Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

2D و 3D المستحثة من قبل الإنسان نماذج الخلايا الجذعية متعددة القدرات القائمة على تشريح تورط سيليوم الأولية أثناء تطور القشرة المخية الجديدة

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف 2D و 3D المستحثة بالإنسان الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hIPSC) القائمة على تطوير القشرة المخية الحديثة بالإضافة إلى منهجيات تكميلية تمكن من التحليل النوعي والكمي للنشأة الحيوية الأولية (PC) ووظيفتها.

Abstract

الأهداب الأولية (PC) هي عضيات ديناميكية غير متحركة قائمة على الأنابيب الدقيقة تبرز من سطح معظم خلايا الثدييات. وهي تخرج من المريكز الأقدم خلال مرحلة G1 / G0 من دورة الخلية ، بينما تتفكك مع عودة الخلايا إلى دورة الخلية عند حدود مرحلة G2 / M. وهي تعمل كمحاور إشارة ، من خلال اكتشاف ونقل الإشارات خارج الخلية الحاسمة للعديد من عمليات الخلايا. على غرار معظم أنواع الخلايا ، فقد ثبت أن جميع الخلايا الجذعية والسلفية العصبية القشرية الجديدة (NSPCs) تؤوي جهاز كمبيوتر يسمح لها باستشعار ونقل إشارات محددة مطلوبة للنمو القشري الدماغي الطبيعي. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لإنشاء وتوصيف النماذج القائمة على الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hIPSCs) لزيادة تشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي أثناء تطوير القشرة المخية الجديدة. على وجه الخصوص ، نقدم بروتوكولات لدراسة التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته في NSPCs المشتقة من الوردة العصبية 2D بما في ذلك نقل مسار القنفذ الصوتي (SHH). للاستفادة من التنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) للعضويات الدماغية ، نصف طريقة بسيطة للتصوير ثلاثي الأبعاد للعضويات الدماغية الملطخة بالمناعة. بعد التطهير البصري ، يسمح الاكتساب السريع للعضويات بأكملها بالكشف عن كل من الجسيمات المركزية والكمبيوتر الشخصي على أسلاف القشرة المخية الجديدة والخلايا العصبية للعضوي بأكمله. أخيرا ، نقوم بتفصيل الإجراء الخاص بالتلطيخ المناعي وتطهير الأقسام العضوية السميكة العائمة بحرية مع الحفاظ على درجة كبيرة من المعلومات المكانية 3D والسماح بالحصول على دقة عالية المطلوبة للتحليل النوعي والكمي المفصل للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته.

Introduction

الأهداب الأولية (PC) هي عضيات تعتمد على الأنابيب الدقيقة التي تستشعر وتنقل عددا كبيرا من الإشارات الكيميائية والميكانيكية من البيئة خارج الخلية. على وجه الخصوص ، الكمبيوتر الشخصي هو العضية المركزية لنقل مسار إشارات القنفذ في الفقاريات1,2. في حين أن معظم الخلايا العصبية قد ثبت منذ فترة طويلة أنها تؤوي جهاز كمبيوتر ، إلا أن مساهمة هذه العضية في تشكيل الجهاز العصبي المركزي قد تم التقليل من قيمتها منذ فترة طويلة. أدت الدراسات التي أجريت على تطور القشرة المخية الجديدة إلى اكتشاف العديد من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPCs) ، وكلها تؤوي جهاز كمبيوتر ، وقد اقترح أن يكون موقعه حاسما لتحديد مصير السلف 3،4،5،6،7. وقد ثبت أن الكمبيوتر الشخصي ضروري لآليات الخلايا المطلوبة للنمو القشري الدماغي الطبيعي ، بما في ذلك توسيع NSPC والالتزام 8،9،10،11،12 وكذلك القطبية القاعدية للسقالة الدبقية الشعاعية التي تدعم الهجرة العصبية13. بالإضافة إلى ذلك ، مطلوب جهاز كمبيوتر أثناء الهجرة العرضية بين الخلايا العصبية إلى اللوحة القشرية 14,15. أخيرا ، تم اقتراح دور للكمبيوتر الشخصي في إنشاء اتصالات متشابكة للخلايا العصبية في القشرة الدماغية16,17. وإجمالا، تجادل هذه النتائج بدور حاسم للكمبيوتر الشخصي في الخطوات الرئيسية للتطور القشري الدماغي18،19 وتثير الحاجة إلى التحقيق في تورطها في الآليات المرضية الكامنة وراء الشذوذ في التطور القشري الدماغي.

