Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu
Summary
Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Davranış gösteren hayvanlarda nöronların ve gliaların hücresel fizyolojisini tam olarak anlamak için, morfolojilerini görselleştirmek ve davranışta bulunan farelerde in vivo aktivitelerini kaydetmek gerekir. Bu yazıda, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesine izin vermek için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Genetik stratejiler ve viral enjeksiyonlarla kombinasyon halinde, spesifik hücreleri ve ilgilenilen bölgeleri yapısal veya fizyolojik belirteçlerle etiketlemek mümkündür. Bu protokol, her iki hücrenin bir kraniyal pencereden eşzamanlı görüntülenmesi için korteksteki GCaMP6 eksprese eden astrositlerin yakınındaki nöronları etiketlemek için viral enjeksiyonların nasıl birleştirileceğini göstermektedir. Aynı hücrelerin çoklu foton görüntülemesi, uyanık, davranan hayvanlarda günlerce, haftalarca veya aylarca gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, araştırmacılara hücresel dinamikleri gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem sunar ve sinirbilimdeki bir dizi soruyu cevaplamak için uygulanabilir.
Introduction
Farelerin korteksinde in vivo multifoton floresan mikroskobu yapabilme yeteneği, hücresel sinyalizasyon ve yapı 1,2,3,4,5,6,7,8,9, hastalık patolojisi 10,11 ve hücresel gelişim 12,13 çalışması için çok önemlidir. . Kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu ile uzunlamasına görüntüleme mümkündür ve canlı hayvanlarda kortikal alanların günlerce, haftalarca veya aylarca tekrarlanan görüntülenmesine izin verir13,14. Multifoton mikroskopisi, gelişmiş derinlik sondalaması ve kullanılan kızılötesi lazerle ilişkili azaltılmış fotohasar nedeniyle in vivo, tekrarlanan görüntüleme için idealdir. Bu, çeşitli kortikal bölgelerdeki spesifik hücrelerin moleküler ve hücresel dinamiklerinin incelenmesine izin verir.
Multifoton mikroskopisi, farelerde nöronal ve glial hücrelerin in vivo görüntülenmesinde kullanılmıştır 15,16,17,18,19,20. Belirli hücre tiplerini ve ilgi alanlarını etiketlemek için çeşitli stratejiler uygulanabilir. Yaygın bir yaklaşım, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin ekspresyonunu, Cre-Lox rekombinasyon sistemini kullanarak hücreye özgü bir şekilde yönlendirmektir. Bu, genetiği değiştirilmiş farelerle gerçekleştirilebilir, örneğin, tdDomates “floxed” fareyi (Ai14) ilgi çekici bir destekleyicinin altında Cre-rekombinaz eksprese eden bir fare ile geçmek21. Alternatif olarak, viral enjeksiyonlarla hücre ve bölgeye özgü etiketleme sağlanabilir. Burada, hücreye özgü bir promotor altında Cre rekombinazını kodlayan bir virüs ve ilgilenilen flokslanmış bir geni kodlayan bir virüs, tanımlanmış bir bölgeye enjekte edilir. Her iki viral vektörü de alan uygun hücre tipleri daha sonra istenen gen (ler) i ifade edecektir. Bu genler, hücresel morfoloji22’deki değişiklikleri görüntülemek için tdDomates gibi yapısal belirteçler veya kalsiyum dinamiklerini incelemek için GCaMP ve / veya RCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler)olabilir 23. Genetik rekombinasyon yöntemleri, bir veya daha fazla hücre tipini etiketlemek için ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanabilir. Transgenik fareler veya viral yapılar (sınırlı paketleme kapasitesine sahip) gerektirmeyen üçüncü bir yaklaşım, DNA yapılarının utero elektroporasyonudur24. Elektroporasyonun zamanlamasına bağlı olarak, farklı hücre tiplerihedeflenebilir 25,26,27.
Multifoton görüntüleme yapılırken, fareler uyanıkken veya anestezi altındayken görüntülenebilir. Uyanık farelerin görüntülenmesi, fareyi takılı bir kafa plakası28 ile sabitleyerek gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, serbest yüzen, hava destekli strafor toplar29, serbest yüzen koşu bantları1 veya farelerin bağlı bir kafa plakası ile tutturulduğu ve açık bir odada hareket etmesine izin verilen hava kaldırılmış bir ev kafesi sistemi gibi yöntemler kullanılarak hayvanın nispeten serbest dolaşımına izin vererek daha az stresli hale getirilir. Bu görüntüleme koşullarının her biri için, önce fareleri görüntüleme kurulumuna alıştırmak gerekecektir. Bu yazıda, hava ile kaldırılmış bir ev kafesi sistemi kullanılarak alışkanlık ve görüntüleme prosedürü açıklanmaktadır.
Bu protokol, kortekste uzunlamasına in vivo görüntüleme için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonunu tanımlar. Burada, kalsiyum sinyal dinamiklerini izlemek için astrositlerde GCaMP6f’yi şartlı olarak eksprese eden fareleri kullanacağız. Ayrıca, bu makale tdTomato’yu nöronlar için bir etiket olarak kullanarak viral enjeksiyonlar için prosedürü açıklamaktadır. Bu, nöronal sinaptik yapıdaki değişikliklerin belirlenmesine ve / veya aynı astrositin tekrarlanan görüntülenmesini sağlayan yapısal bir belirteç olarak kullanılabilirliğe izin verir. Protokol boyunca, çoklu foton mikroskobundan elde edilen görüntülerin mümkün olan en iyi kalitesini sağlamak için önemli adımlar vurgulanacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, havayla kaldırılmış bir ev kafesinde uyanık, kafa ile kısıtlanmış farelerde kortikal astrositlerin ve nöronların in vivo görüntülenmesi için kronik kraniyal pencerelerin implantasyonu için bir protokol sunduk. GECI’leri ve nöronal sinaptik yapıları eksprese eden astrositlerin görüntülenmesi için kraniyal pencere uygulamasına özel örnekler verilmiştir. Multifoton mikroskobu kullanımı ile astrositik kalsiyum sinyal dinamikleri ve yapısal sinaptik dinamikler günler boyunca tek…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium–implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
