Summary
Här presenteras ett protokoll för implantation av ett kroniskt kranialfönster för längsgående avbildning av hjärnceller hos vakna, huvudhållna möss.
Abstract
För att fullt ut förstå den cellulära fysiologin hos neuroner och glia hos uppträdande djur är det nödvändigt att visualisera deras morfologi och registrera deras aktivitet in vivo hos möss som beter sig. Detta dokument beskriver en metod för implantation av ett kroniskt kranialfönster för att möjliggöra längsgående avbildning av hjärnceller i vakna, huvudhållna möss. I kombination med genetiska strategier och virala injektioner är det möjligt att märka specifika celler och regioner av intresse med strukturella eller fysiologiska markörer. Detta protokoll visar hur man kombinerar virala injektioner för att märka neuroner i närheten av GCaMP6-uttryckande astrocyter i cortex för samtidig avbildning av båda cellerna genom ett kranialfönster. Multifotonavbildning av samma celler kan utföras i dagar, veckor eller månader i vakna, uppträdande djur. Detta tillvägagångssätt ger forskare en metod för att se cellulär dynamik i realtid och kan tillämpas för att svara på ett antal frågor inom neurovetenskap.
Introduction
Förmågan att utföra in vivo multifotonfluorescensmikroskopi i mössens cortex är av största vikt för studien av cellulär signalering och struktur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, sjukdomspatologi 10,11 och cellulär utveckling12,13 . Med implantation av kroniska kranialfönster är längsgående avbildning möjlig, vilket möjliggör upprepad avbildning av kortikala områden i dagar, veckor eller månader13,14 hos levande djur. Multifotonmikroskopi är idealisk för in vivo, upprepad avbildning på grund av förbättrad djupprobning och minskad fotoskada i samband med den infraröda lasern som används. Detta möjliggör studier av molekylär och cellulär dynamik hos specifika celler i olika kortikala regioner.
Multifotonmikroskopi har använts för in vivo-avbildning av neuronala och gliaceller hos möss 15,16,17,18,19,20. Olika strategier kan implementeras för att märka särskilda celltyper och intresseområden. Ett vanligt tillvägagångssätt är att driva uttrycket av genetiskt kodade fluorescerande proteiner på ett cellspecifikt sätt med hjälp av Cre-Lox-rekombinationssystemet. Detta kan utföras med genetiskt modifierade möss, t.ex. genom att korsa tdTomato "floxed" mus (Ai14) med en mus som uttrycker Cre-recombinase under en promotor av intresse21. Alternativt kan cell- och platsspecifik märkning uppnås med virala injektioner. Här injiceras ett virus som kodar för Cre-rekombinas under en cellspecifik promotor och ett virus som kodar för en floxed gen av intresse i en definierad region. Lämpliga celltyper som tar emot båda virusvektorerna kommer då att uttrycka den eller de önskade generna. Dessa gener kan vara strukturella markörer, såsom tdTomato, för att se förändringar i cellulär morfologi22 eller genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI), såsom GCaMP och / eller RCaMP, för att undersökakalciumdynamiken 23. Metoder för genetisk rekombination kan tillämpas individuellt eller i kombination för att märka en eller flera celltyper. Ett tredje tillvägagångssätt, som inte kräver transgena möss eller virala konstruktioner (som har begränsad förpackningskapacitet), är in utero elektroporering av DNA-konstruktioner24. Beroende på tidpunkten för elektroporationen kan olika celltyper riktas 25,26,27.
När du utför multifotonavbildning kan möss avbildas medan de är vakna eller bedövade. Avbildning av vakna möss kan utföras genom att fästa musen via en fäst huvudplatta28. Detta tillvägagångssätt görs mindre stressande genom att tillåta relativt fri rörlighet för djuret med hjälp av metoder, såsom fritt flytande, luftstödda styrofoambollar29, fritt flytande löpband1 eller ett luftlyft hembursystem där möss fästs av en fäst huvudplatta och får röra sig i en öppen kammare30. För vart och ett av dessa avbildningsförhållanden kommer det först att vara nödvändigt att vanora mössen till bildinställningen. Detta dokument beskriver tillvänjnings- och bildbehandlingsproceduren med hjälp av ett luftlyft hembursystem.
