Præsenteret her er en protokol til implantation af et kronisk kranievindue til langsgående billeddannelse af hjerneceller i vågne, hovedbeherskede mus.
For fuldt ud at forstå den cellulære fysiologi af neuroner og glia i at opføre dyr, er det nødvendigt at visualisere deres morfologi og registrere deres aktivitet in vivo i at opføre mus. Dette papir beskriver en metode til implantation af et kronisk kranievindue for at muliggøre langsgående billeddannelse af hjerneceller i vågne, hovedbeherskede mus. I kombination med genetiske strategier og virale injektioner er det muligt at mærke specifikke celler og regioner af interesse med strukturelle eller fysiologiske markører. Denne protokol viser, hvordan man kombinerer virale injektioner for at mærke neuroner i nærheden af GCaMP6-ekspressiv astrocytter i cortex til samtidig billeddannelse af begge celler gennem et kranievindue. Multifotonbilleddannelse af de samme celler kan udføres i dage, uger eller måneder i vågen, opførende dyr. Denne tilgang giver forskere en metode til at se cellulær dynamik i realtid og kan anvendes til at besvare en række spørgsmål inden for neurovidenskab.
Evnen til at udføre in vivo multifotonfluorescensmikroskopi i musebarken er altafgørende for undersøgelsen af cellulær signalering og struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sygdomspatologi 10,11 og cellulær udvikling12,13 . Med implantation af kroniske kranievinduer er langsgående billeddannelse mulig, hvilket muliggør gentagen billeddannelse af kortikale områder i dage, uger eller måneder13,14 hos levende dyr. Multifotonmikroskopi er ideel til in vivo, gentagen billeddannelse på grund af forbedret dybdesondering og reduceret fotoskade forbundet med den anvendte infrarøde laser. Dette gør det muligt at studere molekylær og cellulær dynamik af specifikke celler i forskellige kortikale regioner.
Multifotonmikroskopi er blevet anvendt til in vivo-billeddannelse af neuronale og glialceller i mus 15,16,17,18,19,20. Forskellige strategier kan implementeres for at mærke bestemte celletyper og interesseområder. En almindelig tilgang er at drive ekspressionen af genetisk kodede fluorescerende proteiner på en cellespecifik måde ved hjælp af Cre-Lox-rekombinationssystemet. Dette kan udføres med genetisk modificerede mus, f.eks. krydsning af tdTomato “floxed” mus (Ai14) med en mus, der udtrykker Cre-recombinase under en promotor af interesse21. Alternativt kan celle- og stedspecifik mærkning opnås med virale injektioner. Her injiceres en virus, der koder for Cre-rekombinase under en cellespecifik promotor, og en virus, der koder for et floxet gen af interesse, i en defineret region. Passende celletyper, der modtager begge virale vektorer, vil derefter udtrykke det eller de ønskede gener. Disse gener kan være strukturelle markører, såsom tdTomato, for at se ændringer i cellulær morfologi22 eller genetisk kodede calciumindikatorer (GECIS’er), såsom GCaMP og / eller RCaMP, for at undersøge calciumdynamik23. Metoder til genetisk rekombination kan anvendes individuelt eller i kombination til mærkning af en eller flere celletyper. En tredje tilgang, der ikke kræver transgene mus eller virale konstruktioner (som har begrænset emballagekapacitet), er in utero elektroporation af DNA-konstruktioner24. Afhængigt af tidspunktet for elektroporationen kan forskellige celletyper målrettes 25,26,27.
Når du udfører multifotonbilleddannelse, kan mus afbildes, mens de er vågne eller anæstetiserede. Billeddannelse af vågne mus kan udføres ved at fastgøre musen via en vedhæftet hovedplade28. Denne fremgangsmåde gøres mindre stressende ved at tillade relativt fri bevægelighed for dyret ved hjælp af metoder, såsom fritsvævende, luftunderstøttede styrofoamkugler29, fritsvævende løbebånd1 eller et luftløftet hjemmebursystem, hvor mus fastgøres med en fastgjort hovedplade og får lov til at bevæge sig i et åbent kammer30. For hver af disse billeddannelsesbetingelser vil det først være nødvendigt at vænne musene til billeddannelsesopsætningen. Dette papir beskriver tilvænnings- og billeddannelsesproceduren ved hjælp af et luftløftet hjemmebursystem.
Denne protokol beskriver implantationen af et kronisk kranievindue til langsgående in vivo-billeddannelse i cortex. Her vil vi bruge mus, der betinget udtrykker GCaMP6f i astrocytter til at overvåge calciumsignaldynamikken. Endvidere beskriver dette papir proceduren for virale injektioner ved hjælp af tdTomato som en etiket for neuroner. Dette gør det muligt at bestemme ændringer i neuronal synaptisk struktur og / eller tilgængeligheden som en strukturel markør, der muliggør gentagen billeddannelse af den samme astrocyt. I hele protokollen vil afgørende trin blive fremhævet for at sikre den bedst mulige kvalitet af billeder opnået ved multifotonmikroskopi.
Her har vi præsenteret en protokol for implantation af kroniske kranievinduer til in vivo-billeddannelse af kortikale astrocytter og neuroner i vågne, hovedbeherskede mus på et luftløftet hjemmebur. Der er givet specifikke eksempler på kranievinduesapplikationen til billeddannelse af astrocytter, der udtrykker GECIS’er og neuronale synaptiske strukturer. Ved brug af multifotonmikroskopi kan astrocytisk calciumsignaldynamik og strukturel synaptisk dynamik registreres gentagne gange over dage.
<p class="j…15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
Beveler | Narishige | Equipment | |
Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
Multiphoton Microscope | Equipment | ||
Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |