgeye enjekte edilir. Her iki viral vektörü de alan uygun hücre tipleri daha sonra istenen gen (ler) i ifade edecektir. Bu genler, hücresel morfoloji22'deki değişiklikleri görüntülemek için tdDomates gibi yapısal belirteçler veya kalsiyum dinamiklerini incelemek için GCaMP ve / veya RCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler)olabilir 23. Genetik rekombinasyon yöntemleri, bir veya daha fazla hücre tipini etiketlemek için ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanabilir. Transgenik fareler veya viral yapılar (sınırlı paketleme kapasitesine sahip) gerektirmeyen üçüncü bir yaklaşım, DNA yapılarının utero elektroporasyonudur24. Elektroporasyonun zamanlamasına bağlı olarak, farklı hücre tiplerihedeflenebilir 25,26,27.
Multifoton görüntüleme yapılırken, fareler uyanıkken veya anestezi altındayken görüntülenebilir. Uyanık farelerin görüntülenmesi, fareyi takılı bir kafa plakası28 ile sabitleyerek gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, serbest yüzen, hava destekli strafor toplar29, serbest yüzen koşu bantları1 veya farelerin bağlı bir kafa plakası ile tutturulduğu ve açık bir odada hareket etmesine izin verilen hava kaldırılmış bir ev kafesi sistemi gibi yöntemler kullanılarak hayvanın nispeten serbest dolaşımına izin vererek daha az stresli hale getirilir. Bu görüntüleme koşullarının her biri için, önce fareleri görüntüleme kurulumuna alıştırmak gerekecektir. Bu yazıda, hava ile kaldırılmış bir ev kafesi sistemi kullanılarak alışkanlık ve görüntüleme prosedürü açıklanmaktadır.
Bu protokol, kortekste uzunlamasına in vivo görüntüleme için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonunu tanımlar. Burada, kalsiyum sinyal dinamiklerini izlemek için astrositlerde GCaMP6f'yi şartlı olarak eksprese eden fareleri kullanacağız. Ayrıca, bu makale tdTomato'yu nöronlar için bir etiket olarak kullanarak viral enjeksiyonlar için prosedürü açıklamaktadır. Bu, nöronal sinaptik yapıdaki değişikliklerin belirlenmesine ve / veya aynı astrositin tekrarlanan görüntülenmesini sağlayan yapısal bir belirteç olarak kullanılabilirliğe izin verir. Protokol boyunca, çoklu foton mikroskobundan elde edilen görüntülerin mümkün olan en iyi kalitesini sağlamak için önemli adımlar vurgulanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki IACUC tarafından onaylanan kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Ameliyattan önce
- Viral enjeksiyonlar için pipetler hazırlayın. Pipet çektirici kullanarak borosilikat cam kılcal damarları çekin ve pipeti 20° açıyla eğimlendirin. Pipetleri gece boyunca sterilize edin.
- Taze steril jel köpük parçalarını küçük kareler halinde keserek hazırlayın. Jel köpüğü 0,5 mL salin içeren steril bir mikrofüj tüpüne batırın. Jel köpüğü kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca tuzlu suya batırın.
- İnce şeritler halinde keserek taze sünger şerit parçaları hazırlayın.
- Ameliyattan yirmi dakika önce, 4-6 haftalık GLAST-CreER / GCaMP6f farelere intraperitoneal olarak beyin şişmesini önlemek için 0.2 mg / kg deksametazon ve iltihabı azaltmak için 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
NOT: Astrositlerin yaklaşık% 40'ında GCaMP6f'nin rekombinasyonunu ve ekspresyonunu indüklemek için, GLAST-CreER / GCaMP6f farelerine, art arda 5 gün boyunca 3 haftada 100 mg / kg tamoksifen enjekte edildi.
2. Ameliyatın başlaması
- 20 dakika sonra, fareleri yaklaşık 1,5 dakika boyunca 1 L / dak akış hızında oksijenle% 3 izofluran ile uyuşturun.