وقد حسنت الدراسات الحديثة إلى حد كبير فهمنا للاختلافات الخلوية والجزيئية الهامة بين التطور القشري في النماذج البشرية والحيوانية، مع التأكيد على الحاجة إلى تطوير أنظمة النماذج البشرية. في هذا الرأي، تمثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hIPSCs) نهجا واعدا لدراسة التسبب في الأمراض في سياق جيني وخليوي ذي صلة. تحتوي النماذج الخلوية ثنائية الأبعاد (2D) الملتصقة أو الورود العصبية على NSPCs مماثلة لتلك التي شوهدت في القشرة الدماغية النامية ، والتي تصبح منظمة في هياكل على شكل وردة تظهر قطبية أبيكوبازية صحيحة20،21،22. علاوة على ذلك ، يسمح نظام الاستزراع ثلاثي الأبعاد (3D) بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية التي تلخص العديد من ميزات التطور القشري الدماغي البشري23،24،25،26. يقدم هذان النهجان التكميليان للنمذجة القائمة على الخلايا وجهات نظر مثيرة لتشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي أثناء التطور الطبيعي والمرضي للقشرة الدماغية.

هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف الورود العصبية و NSPCs المشتقة وكذلك الأعضاء الظهرية في الدماغ الأمامي. كما نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل التكوين الحيوي ووظيفة الكمبيوتر الموجود على NSPCs من خلال اختبار نقل مسار القنفذ الصوتي وتحليل ديناميكيات الجزيئات الحاسمة المشاركة في هذا المسار. للاستفادة من تنظيم 3D من المواد العضوية الدماغية، ونحن أيضا إعداد طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتصوير 3D من في toto المناعية العضوية الدماغية مما يسمح اكتساب سريع، بفضل المجهر ورقة ضوء، من العضوية بأكملها، مع دقة عالية تمكن من تصور جهاز الكمبيوتر على جميع أنواع السلف القشرية الجديدة والخلايا العصبية من العضوية بأكملها. وأخيرا، قمنا بتكييف الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام 150 ميكرومتر العائمة الحرة مع التطهير والاقتناء اللاحق باستخدام المجهر البؤري الضوئي الرنين مما يسمح بالحصول على صورة عالية الدقة، وهو أمر مطلوب للتحليل التفصيلي للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته. على وجه التحديد ، يسمح برنامج التصوير ثلاثي الأبعاد بإعادة بناء الكمبيوتر الشخصي 3D مع التحليل اللاحق للمعلمات المورفولوجية بما في ذلك طول الكمبيوتر وعدده واتجاهه بالإضافة إلى قياس كثافة الإشارة للمكونات الهدبية على طول axoneme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليد نماذج 2D hIPS القائمة على الخلايا لتطوير القشرة المخية الجديدة