Detta protokoll beskriver implantationen av ett kroniskt kranialfönster för längsgående in vivo-avbildning i cortex. Här kommer vi att använda möss som villkorligt uttrycker GCaMP6f i astrocyter för att övervaka kalciumsignaldynamiken. Vidare beskriver detta dokument proceduren för virala injektioner med tdTomato som en etikett för neuroner. Detta möjliggör bestämning av förändringar i neuronal synaptisk struktur och / eller tillgängligheten som en strukturell markör som möjliggör upprepad avbildning av samma astrocyt. Under hela protokollet kommer viktiga steg att belysas för att säkerställa bästa möjliga kvalitet på bilder som erhållits från multifotonmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjer som godkänts av IACUC vid University of Nebraska Medical Center.
1. Före operationen
- Förbered pipetter för virala injektioner. Dra borosilikatglaskapillärer med en pipettavdragare och fasa pipetten i 20 ° vinkel. Sterilisera pipetterna över natten.
- Förbered färska bitar av sterilt gelskum genom att skära dem i små rutor. Sänk ner gelskummet i ett sterilt mikrofugerör innehållande 0,5 ml saltlösning. Blötlägg gelskummet i saltlösning i minst 30 minuter före användning.
- Förbered färska bitar av svampremsor genom att skära dem i tunna remsor.
- Tjugo minuter före operationen, injicera 4-6 veckor gamla GLAST-CreER / GCaMP6f möss intraperitonealt med 0,2 mg / kg dexametason för att förhindra svullnad i hjärnan och 5 mg / kg karprofen för att minska inflammation.
OBS: För att inducera rekombination och uttryck av GCaMP6f i cirka 40% av astrocyterna injicerades GLAST-CreER/GCaMP6f-möss med 100 mg/kg tamoxifen vid 3 veckor under 5 på varandra följande dagar.
2. Start av operationen
- Efter 20 min, bedöva mössen med 3% isofluran med syre vid en flödeshastighet av 1 L / min i cirka 1,5 min.
- När den är sövd, placera musen på en stereotaxisk ram som sitter på en vattencirkulerande filt för att bibehålla en kroppstemperatur på 37 ° C under hela operationen. Fäst musen i ramen med hjälp av snutklämman och öronstängerna. Se till att snutklämman och öronstängerna är tillräckligt stabila för att huvudet inte ska röra sig under proceduren, men inte så tätt att skallen skadas.
- Behåll anestesi med 1-1,5% isofluran med syre vid en flödeshastighet på 1-2 L/min. Observera att vissa djur kan behöva mer eller mindre isofluran för att upprätthålla sedering. Övervaka djurets andning samt dess reflexer till tå- och svanskläm och justera isofluranet på lämpligt sätt.
- Applicera ögonsalva på varje öga med en bomullsspetsapplikator för att förhindra att ögonen torkar ut under proceduren.
- Använd gnagare trimmare, raka håret från nacken till precis förbi ögonen. Var försiktig för att säkerställa att djurets whiskers inte trimmas av misstag.
- Rengör det rakade området med en jod prep pad, följt av en alkohol prep pad.
- Skär och ta bort huden från de främre suturerna främre till bregma hela vägen bakåt till lambda med hjälp av sterila vävnadstäcett och kirurgisk sax.
- När huden har tagits bort, tillsätt cirka 0,1 ml 1% xylocain (lidokain med adrenalin 1: 200 000) till skallen för att minimera blödning av skallen.
- Skrapa försiktigt bindväven från skallen med ett sterilt storlek 11 kolstål kirurgiskt blad fäst vid ett handtag. Var extra försiktig när du tar bort bindväven nära kanten av skallen, eftersom eventuell återstående vävnad kan förhindra stark vidhäftning av glaset eller huvudplattan senare.
- Använd sterila vävnadstäcett för att ta bort lös bindväv från skallen.
- Rengör eventuella kvarvarande xylocain från skallen med hjälp av sterila bomullsspetsapplikatorer.