- Anestezi uygulandıktan sonra, ameliyat boyunca vücut ısısını 37 ° C'lik bir seviyede tutmak için fareyi su devridaim battaniyesi üzerine oturan stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin. Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını kullanarak fareyi çerçeveye sabitleyin. Burun kelepçesinin ve kulak çubuklarının, işlem sırasında başın hareket etmeyeceği, ancak kafatasının hasar göreceği kadar sıkı olmadığından emin olun.
- Anesteziyi% 1-1.5 izofluran ile oksijen ile 1-2 L / dak akış hızında tutun. Bazı hayvanların sedasyonu sürdürmek için az ya da çok izoflurana ihtiyaç duyabileceğini unutmayın. Hayvanın nefes alışını, ayak parmağı ve kuyruk sıkışma reflekslerini izleyin ve izofluranı uygun şekilde ayarlayın.
- İşlem sırasında gözlerin kurumasını önlemek için pamuklu bir uç aplikatörü kullanarak her göze göz merhemi uygulayın.
- Kemirgen düzelticileri kullanarak, saçları boyundan gözleri geçmek için tıraş edin. Hayvanın bıyıklarının yanlışlıkla kesilmediğinden emin olmak için dikkatli olun.
- Tıraş edilen bölgeyi bir iyot hazırlama pedi ve ardından bir alkol hazırlama pedi ile temizleyin.
- Steril doku forseps ve cerrahi makas kullanarak, cildi ön dikişlerden ön dikişlerden lambda'ya kadar arkadan bregmaya kadar kesin ve çıkarın.
- Cilt çıkarıldıktan sonra, kafatasının kanamasını en aza indirmek için kafatasına yaklaşık 0.1 mL% 1 ksilokain (epinefrin 1: 200.000 ile lidokain) ekleyin.
- Bir sapa tutturulmuş steril boyutta 11 karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak, bağ dokusunu kafatasından hafifçe kazıyın. Kafatasının kenarına yakın bağ dokusunu çıkarırken ekstra özen gösterin, çünkü kalan herhangi bir doku daha sonra camın veya kafa plakasının güçlü bir şekilde yapışmasını önleyebilir.
- Kafatasından gevşek bağ dokusunu çıkarmak için steril doku forseps kullanın.
- Steril pamuk ucu aplikatörleri kullanarak, kafatasından kalan ksilokaini temizleyin.
- Tamamlandığında, asetona batırılmış steril bir pamuk ucu aplikatörü kullanarak kafatasını iyice yağdan arındırın. Kafatasını hemen üfleyerek kurutmak için basınçlı hava kullanın.
3. Kraniotomi
- İnce noktalı bir işaretleyici ve bir cetvel kullanarak, istenen konumdaki açıklık için uygun boyutu ölçün. Kapak camının boyutuyla (3 veya 5 mm çapında) karşılaştırarak açıklığın boyutunu onaylayın; açıklığın kapak camının boyutundan biraz daha küçük olduğundan emin olun.
- Bir diş matkabı kullanarak, kemiği incelterek açıklığın ana hatlarını yavaş yavaş izleyin. Kemiğin delinmesini önlemek için yavaşça delin ve kemiğin incelmesini kolaylaştırmak için eşmerkezli dairelerde delin.
- Her konsantrik geçişten sonra, delinen bölgeye bir veya iki damla steril salin ekleyin. Kemiğin aşırı ısınmasını ve altta yatan duraya zarar vermesini önlemek için salinin en az 10 s oturmasına izin verin.
- Kalan tuzlu suyu emmek için steril bir pamuk ucu aplikatörü kullanın. Sondaja devam etmeden önce kalan tüm tuzlu suyun buharlaştığından emin olmak için alanın üzerine basınçlı hava üfleyin. Kalan kemik kalıntılarını üflemek için bunu yapın.