  1. تشكيل وردة عصبية
    1. ابدأ بثقافات hIPSC التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة ، وتظهر أقل من 10٪ من التمايز ولا تزيد عن 80٪ من التقاء.
    2. شطف hIPSCs مع 2 مل من PBS.
    3. أضف 2 مل من وسط الحث NSPC المكمل بمثبط الصخور (NIM + 10 μM من Y-27632).
    4. قم بتشريح كل مستعمرة hIPSC يدويا من طبق واحد 35 مم باستخدام إبرة لقطع كل مستعمرة بدقة في الاتجاهين الأفقي والرأسي لإنشاء نمط لوحة الشطرنج الذي يقسم كل مستعمرة إلى مجموعات متساوية.
    5. افصل المستعمرة باستخدام مكشطة خلايا وانقلها إلى طبق 35 مم منخفض التوصيل.
    6. دعها تطفو بين عشية وضحاها (ON) في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، حتى يتمكنوا من تكوين أجسام جنينية (EBs).
      ملاحظة: يتم تعريف الأجسام الجنينية (EBs) على أنها مجموعات كروية عائمة أو مجاميع من hIPSCs.
    7. انقل EBs إلى أطباق 35 مم مغلفة بالبولي L-ornithine / lam (PO / lam) في 2 مل NIM + 10 ميكرومتر من Y-27632.
    8. قم بتحديث متوسط تحريض NSPC يوميا (NIM بدون Y-27632) حتى تكوين وريدات عصبية تستغرق حوالي 12 إلى 14 يوما. تحقق تحت المجهر.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة يمكن توسيع الوريدات العصبية وتمييزها ومعالجتها لتحليل التلطيخ المناعي أو فصلها للحصول على الخلايا الجذعية العصبية والسلفية المعزولة (NSPCs).
  2. توسع الوردة العصبية والتمايز المبكر
    1. قطع الورود العصبية في نمط يشبه الشبكة باستخدام إبرة وإزاحة المجموعات باستخدام مكشطة الخلايا.
    2. انقل الورود إلى صفيحة من 4 آبار تحتوي على غطاء زجاجي مطلي ب PO / lam (4-5 وريدات / بئر) في 0.5 مل من وسيط صيانة NSPC (NMM).
    3. احتضن اللوحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. قم بتحديث NMM كل يومين حتى اليوم 20.
    5. من اليوم 20 ، استنفدت الورود العصبية المستزرعة في 0.5 مل من السيتوكين NMM للسماح بالتمايز. تحديث الوسط كل 2-3 أيام.
    6. في اليوم 30 واليوم 40 (10 أو 20 يوما من التمايز) ، قم بإصلاح الورود ب 0.5 مل من PFA 4٪ ، 20 دقيقة ، RT.
  3. التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي وتحليل الوظائف على NSPCs المعزولة
    1. انفصال NSPC
      1. قطع الورود العصبية من الخطوة 1.1.8 في نمط يشبه الشبكة بإبرة وإزاحة المجموعات باستخدام مكشطة الخلايا. انقل الخلايا إلى أطباق PO / lam المغلفة ب 35 مم في 2 مل من NMM واحتضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      2. قم بتحديث NMM كل يومين حتى التقاء (حوالي 5-7 أيام).
      3. بعد كشط الخلايا الكبيرة والواضحة المحيطة بالورود العصبية ، قم بالتقاطها يدويا ونقلها إلى أطباق 35 مم الطازجة المغلفة ب PO / lam لإثراء NSPCs واستنزاف أنواع الخلايا غير العصبية.
      4. بعد مرور يدوي واحد أو اثنين (كرر الخطوة 1.3.1.3 إذا لزم الأمر) المطلوب لإزالة جميع أنواع الخلايا الملوثة ، قم بإزالة الوسط وشطفه باستخدام PBS.
      5. أضف 300 ميكرولتر من 0.05٪ من التربسين واحتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل معظم الخلايا.
      6. أضف 2 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ FBS (DMEM + 10٪ FBS) لتعطيل التربسين. جمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل. قم بماصة تعليق الخلية بلطف لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لتفتيت كتل الخلايا.
      7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      8. استنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق الخلايا في NMN.
      9. زرع NSPCs المنفصلة كخلايا واحدة (1 × 105 خلية / سم 2) في NMM على الأطباق المغلفة PO / lam واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      10. قم بتوسيع NSPCs في NMM عن طريق تغيير الوسيط كل يومين.
        ملاحظة: يتم زرع NSPCs بكثافة عالية لتجنب التمايز.
    2. تحليل التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي
      1. تقوم البذور بفصل NSPCs عند 100000 خلية / سم 2 وتحضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في NMM لمدة يومين.
      2. استنشاق NSPCs المتوسطة والجائعة في الوسط المستنفد للسيتوكين (وسط التجويع NSPC ، الجدول التكميلي 1) لمدة 48 ساعة.
      3. إصلاح NSPCs مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في RT.
      4. يغسل مرتين مع PBS لمدة 5 دقائق في RT قبل تلطيخ المناعة.
    3. تحليل وظيفة الكمبيوتر: مسار إشارات SHH
      1. تفصل البذور NSPCs في 100000 خلية / سم 2 على شرائح غرفة 8 بئر (300 ميكرولتر) أو T25 (5 مل) مغلفة ب PO / lam (300 ميكرولتر) أو T25 أطباق (5 مل) وتحضن في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في NMM لمدة يومين.
      2. تجويع NSPCs في وسط تجويع NSPC (300 ميكرولتر لكل بئر من شريحة غرفة 8 آبار و 5 مل في قارورة T25) لمدة 48 ساعة.
      3. للحث على مسار SHH ، احتضان NSPCs مع وسط التجويع المكمل ب SHH المؤتلف (100 نانوغرام / مل) أو SAG (500 نانومتر) ؛ (150 ميكرولتر لكل بئر من شريحة غرفة 8 آبار و 2 مل في قارورة T25) لمدة 24 ساعة.
      4. قم بإصلاح NSPCs المستزرعة على شرائح غرفة 8 بئر في 250 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل بئر لمدة 20 دقيقة في RT واغسلها مرتين ب 250 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق في RT قبل تحليل التلطيخ المناعي.
      5. قم بإزالة الوسط واغسل NSPCs المستزرعة في أطباق T25 باستخدام PBS.
      6. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ من التربسين واحتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا.
      7. أضف 2 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ FBS (DMEM + 10٪ FBS) لتعطيل التربسين وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
      8. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بشفط المادة الفائقة بعناية للحصول على كريات NSPC التي يمكن حفظها بالتجميد عند -80 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR.

2. توليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية

  1. زراعة خلية واحدة من hIPSCs
    1. ابدأ بثقافات hIPSC التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة تظهر أقل من 10٪ من التمايز والتي تم تمريرها مرة واحدة تقريبا. تأكد من أن الخلايا لا تزيد عن 80٪ ملتقية.
    2. اغسل المستعمرات ب 2 مل من PBS.
    3. أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا اللطيف (GCDR) واحتضنه لمدة 5 إلى 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. استنشق GCDR وأضف 2 مل من وسط mTeRS1 مع 5 ميكرومتر من Y-27632.
    5. ماصة الخلايا بلطف لأعلى ولأسفل 10 مرات لفصل جميع المستعمرات إلى خلايا واحدة.
    6. انقل الخلايا على الأطباق المغلفة بالفيترونيكتين واحتضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: قم بإجراء 1 مرور على الأقل من hIPSCs باستخدام GCDR قبل تجربة التمايز لتكييف hIPSCs مع ظروف زراعة خلية واحدة.
  2. في اليوم 0 ، اسمح ل hIPSCs بتكوين أجسام جنينية في وسط EB يحتوي على تركيز منخفض من FGF2 وتركيز عال من مثبطات الصخور اللازمة للبقاء على قيد الحياة. للقيام بذلك اتبع الخطوات أدناه.
    1. اغسل المستعمرات ب 2 مل من PBS.
    2. أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا اللطيف (GCDR) واحتضنه لمدة 5 إلى 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. شفط GCDR وإضافة 1 مل من وسط EB مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632 ؛ استخدم ماصة 1 مل لفصل الخلايا بلطف ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. شطف مرة أخرى مع 2 مل من EB المتوسطة مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632 ، ونقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف على الفور 3 مل من وسط EB مع 50 ميكرومتر من Y-27632 إلى الأنبوب المخروطي وقم بتجانس المحلول بلطف باستخدام ماصة 5 مل.
    5. الطرد المركزي للخلايا المنفصلة عند 100 × g لمدة 5 دقائق.
    6. استنشق بلطف supernatant وأعد تعليق الخلايا في 6 مل من وسط EB مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632.
    7. الطرد المركزي للخلايا في 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
    8. استنشاق supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط EB مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632. استخدم ماصة 1 مل لفصل الخلايا بلطف إلى تعليق أحادي الخلية.
    9. مباشرة بعد تعليق الخلايا ، قم بتمييعها وحسابها.
    10. قم بتخفيف الحجم المناسب لتعليق الخلايا (الذي يحتوي على 900000 خلية) إلى 30 مل من وسط EB مع 50 ميكرومتر من Y-27632 و 4 نانوغرام / مل من bFGF واخلط المحلول بلطف.
    11. لوحة 9000 خلية / بئر في لوحة 96U المرفقة منخفضة للغاية (300 ميكرولتر / بئر). لتجنب إزعاج تكوين EB ، احتضن اللوحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى اليوم 3 دون تغيير متوسط.
  3. الحث العصبي (تثبيط SMAD المزدوج)
