Summary
Presentert her er en protokoll for implantasjon av et kronisk kranialvindu for langsgående avbildning av hjerneceller i våkne, hodebeherskede mus.
Abstract
For å forstå den cellulære fysiologien til nevroner og glia i å oppføre seg dyr, er det nødvendig å visualisere morfologien og registrere deres aktivitet in vivo i å oppføre seg mus. Dette papiret beskriver en metode for implantasjon av et kronisk kranialvindu for å tillate langsgående avbildning av hjerneceller i våken, hodebehersket mus. I kombinasjon med genetiske strategier og virale injeksjoner er det mulig å merke bestemte celler og interesseområder med strukturelle eller fysiologiske markører. Denne protokollen demonstrerer hvordan man kombinerer virale injeksjoner for å merke nevroner i nærheten av GCaMP6-uttrykkende astrocytter i cortex for samtidig avbildning av begge cellene gjennom et kranialvindu. Multifotonavbildning av de samme cellene kan utføres i dager, uker eller måneder i våken, oppføre dyr. Denne tilnærmingen gir forskere en metode for å se cellulær dynamikk i sanntid og kan brukes til å svare på en rekke spørsmål innen nevrovitenskap.
Introduction
Evnen til å utføre in vivo multifoton fluorescensmikroskopi i musenes cortex er avgjørende for studiet av cellulær signalering og struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sykdomspatologi 10,11 og cellulær utvikling12,13 . Ved implantasjon av kroniske kranialvinduer er langsgående avbildning mulig, noe som muliggjør gjentatt avbildning av kortikale områder i dager, uker eller måneder13,14 hos levende dyr. Multifotonmikroskopi er ideell for in vivo, gjentatt bildebehandling på grunn av forbedret dybdeprobing og redusert fotodamage forbundet med den infrarøde laseren som brukes. Dette gjør det mulig å studere molekylær og cellulær dynamikk av bestemte celler i ulike kortikale regioner.
Multifotonmikroskopi har blitt brukt til in vivo-avbildning av nevronale og glialceller hos mus 15,16,17,18,19,20. Ulike strategier kan implementeres for å merke bestemte celletyper og interesseområder. En vanlig tilnærming er å drive uttrykket av genetisk kodede fluorescerende proteiner på en cellespesifikk måte ved hjelp av Cre-Lox-rekombinasjonssystemet. Dette kan utføres med genmodifiserte mus, for eksempel ved å krysse tdTomato "floxed" mus (Ai14) med en mus som uttrykker Cre-recombinase under en promotor av interesse21. Alternativt kan celle- og stedsspesifikk merking oppnås med virale injeksjoner. Her injiseres en viruskoding Cre-rekombininase under en cellespesifikk promotor og et virus som koder et floxed gen av interesse, inn i et definert område. Passende celletyper som mottar begge virale vektorer vil da uttrykke de ønskede genene. Disse genene kan være strukturelle markører, for eksempel tdTomato, for å se endringer i cellulær morfologi22 eller genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer), for eksempel GCaMP og/eller RCaMP, for å undersøke kalsiumdynamikk23. Metoder for genetisk rekombinasjon kan brukes individuelt eller i kombinasjon for å merke en eller flere celletyper. En tredje tilnærming, som ikke krever transgene mus eller virale konstruksjoner (som har begrenset emballasjekapasitet), er i utero-elektroporasjon av DNA-konstruksjoner24. Avhengig av tidspunktet for elektroporasjonen, kan forskjellige celletyper målrettesmot 25,26,27.
Når du utfører multifotonavbildning, kan mus avbildes mens de er våkne eller bedøvet. Avbildning av våkne mus kan utføres ved å sikre musen via en vedlagt hodeplate28. Denne tilnærmingen blir mindre stressende ved å tillate relativt fri bevegelse av dyret ved hjelp av metoder, for eksempel frittflytende, luftstøttede Styrofoam-baller29, frittflytende tredemøller1, eller et luftløftet hjemmebursystem der mus er festet med en festet hodeplate og får lov til å bevege seg i et åpent kammer30. For hver av disse bildeforholdene vil det først være nødvendig å habituate musene til bildeoppsettet. Dette dokumentet beskriver habituation og bildebehandling prosedyre ved hjelp av en luftløftet hjem bur system.
Denne protokollen beskriver implantasjonen av et kronisk kranialvindu for langsgående in vivo-avbildning i cortex. Her vil vi bruke mus som betinget uttrykker GCaMP6f i astrocytter for å overvåke kalsiumsignaldynamikk. Videre beskriver dette papiret prosedyren for virale injeksjoner ved hjelp av tdTomato som etikett for nevroner. Dette gjør det mulig å bestemme endringer i nevronal synaptisk struktur og/eller tilgjengeligheten som en strukturell markør som muliggjør gjentatt avbildning av samme astrocytt. Gjennom hele protokollen vil viktige trinn bli fremhevet for å sikre best mulig kvalitet på bilder hentet fra multifotonmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjer godkjent av IACUC ved University of Nebraska Medical Center.
1. Før operasjonen
- Forbered pipetter for virale injeksjoner. Trekk borosilikatglasskapillærer ved hjelp av en pipettetrekker og skråstill pipetten i en 20° vinkel. Steriliser pipettene over natten.
- Forbered friske biter av sterilt gelskum ved å kutte dem i små firkanter. Senk gelskummet ned i et sterilt mikrofugerør som inneholder 0,5 ml saltvann. Bløtlegg gelskummet i saltvann i minst 30 minutter før bruk.
- Forbered friske biter av svampstrimler ved å kutte dem i tynne strimler.
- Tjue minutter før operasjonen, injiser 4-6 uker gamle GLAST-CreER / GCaMP6f mus intraperitoneally med 0,2 mg / kg deksametason for å forhindre hevelse i hjernen og 5 mg / kg karprofen for å redusere betennelse.
MERK: For å indusere rekombinasjonen og uttrykket av GCaMP6f i ca. 40 % av astrocyttene ble GLAST-CreER/GCaMP6f-mus injisert med 100 mg/kg tamoksifen ved 3 uker i 5 påfølgende dager.
2. Starten av operasjonen
- Etter 20 min bedøver musene med 3% isofluran med oksygen med en strømningshastighet på 1 l / min i ca. 1,5 min.
- Når bedøvet, plasser musen på en stereotaxisk ramme som sitter på et vann sirkulerende teppe for å opprettholde en kroppstemperatur på 37 °C gjennom hele operasjonen. Fest musen til rammen ved hjelp av snuteklemmen og ørestengene. Pass på at snuteklemmen og ørestengene er stabile nok til at hodet ikke beveger seg under prosedyren, men ikke så stramt at skallen er skadet.
- Oppretthold anestesi med 1-1,5% isofluran med oksygen med en strømningshastighet på 1-2 l / min. Vær oppmerksom på at noen dyr kan trenge mer eller mindre isofluran for å opprettholde sedasjon. Overvåk dyrets pust så vel som refleksene til tå- og haleklemmer, og juster isofluranen riktig.
- Påfør øyesalve på hvert øye ved hjelp av en bomullsspissapplikator for å forhindre at øynene tørker ut under prosedyren.
- Bruk gnager trimmere, barber håret fra nakken til like forbi øynene. Vær forsiktig for å sikre at dyrets whiskers ikke blir trimmet ved et uhell.
- Rengjør det barberte området med en jod prep pad, etterfulgt av en alkohol prep pad.
- Bruk sterile vevsstifter og kirurgisk saks, kutt og fjern huden fra frontal suturene fremre til bregmaen helt bakre til lambda.
- Når huden er fjernet, legg ca 0,1 ml 1% xylocaine (lidokain med epinefrin 1:200,000) til skallen for å minimere blødning av skallen.
- Bruk et sterilt kirurgisk blad i karbonstål i størrelse 11 festet til et håndtak, og skrap forsiktig bindevevet fra skallen. Vær ekstra forsiktig når du fjerner bindevevet nær kanten av skallen, da gjenværende vev kan forhindre sterk vedheft av glasset eller hodeplaten senere.
- Bruk sterile vevs tang for å fjerne løs bindevev fra skallen.