- Kemik çıkarılmak üzere yeterince inceltilene kadar 3.2-3.4 adımlarını tekrarlayın.
- İnceltilmiş kafatasının hareket ettiğini kontrol etmek için kemiğin orta bölgesine ince forseps ile hafifçe iterek kemiğin çıkarılmak üzere yeterince inceltildiğinden emin olun. Altta yatan vaskülatür, sondajın gerçekleştiği yerde görünür olmalıdır. Kemiğin, incelmenin meydana geldiği yerde çatlayacakmış gibi görünebileceğini gözlemleyin.
NOT: Bu aşamada eğitim, kemiğin ne zaman uygun şekilde inceltildiğini belirlemek için çok önemlidir. - Kemiği çıkarmaya çalışmadan önce, tamamen yatıştırıldığından emin olmak için fareyi kontrol edin. Değilse, kemiği çıkarırken beyin şişmesini önlemek için izofluran bakımını kademeli olarak artırın.
- İnceltilmiş kafatasına saline doymuş küçük bir parça jel köpük ekleyin. İnceltilmiş kafatasına bir veya iki damla daha salin ekleyin.
NOT: İnceltilmiş kafatası üzerinde bol miktarda salin bulunması, kemik kapağını çıkarırken kanamayı azaltmaya ve durayı korumaya yardımcı olur. - Minyatür 15° sivri uçlu bir bıçak kullanarak, bıçağı inceltilmiş kemiğe dikkatlice yerleştirin ve inceltilmiş kemik boyunca kesin. Jel köpüğü tuzlu suya batırılmış halde tutun, oluşabilecek kanamaları durdurmaya hazır olun.
- Forseps kullanarak, kemiği dikkatlice kaldırın ve çıkarın. Altta yatan doku ve vaskülatüre zarar vermemek için mümkün olduğunca nazik olun. Dura mater'e zarar vermemek için çok dikkatli olun.
- Kemik kapağı çıkarıldıktan sonra, kortekse salin içine doymuş taze bir jel köpük parçası ekleyin. Jel köpüğün kurumasını önlemek için birkaç damla salin ekleyin, çünkü bu altta yatan dokuya zarar verecektir.
4. Viral enjeksiyonlar
- Stereotaksik bir cihaz kullanarak viral enjeksiyonlar yapın.
- AAV1'i hazırlayın. CaMKII.0.4.Cre (3 × 1013 genom kopyası (GC) / mL'lik titre) 1:5,000'de salin içindeki seri seyreltmelerle.
- AAV1 karışımını hazırlayın. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) ve AAV1. CAG. FLEX.tdKüçük bir parafilm parçası üzerinde domates (5 ×10 12 GC/mL titre).
- Uç boyutu 20 μm olan steril eğimli cam pipeti, solüsyonun üzerine nazikçe yerleştirerek virüs karışımıyla doldurun.
- Pipet, beynin yüzeyine değecek şekilde alçaltın ve L2/3 enjeksiyonları için ilave 200-300 μm için alçaltmaya devam edin. Hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemi kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız), 2 dakika boyunca 12-15 kez basınç enjekte edin (20 psi, 9 ms darbe süresi). Pipetin tıkanmadığından emin olmak için her enjeksiyonda pipet damlasındaki menisküse dikkat edin.
- Enjekte edildikten sonra, geri akışı önlemek için pipeti beyinde 4-5 dakika bekletin. Pipetin yavaşça geri çekilmesini sağlayın.
- Enjeksiyonları 2-3 bölgede tekrarlayın (yaklaşık 500 μm aralık).
- Cre virüsünün seri seyreltilmesi için kullanılan kullanılmış cam pipetleri, parafilmi, pipet uçlarını ve mikrofüj tüplerini %10 ağartıcıya atın.
5. Kraniyal pencerenin implantasyonu
- Herhangi bir jel köpüğü çıkarın ve kalan salini emmek için küçük bir sünger şerit şeridi kullanın.