    1. في اليوم 3 ، تأكد من قياس EBs 300-400 ميكرومتر وإظهار الحدود العادية. إذا تم الوصول إلى كلا المعيارين ، فاستبدل نصف الوسط (150 ميكرولتر) بوسط تحريضي -1 يحتوي على مثبطات SMAD المزدوجة ، مما يؤدي إلى سطوع محيط EBs بحلول اليوم 6 إلى اليوم 7 مما يشير إلى التمايز العصبي الخارجي للأدمة (الجدول التكميلي 2).
    2. في اليوم 4 ، استبدل 3/4 من الوسط (225 ميكرولتر) بوسط الحث -1.
    3. في اليوم 6 واليوم 8: قم بتحديث نصف متوسط الحث -1 (150 ميكرولتر).
  4. تضمين عضوي في مصفوفة الغشاء السفلي (اليوم 10)
    1. في اليوم 10 ، أدى تضمين EBs في عامل النمو إلى تقليل مصفوفة الغشاء السفلي (BMM).
      ملاحظة: من هذه الخطوة ، استخدم دائما مقص معقم لقطع فتحة أطراف الماصة لتجنب إتلاف المواد العضوية عن طريق السحب المتكرر.
    2. أول نقل حوالي 15-17 العضوية في أنابيب مخروطية. دع EBs تستقر وتزيل الوسيط. أضف 50 ميكرولتر من الحث المتوسط-2 وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 100 ميكرولتر من BMM.
    3. انشر خليط المصفوفة-EB على وسط بئر من صفيحة شديدة الانخفاض في التركيب وافصل EBs لمنعها من الانصهار.
    4. دع BMM يتصلب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    5. أضف 3 مل من متوسط الحث -2 في كل بئر وضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: تأكد من أن هذا الإجراء يتم في أسرع وقت ممكن حيث يتصلب BMM في درجة حرارة الغرفة.
  5. الثقافة الثابتة للعضويات المضمنة في مصفوفة الغشاء السفلي
    1. اليوم 12 ، 14: تحديث الحث المتوسط-2.
    2. اليوم 16: تحديث الحث المتوسط-2 والتحقق تحت المجهر من توسع الحلقات الظهارية العصبية.
  6. تفكك مصفوفة الغشاء السفلي وثقافتها على شاكر مداري
    1. في اليوم 17 ، قم بفصل المواد العضوية عن BMM عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة 5 مل ونقلها إلى وسط التمايز -1 (بدون فيتامين أ). احتضن على شاكر مداري عند 80 دورة في الدقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لتحسين الامتصاص الغذائي.
      ملاحظة: استخدم حاضنة مختلفة للزراعة الثابتة والثقافة على شاكر مداري لتجنب أي اهتزازات ضارة بنمو خلايا hIPS الملتصقة.
    2. اليوم 19: تحديث التمايز المتوسط-1.
    3. اليوم 21: تغيير وسط التمايز -1 إلى وسط التمايز -2 (مع فيتامين أ).
    4. من اليوم 23 إلى اليوم 35: تحديث الوسط مع وسط التمايز -2 كل 2-3 أيام.
    5. من اليوم 35 إلى اليوم 70: تحديث التمايز المتوسط-2 مع 1٪ BMM وتحديث كل 2-3 أيام.
    6. جمع المواد العضوية بعد 28 و 42 و 70 +/- يومين من التمايز وإصلاحها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، في 5 مل 4 ٪ PFA على أنبوب مخروطي 15 مل.
    7. لمزيد من المعلومات في تحليل التلطيخ المناعي المتطاير أو العائم الحر ، يتم شطف المواد العضوية مرتين في PBS وحفظها عند 4 درجات مئوية في PBS + 0.05٪ من أزيد الصوديوم.
    8. لتحليل التلطيخ المناعي على الأقسام المجمدة ، اغمر 4٪ من المواد العضوية الثابتة PFA في 10 مل 30٪ من السكروز عند +4 درجة مئوية (أو حتى تغرق المواد العضوية). قم بتضمينها في مصفوفة تضمين مجمدة وتخزينها على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التقسيم بالتبريد.