- När du är klar avfettar du skallen noggrant med en steril bomullsspetsapplikator doppad i aceton. Använd tryckluft för att omedelbart föna skallen.
3. Kraniotomi
- Mät lämplig storlek för öppningen på önskad plats med hjälp av en finpunktsmarkör och en linjal. Bekräfta öppningens storlek genom att jämföra den med täckglasets storlek (3 eller 5 mm i diameter); se till att öppningen är något mindre än täckglasets storlek.
- Använd en tandborr, spåra gradvis öppningens kontur, tunna benet. Borra långsamt för att förhindra borrning genom benet och borra i koncentriska cirklar för att underlätta jämn gallring av benet.
- Efter varje koncentriskt pass, tillsätt en droppe eller två steril saltlösning till det borrade området. Låt saltlösningen sitta i minst 10 s för att förhindra att benet överhettas och skadar den underliggande dura.
- Använd en steril bomullsspetsapplikator för att absorbera eventuell kvarvarande saltlösning. Blås tryckluft över området för att säkerställa att all kvarvarande saltlösning har avdunstat innan borrningen återupptas. Gör detta för att blåsa bort benskräp som finns kvar.
- Upprepa steg 3.2-3.4 tills benet är tillräckligt tunnat för borttagning.
- Se till att benet är tillräckligt tunnat för borttagning genom att försiktigt trycka på det centrala området av benet med fina pincett för att kontrollera att den tunna skallen rör sig. Den underliggande vaskulaturen ska vara synlig där borrningen inträffade. Observera att benet kan se ut som om det kommer att spricka där gallring inträffade.
OBS: Träning i detta skede är avgörande för att identifiera när benet har tunnats ut på lämpligt sätt. - Innan du försöker ta bort benet, kontrollera musen för att se till att den är helt sederad. Om inte, öka gradvis isofluranunderhållet för att förhindra hjärnsvullnad när du tar bort benet.
- Tillsätt en liten bit gelskum mättat i saltlösning till den tunna skallen. Tillsätt en eller två ytterligare droppar saltlösning till den tunna skallen.
OBS: Att ha gott om saltlösning över den tunna skallen hjälper till att minska blödningen och skydda dura när du tar bort benfliken. - Använd ett miniatyr 15 ° spetsigt blad, sätt försiktigt in bladet i det tunna benet och skär längs det tunna benet. Håll gelskummet blött i saltlösning, redo att stoppa eventuella blödningar som kan uppstå.
- Lyft försiktigt och ta bort benet med pincett. Var så försiktig som möjligt för att undvika skador på underliggande vävnad och vaskulatur. Var ytterst försiktig så att dura mater inte skadas.
- När benfliken har tagits bort, tillsätt en ny bit gelskum mättat i saltlösning till cortex. Tillsätt några droppar saltlösning för att förhindra att gelskummet torkar ut, eftersom detta kommer att orsaka skador på den underliggande vävnaden.
4. Virala injektioner
- Utför virala injektioner med hjälp av en stereotaxisk apparat.
- Förbered AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titer på 3 × 1013 genomkopior (GC)/ml) vid 1:5 000 genom seriella utspädningar i saltlösning.
- Förbered blandningen av AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5 000) och AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titer på 5 × 1012 GC/ml) på en liten bit parafilm.
- Fyll en steril fasad glaspipett med en spetsstorlek på 20 μm med virusblandningen genom att försiktigt placera pipetten på lösningen.
- Sänk pipetten så att den bara berör hjärnans yta och fortsätt att sänka för ytterligare 200-300 μm för L2/3-injektioner. Med hjälp av ett intracellulärt mikroinjektionsdispenseringssystem (se materialförteckningen) tryckinjicerar du 12-15 gånger under 2 minuter (20 psi, 9 ms pulsvaraktighet). Observera menisken i pipettfallet med varje injektion för att säkerställa att pipetten inte är blockerad.
- När du har injicerat, lämna pipetten i hjärnan i 4-5 minuter för att förhindra återflöde. Dra långsamt tillbaka pipetten.
- Upprepa injektionerna på 2-3 ställen (cirka 500 μm från varandra).