- Açıklığa birkaç damla antibiyotik enrofloksasin (22.7 μg / mL) ekleyin ve 1 dakika boyunca orada kalmasına izin verin. 1 dakika sonra, kalan enrofloksasini emmek için taze bir sünger şerit parçası kullanın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
- Üçüncü yıkamadan sonra, açıklığa birkaç damla salin ekleyin ve 1 dakika boyunca orada kalmasına izin verin. 1 dakika sonra, kalan salini emmek için taze bir sünger şerit parçası kullanın. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra açıklığa küçük bir damla salin ekleyin.
- Kapak camını açıklığın üzerine yerleştirin. İyi kalitede görüntüler elde etmek için camın açıklığın üzerinde aynı hizada olduğundan emin olmak için forseps kullanın.
- Camı yavaşça yerinde tutarken, pencerenin kenarlarını kafatasına kapatmak için camın çevresine siyanoakrilat yapışkan jel (Malzeme Tablosu) uygulayın. Yapıştırıcının kapak camının altına sızmasına izin vermediğinizden emin olun ve kapak camının yüzeyinden mümkün olduğunca fazla yapıştırıcı tutun.
- Yapışkan jelin üzerine bir süper yapıştırıcı tabakası uygulayın. Sertleşmesini sağlamak için yapıştırıcının üzerine bir diş çimento sıvısı tabakası ekleyin.
- Uygun boyutta bir helikopter tipi kafa plakası alın ve merkezi açıklığın etrafına ince bir yapıştırıcı tabakası uygulayın. Kafa plakasını kapak camının üzerine yerleştirin ve yapıştırıcının kısa bir süre kurumasını bekleyin.
- 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde, tüp üzerindeki 0,1 mL işaretine diş çimento tozu ekleyin. 7-8 damla hızlı sertleşen, anında yapışkan ekleyin ve karıştırın. Daha büyük bir açıklık oluşturmak için kesilmiş 19 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya çekin.
- Karışımı, her iki taraftan da sızana kadar helikopter çubuğunun yan deliklerinden enjekte edin. Diş çimentosu / yapıştırıcı karışımını, kafa plakasını kafatasına sabitlemek için maruz kalan kafatasının geri kalanına uygulayın, bu da görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltacaktır.
- Karışımın en az 15 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin.
- İyileşmeye yardımcı olmak için fareye deri altından 0,5 mL salin enjekte edin.
6. İşlem sonrası
- Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kafesine geri getirin.
- İyileşmeye yardımcı olmak için kafesin bir kısmını su devridaim battaniyesine, uzay jeli ısıtma pedlerine veya izotermal pedlere yerleştirin.
- İyileşmeye daha fazla yardımcı olmak için hayvana, düzenli diyetlerine ek olarak, küçük bir yiyecek topağı ve ıslak yiyecek yardımı sağlayın. İyileşme süresi boyunca ameliyattan sonra her gün yeni yiyecek peleti ve ıslak yiyecek ekleyin.
- Ameliyattan sonraki gün, farelere bir kez 5 mg / kg karprofen ve 5 mg / kg enrofloksasin enjekte edin.
- 2-6. günlerde, farelere bir kez 5 mg / kg karprofen ve iki kez 5 mg / kg enrofloksasin enjekte edin, yerel IACUC tarafından onaylanmayı bekleyin. Enrofloksasin enjeksiyonlarını en az 8 saat ayırın.
- 7-20. günlerde, farelere günlük 5 mg / kg karprofen enjekte edin.
7. Görüntüleme için hayvan alışkanlığı
- Ameliyattan sonraki 14. günde, optik netlik için kraniyal pencereyi inceleyin. Belirsiz veya başka bir şekilde hasar görmüş pencereleri olan fareleri kullanmayın (yani, aşırı anjiyogenez).