- Bruk sterile bomullsspissapplikatorer, rengjør eventuelle gjenværende xylocaine fra skallen.
- Når den er ferdig, avfetter du skallen grundig ved hjelp av en steril bomullsspissapplikator dyppet i aceton. Bruk trykkluft for å tørke skallen umiddelbart.
3. Kraniotomi
- Bruk en finmarkør og en linjal til å måle riktig størrelse for åpningen på ønsket sted. Bekreft størrelsen på åpningen ved å sammenligne den med størrelsen på dekkglasset (3 eller 5 mm i diameter); påse at åpningen er litt mindre enn størrelsen på dekkglasset.
- Ved hjelp av en tannbor, spor gradvis omrisset av åpningen, tynning av beinet. Bor sakte for å forhindre boring gjennom beinet, og bor i konsentriske sirkler for å lette jevn tynning av beinet.
- Etter hvert konsentriske pass, legg til en dråpe eller to steril saltvann til det borede området. La saltvannet sitte i minst 10 s for å forhindre at beinet overopphetes og skade den underliggende duraen.
- Bruk en steril bomullsspissapplikator for å absorbere gjenværende saltvann. Blås trykkluft over området for å sikre at all gjenværende saltvann har fordampet før boringen gjenopptas. Gjør dette for å blåse bort beinrester som gjenstår.
- Gjenta trinn 3.2-3.4 til benet er tilstrekkelig tynnet for fjerning.
- Forsikre deg om at beinet er tilstrekkelig tynnet for fjerning ved å forsiktig skyve på det sentrale området av beinet med fine tang for å kontrollere at den tynne skallen beveger seg. Den underliggende vaskulaturen skal være synlig der boringen skjedde. Vær oppmerksom på at beinet kan se ut som om det vil sprekke der tynning skjedde.
MERK: Trening på dette stadiet er avgjørende for å identifisere når beinet er tynnet riktig. - Før du prøver å fjerne beinet, kontroller musen for å sikre at den er helt bedøvet. Hvis ikke, øker du gradvis isofluranvedlikeholdet for å forhindre hevelse i hjernen når du fjerner beinet.
- Tilsett et lite stykke gelskum mettet i saltvann til den tynne skallen. Tilsett en eller to ekstra dråper saltvann til den tynne skallen.
MERK: Å ha rikelig med saltvann over den tynne skallen bidrar til å redusere blødning og beskytte dura når du fjerner beinklaffen. - Bruk et miniatyr 15° spissblad, sett forsiktig bladet inn i det tynne benet og kutt langs det tynne benet. Hold gelskummet gjennomvåt i saltvann, klar til å stoppe eventuelle blødninger som kan oppstå.
- Bruk tang, løft forsiktig og fjern beinet. Vær så skånsom som mulig for å unngå skade på det underliggende vevet og vaskulaturen. Vær svært forsiktig så du ikke skader dura mater.
- Når beinklaffen er fjernet, legg til et friskt stykke gelskum mettet i saltvann til cortex. Tilsett noen dråper saltvann for å forhindre at gelskummet tørker ut, da dette vil forårsake skade på det underliggende vevet.
4. Virale injeksjoner
- Utfør virale injeksjoner ved hjelp av et stereotaxisk apparat.
- Forbered AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titer på 3 × 1013 genomkopier (GC)/ml) ved 1:5000 ved serielle fortynninger i saltvann.
- Forbered blandingen av AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) og AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titer på 5 × 1012 GC/ml) på et lite stykke parafilm.
- Fyll en steril skrå glasspipette med en spissstørrelse på 20 μm med virusblandingen ved å plassere pipetten forsiktig på løsningen.
- Senk pipetten slik at den bare berører overflaten av hjernen og fortsett å senke for ytterligere 200-300 μm for L2/3 injeksjoner. Bruk et intracellulært mikroinjeksjonsdispensersystem (se materialtabellen), trykkinjiser 12-15 ganger over 2 min (20 psi, 9 ms pulsvarighet). Vær oppmerksom på menisken i pipettedråpen med hver injeksjon for å sikre at pipetten ikke er blokkert.