- Kassera de använda glaspipetterna, parafilmen, pipettspetsarna och mikrofugerören som används för seriella utspädningar av Cre-viruset i 10% blekmedel.
5. Implantation av kranialfönster
- Ta bort eventuellt gelskum och använd en liten remsa svampremsor för att suga upp eventuell kvarvarande saltlösning.
- Tillsätt några droppar av antibiotikumet enrofloxacin (22,7 μg /ml) till öppningen och låt det ligga kvar där i 1 min. Efter 1 min, använd en ny bit svampremsa för att absorbera eventuellt kvarvarande enrofloxacin. Upprepa denna process ytterligare två gånger.
- Efter den tredje tvätten, tillsätt några droppar saltlösning i öppningen och låt den förbli där i 1 min. Efter 1 min, använd en ny bit svampremsa för att absorbera eventuell kvarvarande saltlösning. Upprepa denna tvättprocess ytterligare två gånger och tillsätt en liten droppe saltlösning till öppningen efter den tredje tvätten.
- Placera täckglaset över öppningen. Använd pincett för att säkerställa att glaset är jämnt över öppningen för att få bilder av god kvalitet.
- Medan du försiktigt håller glaset på plats, applicera cyanoakrylathäftande gel (Table of Materials) runt glasets omkrets för att täta fönstrets kanter till skallen. Se till att inte låta limet sippra under täckglaset och håll så mycket lim från täckglasets yta som möjligt.
- Applicera ett lager superlim över limgelen. Tillsätt ett lager tandcementvätska över limet så att det kan härda.
- Ta en huvudplatta av helikoptertyp i lämplig storlek och applicera ett tunt lager lim runt den centrala öppningen. Placera huvudplattan över täckglaset och låt limet torka en kort stund.
- I ett 1,5 ml mikrofugerör, tillsätt dentalcementpulver till 0,1 ml-märket på röret. Tillsätt 7-8 droppar snabbhärdande, omedelbar lim och blanda. Rita i en 1 ml spruta med en 19 G nål som har skurits för att skapa en större öppning.
- Injicera blandningen genom helikopterstångens laterala hål tills den sipprar från vardera sidan. Applicera tandcement / limblandningen på resten av den exponerade skallen för att fästa huvudplattan på skallen, vilket kommer att minska rörelseartefakter under avbildning.
- Låt blandningen lufttorka i minst 15 minuter.
- Injicera musen med 0,5 ml saltlösning subkutant för att underlätta återhämtningen.
6. Efter operationen
- Ta bort musen från stereotaxisk ram och sätt tillbaka den till buret.
- Placera en del av buret på en vattencirkulerande filt, rymdgelvärmedynor eller isotermiska dynor för att hjälpa till med återhämtningen.
- Ge djuret en liten hjälp av matpellets och våtmat, förutom deras vanliga kost, för att ytterligare hjälpa till med återhämtning. Tillsätt ny matpellets och våt mat varje dag efter operationen under återhämtningstiden.
- Dagen efter operationen, injicera möss en gång med 5 mg/kg karprofen och 5 mg/kg enrofloxacin.
- På dag 2-6, injicera mössen en gång med 5 mg/kg karprofen och två gånger med 5 mg/kg enrofloxacin, i avvaktan på godkännande av den lokala IACUC. Separera enrofloxacininjektionerna med minst 8 timmar.
- På dag 7-20, injicera mössen dagligen med 5 mg / kg karprofen.
7. Djuranvänjning för avbildning
- På dag 14 efter operationen, undersök kranialfönstret för optisk klarhet. Använd inte möss med oklara eller på annat sätt skadade fönster (dvs. överdriven angiogenes).
- Kontrollera om tdTomato uttryck under ett fluorescensmikroskop. Om märkta celler kan identifieras, fortsätt med djuruppvänjning.
- Första dagen av tillvänjning (hantering)
- Håll musen i några minuter och sätt tillbaka den till buret efter hantering. Upprepa hanteringen tre gånger med ett intervall på 15 minuter mellan sessionerna.
- Efter den tredje rättegången, vana musen genom att förpacka djuret i en liten bit tyg.