- Bir floresan mikroskobu altında tdDomates ekspresyonunu kontrol edin. Etiketlenmiş hücreler tanımlanabilirse, hayvan alışkanlığına devam edin.
- Alışkanlığın ilk günü (kullanım)
- Fareyi birkaç dakika tutun ve kullandıktan sonra kafesine geri koyun. İşlemi seanslar arasında 15 dakikalık aralıklarla üç kez tekrarlayın.
- Üçüncü denemeden sonra, hayvanı küçük bir bez parçasına sararak fareyi alışkanlık haline getirin.
- Fareyi beze sarılmış olarak yaklaşık 1 dakika tutun.
- Denemeden sonra, fareyi kafesine geri getirin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın ve her deneme arasında 15 dakikalık bir aralığa izin verin.
- Alışkanlığın ikinci günü
- Fare ağırlığını tartın ve kaydedin.
- Fareyi beze sarın ve kafa plakası aracılığıyla hava ile kaldırılan ev kafesinin kafa sabitleme koluna sabitleyin.
- Ev kafesini ışığa açık bırakın.
- Farenin mobil ev kafesinde 15 dakika boyunca sabit kalmasına izin verin.
- Alışkanlıktan sonra, fareyi ev kafesinden çıkarın ve hava akışını kapatın.
- Fareyi tartın ve kafesine geri koyun. Sadece vücut ağırlığının% 10'undan fazlasını kaybetmeyen fareleri dahil etmeye dikkat edin. Herhangi bir alışkanlık gününde ağırlıklarının% 10'undan fazlasını kaybeden fareleri görüntüleme deneylerinden hariç tutun.
- Alışkanlığın üçüncü günü ve sonrası
- Fare ağırlığını hava ile kaldırılan ev kafesine sabitlemeden önce tartın ve kaydedin.
- Fareyi havayla kaldırılmış ev kafesine sabitleyin.
- Ev kafesini kutu gibi karanlık bir iç mekan sağlayacak bir şeyle örtün ve farenin 30 dakika boyunca güvenli kalmasına izin verin.
- 30 dakika sonra, ev kafesini ortaya çıkarın, fareyi çıkarın ve hava akışını kapatın.
- Alışkanlıktan sonra fare ağırlığını tartın ve kaydedin.
- Bu işlemi her gün tekrarlayın, farenin ev kafesine sabitlenme süresini 15 dakika artırın. Fare, iki fotonlu görüntüleme oturumunun yaklaşık süresi olduğundan, fare 1,5 saat boyunca ev kafesine sabitlenene kadar bu işleme devam edin.
- Fareyi gürültüye alıştırmak için, fareyi lazer tarama aynalarının seslerine alıştırmak için mikroskopta bazı alışkanlık oturumları gerçekleştirin. Yeterince alışkanlık kazanamayan fareleri hariç tutun (yani, seslendirmeler ve strese bağlı dışkılama).
8. Çoklu foton görüntüleme
- Pencerenin temizlenmesine izin vermek için ameliyattan 3 hafta sonra görüntülemeye başlayın.
- Ti:Sapphire lazer ile donatılmış özel yapım veya ticari olarak temin edilebilen bir multifoton mikroskopta görüntüleme gerçekleştirin. Yüksek sayısal diyaframlı (NA) suya daldırma hedefini kullanarak görüntüler elde edin.
NOT: İki kanallı görüntüleme, 565 nm dikroik ayna ve iki harici fotoçarpan tüpü kullanılarak elde edilir. GCaMP6f emisyonunu tespit etmek için 535/50 bandpass filtresi kullanılır ve tdTomato'yu tespit etmek için 610/75 bandpass filtresi kullanılır. Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen görüntüleri elde etmek için 25x suya daldırma hedefi (1.05 NA) ve rezonans tarayıcıları kullanılmıştır. İlgilenilen her bölge, eksenel olarak 1 μm ile ayrılmış bir görüntü yığınından oluşuyordu. Her optik bölüm 512 x 512 piksel, 0,18 μm/piksel olarak toplandı. Görüntüler, stereotaksik koordinatlarla belirlenen primer motor korteksin ön ayak bölgesinden elde edildi. - Lazerin dalga boyunu 920 nm'ye (kırmızıya kaymış bir GECI kullanılıyorsa 990 nm) ayarlayın.
- Fareyi mobil ev kafesine yerleştirin ve kafa plakasını kafa sabitleme koluna kelepçeleyin.
- Pencerenin ortasına birkaç damla su ekleyin.
- Mikroskobun geniş alan modunu kullanarak, kolayca tanımlanabilen vaskülatürden 2-3 pozisyon seçin. Bu kan damarlarının görüntülerini kaydedin ve sonraki görüntüleme oturumları için tdDomates etiketli dendritlerin yerini değiştirmek için motor kontrolöründe görünen X ve Y koordinatlarını kaydedin. Kan damarlarının kaydedilmiş görüntüleriyle yeniden hizalamak için her seferinde X ve Y koordinatlarını ayarlayın.
- Vaskülatür görüntülendikten ve pozisyonlar kaydedildikten sonra, tdTomato eksprese eden nöronların bulunduğu bölgeleri bulun (Şekil 1). Astrositlerdeki nöronların sinaptik yapılarını (dendritler ve aksonlar) ve GCaMP6f aktivitesini görüntüleyin.
NOT: Dendritler, aynı bölgelere güvenilir bir şekilde geri dönmek ve tekrarlanan günlerde aynı dendritleri ve astrositleri görüntülemek için işaretler olarak hizmet edecektir. Stabil kafa fiksasyonu ile ve kafa fiksasyonuna alıştıktan sonra görüntüleme düzleminde saptanabilir bir kayma gözlenmedi. X ve Y yönlerinde meydana gelen yer değiştirme, hareket düzeltmelidir. - Görüntülemeden sonra fareyi kafesine geri getirin.
NOT: Fareler tipik olarak en fazla 2 saat boyunca kapsamda tutulur. Görüntüleme uzun sürdüğünde, hedefin altındaki su kuruyabilir. Deneyler sırasında su eklenmelidir. Alternatif olarak, su yerine ultrasonik bir jel kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kraniyal pencerenin kalitesi, nöronal yapıların ne kadar net göründüğü ile değerlendirilebilir. İyi bir pencerede, dendritik dikenler açıkça görülebilir (Şekil 1). Saklanan yapısal ve konumsal verilerle, aynı hayvan aynı hücreleri incelemek için günlerce, haftalarca veya aylarca tekrar tekrar görüntülenebilir (Şekil 1). Şekil 1'deki görüntüler primer motor korteksin ön ayak bölgesinden (5 mm'lik bir pencerede) elde edilmiştir. Yapısal sinaptik plastisiteyi incelemek için dendritik dikenlerin ve aksonal butonların yoğunluğu ve dinamikleri de dahil olmak üzere çeşitli parametreler ölçülebilir. Astrositik aktivite, kalsiyum sinyallemesinin uzaysal zamansal dinamiklerini analiz ederek incelenebilir (Şekil 2). Mikroskop yeteneklerine (yani, rezonans tarayıcıları, hedefi kontrol eden piezo motoru) ve deneysel soruya bağlı olarak, hızlandırılmış görüntüleme, istenen elde etme frekansında kalsiyum aktivitesini izlemek için tek bir odak düzleminde veya bir hacimde veya çok bölgede gerçekleştirilebilir.