- Når pipetten er injisert, la den stå i hjernen i 4-5 min for å forhindre tilbakestrømning. Trekk pipetten langsomt tilbake.
- Gjenta injeksjonene på 2-3 steder (ca. 500 μm fra hverandre).
- Kast de brukte glasspipettene, parafilmen, pipettespissene og mikrofunksjonsrørene som brukes til serielle fortynning av Cre-viruset i 10 % blekemiddel.
5. Implantasjon av kranialvindu
- Fjern eventuelt gelskum, og bruk en liten stripe med svampstrimler for å suge opp gjenværende saltvann.
- Tilsett noen dråper antibiotika enrofloxacin (22,7 μg/ml) til åpningen og la den forbli der i 1 min. Etter 1 min, bruk et nytt stykke svamp stripe for å absorbere gjenværende enrofloxacin. Gjenta denne prosessen to ganger til.
- Etter den tredje vasken legger du til noen dråper saltvann til åpningen og lar den forbli der i 1 min. Etter 1 min, bruk et nytt stykke svampstrimmel for å absorbere gjenværende saltvann. Gjenta denne vaskeprosessen to ganger til, og etter den tredje vasken legger du til en liten dråpe saltvann til åpningen.
- Plasser dekkglasset over åpningen. Bruk tang for å sikre at glasset skylles over åpningen for å få bilder av god kvalitet.
- Mens du forsiktig holder glasset på plass, påfør cyanoacrylat limgel (Tabell over materialer) rundt glassets omkrets for å forsegle kantene på vinduet til skallen. Pass på at du ikke lar limet sive under dekkglasset, og hold så mye lim av overflaten av dekkglasset som mulig.
- Påfør et lag med superlim over klebegelen. Tilsett et lag med tannsementvæske over limet slik at det kan herdes.
- Ta en passende størrelse helikopter-type hodeplate og påfør et tynt lag lim rundt den sentrale åpningen. Plasser hodeplaten over dekkglasset, og la limet tørke kort.
- I et 1,5 ml mikrofugerør, tilsett tannsementpulver til 0,1 ml-merket på røret. Tilsett 7-8 dråper hurtigherding, øyeblikkelig lim og bland. Trekk inn i en 1 ml sprøyte med en 19 G nål som er kuttet for å skape en større åpning.
- Injiser blandingen gjennom sidehullene på helikopterstangen til den siver fra hver side. Påfør tannsementen/limblandingen på resten av den eksponerte skallen for å feste hodeplaten til skallen, noe som vil redusere bevegelsesartefakter under avbildning.
- La blandingen lufttørke i minst 15 min.
- Injiser musen med 0,5 ml saltvann subkutant for å hjelpe til med utvinning.
6. Etter operasjon
- Fjern musen fra stereotaxic rammen og returner den til buret.
- Legg en del av buret på et vannsirkulasjonsteppe, romgelvarmeputer eller isotermiske pads for å hjelpe til med utvinning.
- Gi dyret en liten hjelp av matpellets og våt mat, i tillegg til deres vanlige kosthold, for ytterligere hjelp til utvinning. Tilsett ny matpellet og våt mat hver dag etter operasjonen for varigheten av utvinningen.
- Dagen etter operasjonen injiserer du mus én gang med 5 mg/kg karprofen og 5 mg/kg enrofloxacin.
- På dag 2-6 injiserer du musene en gang med 5 mg/kg karprofen og to ganger med 5 mg/kg enrofloxacin, i påvente av godkjenning fra den lokale IACUC. Skill enrofloxacininjeksjonene med minst 8 timer.
- På dag 7-20, injiser musene daglig med 5 mg / kg karprofen.
7. Dyrevane for avbildning
- På dag 14 etter operasjonen, undersøk kranialvinduet for optisk klarhet. Ikke bruk mus med uklare eller på annen måte skadede vinduer (dvs. overdreven angiogenese).
- Se etter tdTomato-uttrykk under et fluorescensmikroskop. Hvis merkede celler kan identifiseres, fortsett med dyrevanering.
- Første dag med habituation (håndtering)
- Hold musen i noen minutter og returner den til buret etter håndtering. Gjenta håndteringen tre ganger med et intervall på 15 minutter mellom øktene.