- Håll musen insvept i tyg i cirka 1 min.
- Efter rättegången, sätt tillbaka musen till sin bur. Upprepa denna process ytterligare två gånger, vilket möjliggör ett intervall på 15 minuter mellan varje försök.
- Andra dagen av tillvänjning
- Väg och registrera musvikten.
- Vik musen i tyg och fäst den via huvudplattan till huvudfixeringsarmen på den luftlyfta hemburen.
- Lämna hemburet utsatt för ljuset.
- Låt musen sitta fast i husbilsburen i 15 min.
- Efter tillvänjning, ta bort musen från hemburet och stäng av luftflödet.
- Väg musen och sätt tillbaka den till buret. Var noga med att endast inkludera möss som inte förlorar mer än 10% av sin kroppsvikt. Uteslut möss som förlorar mer än 10% av sin vikt under någon dag av tillvänjning från bildexperiment.
- Dag tre av tillvänjning och därefter
- Väg och registrera musens vikt innan du fäster den i den luftlyfta hemburen.
- Fäst musen i den luftlyfta hemburen.
- Täck hemburet med något som ger en mörk inredning, till exempel en låda, och låt musen förbli säkrad i 30 minuter.
- Efter 30 minuter, avslöja hemburet, ta bort musen och stäng av luftflödet.
- Väg och registrera musvikten efter tillvänjning.
- Upprepa denna process varje dag, vilket ökar musens varaktighet är säkrad i hemburet med 15 minuter. Fortsätt denna process tills musen kan fästas i hemburet i 1,5 timmar eftersom detta är den ungefärliga varaktigheten för en tvåfotonavbildningssession.
- För att vana musen till brus, utför några tillvänjningssessioner på mikroskopet för att acklimatisera musen till ljudet från laserskanningsspeglarna. Uteslut möss som inte vant sig tillräckligt (dvs vokaliseringar och stressinducerad avföring).
8. Multifoton-avbildning
- Börja avbildning 3 veckor efter operationen för att tillåta fönstret att rensa.
- Utför avbildning på ett skräddarsytt eller kommersiellt tillgängligt multifotonmikroskop utrustat med en Ti: Safirlaser. Ta bilder med ett vattennedsänkningsmål med hög numerisk bländare (NA).
OBS: Tvåkanalsavbildning uppnås genom att använda en 565 nm dikroisk spegel och två externa fotomultiplikerrör. Ett 535/50 bandpassfilter används för att detektera GCaMP6f-utsläpp, och ett 610/75 bandpassfilter används för att detektera tdTomato. Ett 25x vattennedsänkningsmål (1,05 NA) och resonansskannrar användes för att få bilder som visas i figur 1 och figur 2. Varje region av intresse bestod av en stapel bilder separerade axiellt med 1 μm. Varje optisk sektion samlades in på 512 x 512 pixlar, 0,18 μm/pixel. Bilder förvärvades från frambensregionen i den primära motoriska cortexen som bestämdes av stereotaxiska koordinater. - Ställ in laserns våglängd på 920 nm (990 nm om en rödförskjuten GECI används).
- Placera musen på husbilsburet och kläm fast huvudplattan på huvudfixeringsarmen.
- Tillsätt några droppar vatten i mitten av fönstret.
- Använd mikroskopets bredfältsläge och välj 2-3 positioner med lätt identifierbar vaskulatur. Spara bilderna av dessa blodkärl och registrera X- och Y-koordinaterna som visas på motorstyrenheten för att flytta de tdTomato-märkta dendriterna för efterföljande bildsessioner. Justera X- och Y-koordinaterna varje gång för att anpassa dig till de sparade bilderna av blodkärlen.
- När vaskulaturen har avbildats och positioner registrerats, lokalisera regionerna med neuroner som uttrycker tdTomato (Figur 1). Avbilda de synaptiska strukturerna (dendriter och axoner) hos neuroner och GCaMP6f-aktivitet i astrocyter.