Şekil 1: Dendritlerin ve astrositlerin günler boyunca tekrarlanan görüntülemesi. TdDomates (macenta) eksprese eden bir dendrit, GCaMP6f eksprese eden astrositlerin (beyaz) yakın mesafede tanımlanmasına ve tekrarlanan görüntülenmesine izin verir. Astrositler içindeki Ca2+ aktivitesi, farklı günlerde farklı zaman noktalarında gösterilir. Sinaptik yapısal plastisite aynı anda görüntülenebilir. 2. günde ortaya çıkan iki yeni diken oklarla işaretlenmiştir. Bir omurga devam ederken ve 5. Günde görünür iken (mavi ok), diğer omurga ortadan kaldırıldı (yeşil ok). Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Astrositik kalsiyum sinyalizasyonunun görüntülenmesi. GCaMP6f'yi ifade eden bir astrositten Ca2+ aktivitesini gösteren görüntüler. Paneller, edinme sırasında farklı zaman noktalarında 4 μm'lik bir hacimden kaydedilen Ca2+ aktivitesini gösterir. Proseslerde ve mikro alanlarda kalsiyum sinyalizasyonu dinlenme dönemlerinde gözlemlenebilir. Tüm hücreyi kapsayan küresel bir olay, 188 s'de bir hareket nöbeti sırasında gözlemlenebilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, havayla kaldırılmış bir ev kafesinde uyanık, kafa ile kısıtlanmış farelerde kortikal astrositlerin ve nöronların in vivo görüntülenmesi için kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu için bir protokol sunduk. GECI'leri ve nöronal sinaptik yapıları eksprese eden astrositlerin görüntülenmesi için kraniyal pencere uygulamasına özel örnekler verilmiştir. Multifoton mikroskobu kullanımı ile astrositik kalsiyum sinyal dinamikleri ve yapısal sinaptik dinamikler günler boyunca tekrar tekrar kaydedilebilir.
Kronik bir kraniyal pencere iyi optik görüntüleme kalitesi sağlar ve aynı nöronal ve glial yapıların birden fazla görüntüleme seansının yapılmasına izin verir. Yaklaşım ayrıca, kraniyotomi bir kapak camı ile kaplanmadan önce intrakraniyal viral enjeksiyonların yapılmasını mümkün kılar.
Kullanıcılar, kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu yoluyla ortaya çıkan bir takım sınırlamaların farkında olmalıdır. Yüksek kaliteli bir pencere elde etmek ve hayvanların hayatta kalmasını sağlamak için deneyim ve çok fazla uygulamaya ihtiyaç vardır. Ayrıca, ameliyat invazivdir ve enflamatuar bir yanıtla sonuçlanabilir. Cerrahi ve cerrahi sonrası iyileşme sırasında farmakolojik tedavi, anti-enflamatuar ilaçlar ve antibiyotikleri içerir31. Anti-enflamatuar ilaçların kullanımı, nöroinflamasyon modellerini araştıran çalışmalarda uygun olmayabilir, çünkü bu ilaçlar da incelenen fenomeni etkileyebilir.
Daha yakın zamanlarda, meningeal lenfanjiyogenezin kraniyal pencere implantasyonuna yanıt olarak ortaya çıktığı gösterilmiştir32. Bu nedenle, kronik kraniyal pencere meningeal lenfatik damarları araştıran çalışmalar için kabul edilebilir olmayabilir. Daha da önemlisi, görüntüleme deneylerinden önce ameliyat sonrası 2-3 haftalık bir bekleme süresi gereklidir31,33. Ek olarak, farelerin yaşı ve operasyon sonrası iyileşme süresi, çok erken gelişimsel olayları görüntüleme yeteneğini sınırlar. Kraniyal pencereler genç farelerde implante edilebilir (P15-21)34, iltihaplanma gibi olası yan etkilerin göz önünde bulundurulması gerekir.
