Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli
Summary
Qui viene presentato un protocollo per l’impianto di una finestra cranica cronica per l’imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa.
Abstract
Per comprendere appieno la fisiologia cellulare dei neuroni e della glia negli animali che si comportano, è necessario visualizzare la loro morfologia e registrare la loro attività in vivo nei topi che si comportano. Questo documento descrive un metodo per l’impianto di una finestra cranica cronica per consentire l’imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa. In combinazione con strategie genetiche e iniezioni virali, è possibile etichettare cellule e regioni di interesse specifiche con marcatori strutturali o fisiologici. Questo protocollo dimostra come combinare iniezioni virali per etichettare i neuroni nelle vicinanze degli astrociti che esprimono GCaMP6 nella corteccia per l’imaging simultaneo di entrambe le cellule attraverso una finestra cranica. L’imaging multifotonico delle stesse cellule può essere eseguito per giorni, settimane o mesi in animali svegli e che si comportano. Questo approccio fornisce ai ricercatori un metodo per visualizzare le dinamiche cellulari in tempo reale e può essere applicato per rispondere a una serie di domande nelle neuroscienze.
Introduction
La capacità di eseguire la microscopia a fluorescenza multifotone in vivo nella corteccia dei topi è fondamentale per lo studio della segnalazione e della struttura cellulare 1,2,3,4,5,6,7,8,9, della patologia della malattia 10,11 e dello sviluppo cellulare12,13 . Con l’impianto di finestre craniche croniche, è possibile l’imaging longitudinale, consentendo l’imaging ripetuto delle aree corticali per giorni, settimane o mesi13,14 negli animali vivi. La microscopia multifotonica è ideale per l’imaging in vivo e ripetuto grazie al miglioramento del rilevamento della profondità e al ridotto fotodanno associato al laser a infrarossi utilizzato. Ciò consente lo studio della dinamica molecolare e cellulare di cellule specifiche in varie regioni corticali.
La microscopia multifotonica è stata utilizzata per l’imaging in vivo di cellule neuronali e gliali nei topi 15,16,17,18,19,20. Varie strategie possono essere implementate per etichettare particolari tipi di cellule e aree di interesse. Un approccio comune è quello di guidare l’espressione di proteine fluorescenti geneticamente codificate in modo cellulare specifico utilizzando il sistema di ricombinazione Cre-Lox. Questo può essere eseguito con topi geneticamente modificati, ad esempio, incrociando tdTomato topo “floxed” (Ai14) con un topo che esprime Cre-ricombinasi sotto un promotore di interesse21. In alternativa, l’etichettatura cellulare e sito-specifica può essere ottenuta con iniezioni virali. Qui, un virus che codifica per cre ricombinasi sotto un promotore cellulare specifico e un virus che codifica per un gene floxed di interesse vengono iniettati in una regione definita. I tipi di cellule appropriati che ricevono entrambi i vettori virali esprimeranno quindi il gene o i geni desiderati. Questi geni possono essere marcatori strutturali, come tdTomato, per visualizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare22 o indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP e / o RCaMP, per esaminare la dinamica del calcio23. I metodi di ricombinazione genetica possono essere applicati singolarmente o in combinazione per etichettare uno o più tipi di cellule. Un terzo approccio, che non richiede topi transgenici o costrutti virali (che hanno una capacità di confezionamento limitata), è l’elettroporazione in utero dei costrutti di DNA24. A seconda della tempistica dell’elettroporazione, diversi tipi di celle possono essere presi di mira 25,26,27.
Quando si esegue l’imaging multifotonico, i topi possono essere ripresi mentre sono svegli o anestetizzati. L’imaging dei topi svegli può essere eseguito fissando il mouse tramite una piastra frontale attaccata28. Questo approccio è reso meno stressante consentendo un movimento relativamente libero dell’animale utilizzando metodi, come le sfere di polistirolo29 fluttuanti e supportate dall’aria, i tapis roulant fluttuanti1 o un sistema di gabbie domestiche sollevate ad aria in cui i topi sono fissati da una piastra di testa attaccata e autorizzati a muoversi in una camera aperta30. Per ciascuna di queste condizioni di imaging, sarà prima necessario abituare i topi alla configurazione di imaging. Questo documento descrive l’assuefazione e la procedura di imaging utilizzando un sistema di gabbie domestiche sollevate dall’aria.
Questo protocollo descrive l’impianto di una finestra cranica cronica per l’imaging longitudinale in vivo nella corteccia. Qui, useremo topi che esprimono condizionatamente GCaMP6f negli astrociti per monitorare le dinamiche di segnalazione del calcio. Inoltre, questo documento descrive la procedura per le iniezioni virali utilizzando tdTomato come etichetta per i neuroni. Ciò consente la determinazione dei cambiamenti nella struttura sinaptica neuronale e/o la disponibilità come marcatore strutturale che consente l’imaging ripetuto dello stesso astrocita. Durante tutto il protocollo, verranno evidenziati i passaggi cruciali per garantire la migliore qualità possibile delle immagini ottenute dalla microscopia multifotonica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo presentato un protocollo per l’impianto di finestre craniche croniche per l’imaging in vivo di astrociti corticali e neuroni in topi svegli e trattenuti dalla testa su una gabbia domestica sollevata dall’aria. Sono stati forniti esempi specifici dell’applicazione della finestra cranica per l’imaging di astrociti che esprimono GECI e strutture sinaptiche neuronali. Con l’uso della microscopia multifotonica, la dinamica di segnalazione del calcio astrocitico e la dinamica sinaptica strutturale possono…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium–implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