OBS: Dendriterna kommer att fungera som landmärken för att på ett tillförlitligt sätt återvända till samma regioner och avbilda samma dendriter och astrocyter under upprepade dagar. Ingen detekterbar förskjutning i avbildningsplanet observerades med stabil huvudfixering och efter tillvänjning till huvudfixering. Förskjutning som sker i X- och Y-riktningarna är rörelsekorrigerad. - Efter avbildning, sätt tillbaka musen till sin bur.
OBS: Möss hålls vanligtvis på räckvidden i högst 2 timmar. När avbildningen varar länge kan vattnet under målet torka. Vatten bör tillsättas under experimenten. Alternativt kan en ultraljudsgel användas istället för vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på kranialfönstret kan bedömas av hur skarpa de neuronala strukturerna uppträder. I ett bra fönster är dendritiska spines tydligt synliga (Figur 1). Med de strukturella och positionsdata som lagras kan samma djur avbildas upprepade gånger i dagar, veckor eller månader för att undersöka samma celler (figur 1). Bilderna i figur 1 erhölls från frambensregionen i den primära motorcortexen (i ett 5 mm fönster). En mängd olika parametrar kan mätas, inklusive densitet och dynamik hos dendritiska spines och axonala boutons för att studera strukturell synaptisk plasticitet. Astrocytisk aktivitet kan studeras genom att analysera den spatiotemporala dynamiken i kalciumsignalering (Figur 2). Beroende på mikroskopkapaciteten (dvs. resonansskannrar, piezomotor som styr målet) och den experimentella frågan kan time-lapse-avbildning utföras i ett enda fokalplan eller i en volym eller multiregion för att övervaka kalciumaktivitet vid önskad förvärvsfrekvens.
Figur 1: Upprepad avbildning av dendriter och astrocyter under dagar. En dendrit som uttrycker tdTomato (magenta) möjliggör identifiering och upprepad avbildning av GCaMP6f-uttryckande astrocyter (vita) i närheten. Ca2+ aktivitet inom astrocyter visas vid olika tidpunkter på olika dagar. Synaptisk strukturell plasticitet kan avbildas samtidigt. Två nya spines som dök upp på dag 2 är markerade med pilar. Medan en ryggrad kvarstod och var synlig på dag 5 (blå pil), eliminerades den andra ryggraden (grön pil). Skalstång = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Avbildning av astrocytisk kalciumsignalering. Bilder som visar Ca2+ aktivitet från en astrocyt som uttrycker GCaMP6f. Paneler visar Ca2+ aktivitet registrerad från en volym på 4 μm vid olika tidpunkter under förvärvet. Kalciumsignalering i processer och mikrodomäner kan observeras under viloperioderna. En global händelse som omfattar hela cellen kan observeras under en rörelsekamp vid 188 s. Skalstång = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi presenterat ett protokoll för implantation av kroniska kranialfönster för in vivo-avbildning av kortikala astrocyter och neuroner i vakna, huvudhållna möss på en luftlyft hembur. Specifika exempel har tillhandahållits på kranialfönsterapplikationen för avbildning av astrocyter som uttrycker GECI och neuronala synaptiska strukturer. Med hjälp av multifotonmikroskopi kan astrocytisk kalciumsignaldynamik och strukturell synaptisk dynamik registreras upprepade gånger under dagar.
Ett kroniskt kranialfönster ger god optisk bildkvalitet och gör det möjligt att utföra flera avbildningssessioner av samma neuronala och gliala strukturer. Tillvägagångssättet gör det också möjligt att utföra intrakraniella virusinjektioner innan kraniotomin täcks med ett täckglas.
Användare bör vara medvetna om ett antal begränsningar som uppstår genom implantation av kroniska kranialfönster. Erfarenhet och mycket övning behövs för att uppnå ett högkvalitativt fönster och för att säkerställa djurens överlevnad. Dessutom är operationen invasiv och kan resultera i ett inflammatoriskt svar. Farmakologisk behandling under operation och postkirurgisk återhämtning inkluderar antiinflammatoriska läkemedel och antibiotika31. Användningen av antiinflammatoriska läkemedel kanske inte är lämplig i studier som undersöker modeller av neuroinflammation eftersom dessa läkemedel också kan påverka fenomenet som studeras.