Kronik kraniyal pencereye alternatif olarak, inceltilmiş kafatası preparatları da yapılabilir. Bu yöntem, görüntülemeden önce kafatasının ilgilenilen bölge üzerinde incelmesine neden olur. İnceltilmiş bir kafatası penceresi daha az invazivdir ve anti-enflamatuar ilaç uygulamasına duyulan ihtiyacın üstesinden gelir, bu da nöroinflamasyon ve nöroimmün etkileşimlerin modellerini araştıran çalışmalarda bir seçimdir. Bununla birlikte, tekrarlanan görüntüleme isteniyorsa, görüntülemeden önce kafatasının yeniden inceltilmesi gerekir ve görüntü kalitesi35'e düşmeden önce kemik yalnızca sınırlı sayıda yeniden inceltilebilir.
Yeniden inceltme gerektirmeyen güçlendirilmiş bir ince kafatası yönteminin modifiye edilmiş bir versiyonu tarif edilmiş olmasına rağmen36, düzgün olmayan bir kafatası kalınlığı küresel sapmalara neden olabilir ve bu da floresan yapıların bozulmasına neden olabilir37. Bu nedenle, dendritik dikenler gibi yapıların tanımlanmasının aksine, kalsiyum sinyal dinamiği38 veya sinaptik proteinlerin seviyeleri27 gibi nicel ölçümler kaydedilirken, kronik kraniyal pencere daha optik olarak kararlı ve güvenilir bir hazırlık sağlar. Bu nedenle, uzunlamasına in vivo görüntüleme için, kraniyal pencerelerin yerleştirilmesi, ilaç tedavisi39, davranışsal paradigmaeğitimi 4,25 ve nörolojik bozukluklarda sinaptik yeniden yapılanma 11,27'nin bir sonucu olarak değişiklikleri incelemek için üstün bir yöntemdir.
Açıklanan prosedür teknik olarak zordur ve kaliteli görüntü elde etme için bir engel oluşturur. Pencerenin enfeksiyondan uzak kalmasını sağlamak için her adımda aşırı özen gösterilmelidir ve altta yatan dokuya zarar vermekten kaçınılmalıdır. Bu, kafatasındaki bağ dokusunun nazikçe kazınmasını, delme sırasında kemiği soğutmak için yeterli molaların alınmasını, kemiğin kolayca çıkarılmasını kolaylaştırmak için düzgün incelmenin sağlanmasını, beyin şişmesinin önlenmesini ve ameliyat sırasında dura materine zarar vermemek için aşırı özeni içerir. Sadece en iyi pencere preparatları daha uzun görüntüleme süreleri için optik olarak şeffaf kalır.
Anestezi uygulanan farelerde sinaptik yapılardaki değişiklikler günler içinde görüntülenebilse de, anestezinin in vivo40 astrosit kalsiyum sinyalini bozduğu gösterildiğinden, astrosit kalsiyum sinyalini incelerken bu tercih edilmez. Uyanık, kafası kısıtlanmış farelerde in vivo görüntüleme yapmak için, hayvanı mobil ev kafesi, serbest yüzen koşu bandı, hava kaldırılmış Strafor topu veya diğer cihazlardaki görüntüleme koşullarına alıştırmak önemlidir. Doğru alışkanlık sadece görüntüleme sırasında stresi azaltmakla kalmayacak, aynı zamanda görüntüleme seansları sırasında hareket artefaktlarını en aza indirgemek için de hareket edecektir.
Özetle, kronik bir kraniyal pencereden in vivo multifoton mikroskopisi, korteksteki hücrelerin yapısal ve fonksiyonel değişikliklerini incelemek için yararlı bir araçtır. Hücreye özgü floresan boyaları ve muhabirleri kullanarak, hücresel morfolojiyi, etkileşimleri ve aktiviteyi incelemek mümkündür. Kronik kraniyal pencerelerin izin verdiği uzunlamasına görüntüleme ile sinaptik yapıların zaman içinde nasıl değiştiğini ve geliştiğini incelemek mümkündür13,14. Burada sunulan protokolü kullanarak, duyusal stimülasyon23,38, hareket veya irkilme 6,41, hastalık 15,42 veya diğer ilgili parametreler nedeniyle astrositlerde kalsiyum sinyal dinamiklerini incelemek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