- Etter den tredje studien, habituate musen ved å pakke dyret i et lite stykke klut.
- Hold musen innpakket i klut i ca. 1 min.
- Etter rettssaken, returner musen til buret. Gjenta denne prosessen to ganger til, slik at det er et intervall på 15 minutter mellom hver prøve.
- Andre dag med habituation
- Vei og registrer musevekten.
- Vikle musen i klut, og fest den via hodeplaten til hodefestearmen til det luftløftede hjemmeburet.
- La hjemmeburet bli utsatt for lyset.
- La musen forbli sikret i bobilburet i 15 minutter.
- Etter habituation, fjern musen fra hjemmeburet og slå av luftstrømmen.
- Vei musen og returner den til buret. Pass på at du bare inkluderer mus som ikke mister mer enn 10% av kroppsvekten. Ekskluder mus som mister mer enn 10% av vekten i løpet av en hvilken som helst dag med habituation fra bildeforsøk.
- Dag tre av habituation og utover
- Vei og registrer musevekten før du fester den til det luftløftede hjemmeburet.
- Fest musen til det luftløftede hjemmeburet.
- Dekk hjemmeburet med noe som vil gi et mørkt interiør, for eksempel en boks, og la musen forbli sikret i 30 minutter.
- Etter 30 min, avdekk hjemmeburet, fjern musen og slå av luftstrømmen.
- Vei og registrer musevekten etter habituation.
- Gjenta denne prosessen hver dag, og øk varigheten musen er sikret til hjemmeburet med 15 min. Fortsett denne prosessen til musen kan festes til hjemmeburet i 1,5 timer, da dette er den omtrentlige varigheten av en to-foton bildeøkt.
- For å habituate musen til støy, utfør noen habituation økter på mikroskopet for å akklimatisere musen til lydene av laser skanning speil. Utelukke mus som ikke klarer å vane tilstrekkelig (dvs. vokaliseringer og stressindusert avføring).
8. Multifoton bildebehandling
- Start bildebehandling 3 uker etter operasjonen for å tillate vinduet å rydde.
- Utfør bildebehandling på et spesiallaget eller kommersielt tilgjengelig multifotonmikroskop utstyrt med en Ti:Sapphire-laser. Hent bilder ved hjelp av et høyt numerisk blenderåpningsmål (NA).
MERK: Tokanals bildebehandling oppnås ved hjelp av et 565 nm dikroisk speil og to eksterne fotomultiplikatorrør. Et 535/50-båndpassfilter brukes til å oppdage GCaMP6f-utslipp, og et 610/75-båndpassfilter brukes til å oppdage tdTomato. Et 25x vann nedsenkingsmål (1,05 NA) og resonansskannere ble brukt til å skaffe bilder vist i figur 1 og figur 2. Hver interesseregion besto av en stabel med bilder atskilt med 1 μm. Hver optisk seksjon ble samlet inn med 512 x 512 piksler, 0,18 μm/piksel. Bilder ble anskaffet fra forbensregionen av primærmotor cortex som bestemt av stereotaksiske koordinater. - Sett bølgelengden på laseren til 920 nm (990 nm hvis en rødforskyvning GECI brukes).
- Plasser musen på bobilburet, og klem hodeplaten til hodefestearmen.
- Legg til noen dråper vann til midten av vinduet.
- Ved hjelp av mikroskopets bredfeltmodus velger du 2-3 posisjoner for lett identifiserbar vaskulatur. Lagre bildene av disse blodårene og registrer X- og Y-koordinatene som vises på motorkontrolleren for å flytte tdTomato-merkede dendritter for etterfølgende bildebehandlingsøkter. Juster X- og Y-koordinatene hver gang for å justere med de lagrede bildene av blodårene.
- Når vaskulaturen er avbildet og posisjoner registrert, finn regionene med nevroner som uttrykker tdTomato (figur 1). Bilde synaptiske strukturer (dendritter og axoner) av nevroner og GCaMP6f aktivitet i astrocytter.