3. في toto المناعي ، والمقاصة ، والحصول على ورقة الضوء من المواد العضوية الظهرية في الدماغ الأمامي

  1. تثبيت
    1. جمع المواد العضوية في لوحات 6 آبار ، وإزالة الوسط ، وإصلاحها مع 2 مل من PFA 4 ٪ ، في 4 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    2. قم بإجراء ثلاث غسلات في 2 مل من PBS في درجة حرارة الغرفة.
    3. انقل المواد العضوية إلى أنابيب 2 مل وخزنها عند 4 درجات مئوية في 2 مل من PBS + 0.05٪ من أزيد الصوديوم.
  2. النفاذية
    1. احتضان المواد العضوية في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2٪ Triton X100 في RT لمدة 1 ساعة. افعل ذلك مرتين.
    2. احتضان في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2 ٪ Triton X100 و 20 ٪ DMSO ، عند 37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    3. احتضان في 1 مل من PBS تحتوي على 0.1 ٪ Tween20 ، 0.1 ٪ Triton X100 ، 0.1 ٪ Deoxycholate ، 0.1 ٪ NP40 و 20 ٪ DMSO ، عند 37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    4. احتضان في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2 ٪ Triton-X100 ، في RT ، لمدة 1 ساعة. افعل ذلك مرتين.
  3. الحجب ووضع العلامات المناعية
    1. كتلة في 1 مل من محلول الحجب (PBS ، 0.2 ٪ Triton X100 ، 6 ٪ مصل الحمار ، 10 ٪ DMSO) ، في 37 درجة مئوية ، على.
    2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 250 ميكرولتر من PBS ، 0.2 ٪ Tween20 ، 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، 5 ٪ DMSO و 3 ٪ مصل الحمار ، عند 37 درجة مئوية ، لمدة يومين.
    3. يغسل في 1 مل من PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، لمدة 1 ساعة ، عند 37 درجة مئوية. افعل ذلك أربع مرات.
    4. يغسل في 1 مل من PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، بين عشية وضحاها ، عند 37 درجة مئوية.
    5. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 250 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.2 ٪ Tween 20 ، 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين و 3 ٪ مصل الحمار ، عند 37 درجة مئوية ، لمدة يومين.
    6. يغسل في 1 مل من PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween 20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، لمدة 1 ساعة ، على عجلة ، في RT. افعل ذلك أربع مرات.
    7. يغسل في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2٪ Tween 20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، بين عشية وضحاها ، على عجلة ، في RT.
    8. يغسل في 1 مل من PBS ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
    9. يخزن عند +4 درجة مئوية في 1 مل من PBS و 0.05٪ من أزيد الصوديوم حتى المقاصة.
  4. المقاصة في TDE (2,2′ -ثيوديثانول)
    1. احتضان المواد العضوية في 1 مل من 30٪ TDE (3 مل من TDE + 7 مل من PBS) ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
    2. احتضان في 1 مل من 60٪ TDE (6 مل من TDE + 4 مل من PBS) ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
    3. احتضان في 1 مل من 80٪ TDE (8 مل من TDE + 2 مل من PBS) ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
  5. التضمين العضوي قبل الحصول على ورقة الضوء
    ملاحظة: استخدام نظام حسب الطلب؛ مصنوعة من حقنة 1 مل مع قطع الطرف مع مشرط.
    1. تحضير 100 مل من 4٪ Agarose منخفض الذوبان في محلول TDE 60٪ و aliquot في أنابيب 2 مل. يحفظ عند +4 درجة مئوية.
    2. قبل التضمين العضوي ، قم بتسخين أنبوب واحد يحتوي على 1.5 مل من الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 4٪ في 60٪ TDE في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يسيل .
    3. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد نظام صب مصنوع خصيصا من حقنة 1 مل يتم قطع طرفها باستخدام مشرط.
    4. ضخ في حقنة 600 ميكرولتر من محلول هلام باستخدام المكبس.
    5. ضع العينة باستخدام طرف ماصة موسع تم قطع فتحته باستخدام مقص معقم.
    6. املأ المحقنة ب 400 ميكرولتر من محلول الجل بحيث يتم وضع العينة داخل الثلث السفلي من المحقنة.
    7. دع الجل يتبلمر ويخزن في محلول TDE بنسبة 80٪ عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى الاكتساب.
    8. للحصول على ورقة الضوء ، استخدم هدفا 20x مغمورا في محلول TDE بنسبة 80٪ المضاف في غرفة العينة للسماح بالتكيف بدقة مع معامل الانكسار لطريقة المقاصة.
    9. أدخل المحقنة التي تحتوي على الأغاروز العضوي المدمج في أكبر حامل عينة مصمم لاستيعاب حقنة 1 مل يمكن تشغيل مكبس منها لوضع العضو أمام الهدف.
      ملاحظة: يستغرق الحصول على ورقة خفيفة من عضوي كامل حوالي 5 إلى 10 دقائق.