På senare tid har meningeal lymfangiogenes visat sig inträffa som svar på kranialfönsterimplantation32. Således kan det kroniska kranialfönstret därför inte vara acceptabelt för studier som undersöker meningeala lymfkärl. Viktigt är att en 2-3-veckors väntetid efter operationen är nödvändig före avbildningsexperiment31,33. Dessutom begränsar mössens ålder, liksom återhämtningstiden efter operationen, förmågan att avbilda mycket tidiga utvecklingshändelser. Medan kranialfönster kan implanteras hos yngre möss (P15-21)34, måste eventuella biverkningar, såsom inflammation, beaktas.
Som ett alternativ till det kroniska kranialfönstret kan tunna skallepreparat också göras. Denna metod resulterar i gallring av skallen över det område som är av intresse före avbildning. Ett tunnat skallefönster är mindre invasivt och övervinner behovet av antiinflammatorisk läkemedelsadministration, vilket gör det till ett val i studier som undersöker modeller av neuroinflammation och neuroimmuna interaktioner. Om upprepad avbildning önskas måste dock skallen tunnas ut igen före avbildning, och benet kan bara tunnas ut igen ett begränsat antal gånger innan bildkvaliteten försämras35.
Även om en modifierad version av en förstärkt tunnskallemetod som inte kräver rethinning har beskrivits36, kan en ojämn skalltjocklek orsaka sfäriska avvikelser, vilket resulterar i förvrängning av fluorescerande strukturer37. Således, när kvantitativa mätningar registreras, såsom kalciumsignaldynamik38 eller nivåer av synaptiska proteiner27, i motsats till identifieringen av strukturer såsom dendritiska spines, ger det kroniska kranialfönstret en mer optiskt stabil och pålitlig beredning. Således, för längsgående, in vivo-avbildning, är införandet av kranialfönster den överlägsna metoden för att undersöka förändringar som ett resultat av läkemedelsbehandling39, träning i ett beteendeparadigm 4,25 och synaptisk ombyggnad vid neurologiska störningar11,27.
Den beskrivna proceduren är tekniskt utmanande och utgör ett hinder för bildförvärv av hög kvalitet. Extrem försiktighet måste iakttas vid varje steg för att säkerställa att fönstret förblir fritt från infektion och skador på den underliggande vävnaden undviks. Detta inkluderar mild skrapning av bindväv på skallen, ta tillräckliga pauser för att kyla benet vid borrning, säkerställa enhetlig gallring för att underlätta enkel benborttagning, förhindra hjärnsvullnad och extrem försiktighet för att inte skada dura mater under operationen. Endast de bästa fönsterpreparaten förblir optiskt transparenta under längre perioder av avbildning.
Medan förändringar i synaptiska strukturer kan avbildas hos bedövade möss över dagar, är detta inte att föredra när man undersöker astrocytkalciumsignalering eftersom anestesi har visat sig störa astrocytkalciumsignalering in vivo40. För att utföra in vivo-avbildning hos vakna, huvudhållna möss är det viktigt att vanor djuret till bildförhållandena i husbilsburen, fritt flytande löpband, luftlyftad styrofoamboll eller annan apparat. Korrekt tillvänjning kommer inte bara att minska stress under avbildning, utan också agera för att minimera rörelseartefakter under bildbehandlingssessionerna.
Sammanfattningsvis är in vivo multifotonmikroskopi genom ett kroniskt kranialfönster ett användbart verktyg för att studera strukturella och funktionella förändringar av celler i cortex. Med hjälp av cellspecifika fluorescerande färgämnen och reportrar är det möjligt att studera cellulär morfologi, interaktioner och aktivitet. Med den längsgående avbildning som tillåts av kroniska kranialfönster är det möjligt att undersöka hur synaptiska strukturer förändras och utvecklas över tiden13,14. Med hjälp av protokollet som presenteras här är det möjligt att undersöka kalciumsignaldynamiken i astrocyter på grund av sensorisk stimulering23,38, rörelse eller skrämseln 6,41, sjukdom 15,42 eller andra parametrar av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