MERK: Dendrittene vil fungere som landemerker for pålitelig retur til de samme regionene og bilde de samme dendritter og astrocytter over gjentatte dager. Ingen påvisbare skift i bildeplanet ble observert med stabil hodefiksering og etter habituation til hodefiksering. Forskyvning som forekommer i X- og Y-retningene, er bevegelseskorrigert. - Etter avbildning, returner musen til buret.
MERK: Mus holdes vanligvis på området i maksimalt 2 timer. Når bildet varer lenge, kan vannet under målet tørke. Vann bør tilsetts under forsøkene. Alternativt kan en ultralydgel brukes i stedet for vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på kranialvinduet kan vurderes av hvor skarpe nevronstrukturene ser ut. I et godt vindu er dendrittiske spines tydelig synlige (figur 1). Når struktur- og posisjonsdata er lagret, kan det samme dyret avbildes gjentatte ganger i dager, uker eller måneder for å undersøke de samme cellene (figur 1). Bildene i figur 1 ble hentet fra forbensområdet til primærmotor cortex (i et 5 mm vindu). En rekke parametere kan måles, inkludert tetthet og dynamikk av dendritiske spines og axonal boutons for å studere strukturell synaptisk plastisitet. Astrocytisk aktivitet kan studeres ved å analysere den romlige dynamikken i kalsiumsignalering (figur 2). Avhengig av mikroskopets evner (dvs. resonansskannere, piezomotor som kontrollerer målet) og det eksperimentelle spørsmålet, kan tidsforløpavbildning utføres i et enkelt fokusplan eller i et volum eller multiregion for å overvåke kalsiumaktivitet ved ønsket anskaffelsesfrekvens.
Figur 1: Gjentatt avbildning av dendritter og astrocytter over dager. En dendrit som uttrykker tdTomato (magenta) tillater identifisering og gjentatt avbildning av GCaMP6f-uttrykkende astrocytter (hvit) i umiddelbar nærhet. Ca2+ aktivitet innen astrocytter vises på forskjellige tidspunkter på forskjellige dager. Synaptisk strukturell plastisitet kan avbildes samtidig. To nye spines som dukket opp på dag 2 er merket med piler. Mens den ene ryggraden vedvarte og var synlig på dag 5 (blå pil), ble den andre ryggraden eliminert (grønn pil). Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Avbildning av astrocytisk kalsiumsignalering. Bilder som viser Ca2+- aktivitet fra en astrocytt som uttrykker GCaMP6f. Paneler viser Ca2+ aktivitet registrert fra et volum på 4 μm på forskjellige tidspunkter under oppkjøpet. Kalsiumsignalering i prosesser og mikrodomener kan observeres i hvileperiodene. En global hendelse som omfatter hele cellen kan observeres under en bevegelseskamp på 188 s. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi presentert en protokoll for implantasjon av kroniske kranialvinduer for in vivo-avbildning av kortikale astrocytter og nevroner i våken, hodebehersket mus på et luftløftet hjemmebur. Det er gitt spesifikke eksempler på kranialvindusapplikasjonen for avbildning av astrocytter som uttrykker GECIer og nevronale synaptiske strukturer. Ved bruk av multifotonmikroskopi kan astrocytisk kalsiumsignaldynamikk og strukturell synaptisk dynamikk registreres gjentatte ganger over dager.
Et kronisk kranialvindu gir god optisk bildekvalitet og gjør det mulig å utføre flere bildebehandlingsøkter av samme nevronale og glialstrukturer. Tilnærmingen gjør det også mulig å utføre intrakranielle virale injeksjoner før du dekker kraniotomien med et dekselglass.
Brukere bør være klar over en rekke begrensninger som oppstår gjennom implantasjon av kroniske kranialvinduer. Erfaring og mye praksis er nødvendig for å oppnå et vindu av høy kvalitet og for å sikre dyreoverlevelse. Videre er operasjonen invasiv og kan resultere i en inflammatorisk respons. Farmakologisk behandling under kirurgi og postkirurgisk utvinning inkluderer antiinflammatoriske legemidler og antibiotika31. Bruk av antiinflammatoriske legemidler er kanskje ikke hensiktsmessig i studier som undersøker modeller for nevroinflammasjon, da disse legemidlene også kan påvirke fenomenet som studeres.