4. تلطيخ مناعي وتطهير الأجزاء العائمة الحرة من عضويات الدماغ الأمامي الظهرية

  1. تثبيت، تضمين الأغاروز، وتقسيم المواد العضوية
    1. جمع المواد العضوية بعد 28 و 42 و 70 +/- يومين من التمايز في لوحة من 6 آبار وتثبيتها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في 2 مل من 4٪ PFA.
    2. شطف مرتين في 2 مل من PBS والحفاظ عليها في 4 درجة مئوية في 2 مل من PBS + 0.05 ٪ أزيد الصوديوم.
    3. قم بتضمين المواد العضوية الثابتة في 4٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في قالب تضمين بلاستيكي (7 × 7 مم). قم بإزالة كتلة الأغاروز بعناية من القالب البلاستيكي ولصقها على مرحلة الاهتزاز.
    4. قسم المواد العضوية المضمنة باستخدام اهتزاز للحصول على مقاطع 150 ميكرومتر حرة عائمة يتم نقلها في بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من PBS باستخدام فرشاة طلاء لتجنب إتلاف الأقسام.
      ملاحظة: يوصى باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار لأن درجة حرارة انصهاره تبلغ حوالي 60 درجة مئوية فقط. تحضير 4٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في محلول PBS واتركه ليبرد فوق 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل التضمين العضوي.
  2. التخلل والحجب والتلطيخ المناعي
    1. احتضان الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 0.3٪ Triton X100 ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 20 دقيقة. افعل ذلك ثلاث مرات.
    2. احتضان الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 0.3 ٪ Triton X100 و 5 ٪ حليب خالي الدسم ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 2 ساعة.
    3. احتضان الأقسام في 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (PBS + 0.3 ٪ Triton X100 + 1 ٪ حليب خالي الدسم) ، تحت الإثارة ، عند +4 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    4. اغسل الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 20 دقيقة. افعل ذلك أربع مرات.
    5. احتضان الأقسام في 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي (PBS + 0.3 ٪ Triton X100 + 1 ٪ حليب خالي الدسم) ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 2 ساعة.
    6. اغسل الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 20 دقيقة. افعل ذلك أربع مرات.
    7. قم بتخزين الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS ، عند +4 درجة مئوية حتى التطهير.
  3. المقاصة في TDE (2,2′ -ثيوديثانول)
    1. احتضان الأقسام في 500 ميكرولتر من 30٪ و 60٪ TDE لمدة 1 ساعة لكل منها في RT ، ثم في 500 ميكرولتر من 80٪ TDE بين عشية وضحاها ، في RT.
    2. قم بتخزين الأقسام التي تم تطهيرها في 500 ميكرولتر من 80٪ TDE حتى الاستحواذ عند +4 درجة مئوية.
  4. تركيب المقاطع العائمة بحرية قبل الاستحواذ باستخدام المسح البؤري الرنانة
    1. قم بتركيب قسم عائم حر في غرفة مغلقة تمكن من الحفاظ على العينة في محلول TDE بنسبة 80٪ ومصممة للتكيف مع مرحلة XY الآلية من المجاهر البؤرية.
    2. ضع غطاء دائريا واحدا في نظام الغرفة.
    3. انقل بعناية القسم المناعي الذي تم مسحه باستخدام فرشاة الطلاء.
    4. املأ الغرفة بمحلول TDE بنسبة 80٪.
    5. أضف اثنين من أغطية الغطاء القياسية بالإضافة إلى غطاء دائري ثان واحد وختم سيليكون.
    6. المسمار على حلقة الشد من الغرفة لختم النظام تماما.