Mer nylig har meningeal lymfangiogenese vist seg å forekomme som svar på kranialvinduimplantasjon32. Dermed kan det kroniske kranialvinduet derfor ikke være akseptabelt for studier som undersøker meningeale lymfatiske kar. Det er viktig at en 2-3-ukers ventetid etter operasjonen er nødvendig før bildebehandlingseksperimenter31,33. I tillegg begrenser musenes alder, samt gjenopprettingstid etter operasjonen, evnen til å avbilde svært tidlige utviklingshendelser. Mens kranialvinduer kan implanteres hos yngre mus (P15-21)34, må mulige bivirkninger, som betennelse, vurderes.
Som et alternativ til det kroniske kranialvinduet kan tynne skallepreparater også gjøres. Denne metoden resulterer i tynning av skallen over regionen av interesse før avbildning. Et tynnet hodeskallevindu er mindre invasivt og overvinner behovet for antiinflammatorisk legemiddeladministrasjon, noe som gjør det til et valg i studier som undersøker modeller for nevroinflammasjon og nevroimmune interaksjoner. Men skulle gjentatt bildebehandling være ønsket, må skallen tynnes på nytt før avbildning, og bein kan bare tynnes på nytt et begrenset antall ganger før bildekvaliteten forringes35.
Selv om en modifisert versjon av en forsterket tynnskallemetode som ikke krever rethinning er beskrevet36, kan en ikke-jevn hodeskalletykkelse forårsake sfæriske avvik, noe som resulterer i forvrengning av fluorescerende strukturer37. Således, når kvantitative målinger registreres, for eksempel kalsiumsignaleringsdynamikk38 eller nivåer av synaptiske proteiner27, i motsetning til identifisering av strukturer som dendritiske spines, gir det kroniske kranialvinduet et mer optisk stabilt og pålitelig preparat. Således, for langsgående, in vivo-avbildning, er innsetting av kranialvinduer den overlegne metoden for å undersøke endringer som følge av narkotikabehandling39, trening i et atferdsparadigme 4,25 og synaptisk ombygging i nevrologiske lidelser11,27.
Den beskrevne prosedyren er teknisk utfordrende og gir en barriere for bildeanskaffelse av høy kvalitet. Det må utvises stor forsiktighet ved hvert trinn for å sikre at vinduet holder seg fri for infeksjon, og skade på det underliggende vevet unngås. Dette inkluderer skånsom skraping av bindevev på skallen, tar tilstrekkelige pauser for kjøling av beinet når du borer, sikrer jevn tynning for å lette enkel benfjerning, forhindrer hevelse i hjernen og ekstrem forsiktighet for ikke å skade dura mater under operasjonen. Bare de beste vindusforberedelsene forblir optisk gjennomsiktige i lengre perioder med avbildning.
Mens endringer i synaptiske strukturer kan avbildes hos bedøvede mus over dager, er dette ikke å foretrekke når man undersøker astrocytt kalsiumsignalering som anestesi har vist seg å forstyrre astrocytt kalsiumsignalering in vivo40. For å utføre in vivo-avbildning i våken, hodebehersket mus, er det viktig å habituate dyret til bildeforholdene i bobilburet, frittflytende tredemølle, luftløftet Styrofoam-ball eller annet apparat. Riktig habituation vil ikke bare redusere stress under avbildning, men også virke for å minimere bevegelse artefakter under bildebehandling økter.
Oppsummert er in vivo multifotonmikroskopi gjennom et kronisk kranialvindu et nyttig verktøy for å studere strukturelle og funksjonelle endringer av celler i cortex. Ved hjelp av cellespesifikke fluorescerende fargestoffer og reportere er det mulig å studere cellulær morfologi, interaksjoner og aktivitet. Med langsgående avbildning tillatt av kroniske kranialvinduer, er det mulig å undersøke hvordan synaptiske strukturer endres og utvikler seg over tid13,14. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, er det mulig å undersøke kalsiumsignaldynamikk i astrocytter på grunn av sensorisk stimulering23,38, bevegelse eller startle 6,41, sykdom 15,42 eller andre parametere av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