5. ورقة الضوء والمسح الرنانة تحليل البؤري

  1. معالجة ورقة الضوء وعمليات الاستحواذ على المسح الضوئي الرنانة باستخدام البرامج التي تمكن من تصور 3D وتحليل العينة المناعية بأكملها.
    ملاحظة: يسمح هذا البرنامج بفتح البيانات الضخمة بسرعة لعمل لقطات ورسوم متحركة بسهولة. يسمح بنقل العينة في اتجاهات مختلفة وإنشاء طرق عرض 2D بفضل أداة تقطيع طرق العرض 2D في اتجاهات مختلفة ، XY و YZ على سبيل المثال.
  2. للكشف التلقائي عن كل من الجسيمات المركزية والأهداب الأولية ، استخدم معالج موضعي يتيح تحديد عددها في الظروف المرضية مقابل ظروف التحكم.
  3. لإعادة بناء 3D للكمبيوتر الشخصي مما يتيح قياسا دقيقا لطولها ، استخدم معالج خيوط لإصلاح نقطة انطلاق الكمبيوتر يدويا ويستخدم البرنامج إشارة التألق لإعادة بناء الكمبيوتر بدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نماذج 2D hIPS القائمة على الخلايا لدراسة التخلق الحيوي الأولي للسيليوم ووظيفته
تم تكييف البروتوكول المفصل هنا من الدراسات المنشورة سابقا20،21،22. يسمح هذا البروتوكول بتوليد هياكل وردة عصبية تحتوي على أسلاف قشرة جديدة وخلايا عصبية مشابهة لتلك التي شوهدت في القشرة المخية الجديدة النامية. يمكن إجراء التحقق التفصيلي من خلال تحليل التلطيخ المناعي التقليدي باستخدام صانعي محددين3. على سبيل المثال ، يجب أن تكون السلف القمية (AP) مزدوجة اللون مع SOX2 و PAX6 ، ويتم الكشف عن السلف الوسيط (IP) عن طريق تلطيخ TBR2 / EOMES ، ويتم الكشف عن الخلايا العصبية القشرية الجديدة المولودة مبكرا عن طريق تلطيخ CTIP2 (الشكل 1A-C). مثل هذه الهياكل العصبية الشبيهة بالوردة نموذج للهجرة النووية بين الحركية (INM) من AP التي يمكن تصورها عن طريق تلطيخ المناعة بالأجسام المضادة المرفوعة ضد الفوسفو فيمنتين ، الذي يلطخ النوى الانقسامية و TPX2 التي تلطخ المغزل الانقسامي. وبالتالي ، تسمح هذه العلامات بتحليل العديد من خصائص AP ، بما في ذلك INM مع انقسام الخلايا الذي يحدث بشكل قمي حول التجويف المركزي (الشكل 1D ، D') ، وكذلك وضع الانقسام الذي يتم تحديده عن طريق قياس الزاوية بين مستوى الانقسام والسطح القمي. أخيرا ، يمكن تحليل تكوين الأهداب عن طريق تلطيخ المناعة بالأجسام المضادة المرفوعة ضد PCNT ، والتي تلطخ الجسم القاعدي للكمبيوتر الشخصي ، و ARL13B الذي يلطخ الأكسونيم. على مثل هذه الهياكل الوردية ، يمتد الكمبيوتر الشخصي من القطب القمي ل APs إلى التجويف المركزي لكل منطقة تشبه البطين (الشكل 1E ، E ') ، بينما تبرز أيضا من الخلايا العصبية CTIP2 + (الشكل 1E'').

يسمح تفكك هذه الهياكل الوردية بالحصول على NSPCs معزولة مستزرعة على ألواح استزراع مغلفة بالبولي L-ornithine / laminin في NMM بكثافة عالية للسماح بالحفاظ على مجموعة مستقرة وقابلة للتوسع من NSPCs لمدة 15 ممرا على الأقل دون تراكم تشوهات النمط النووي21,27. لتحليل التخلق الحيوي للكمبيوتر الشخصي ، يتم استزراع NSPCs المنفصلة إلى التقاء وتجويعها لمدة 48 ساعة. تظهر تحليلات التلطيخ المناعي باستخدام الأجسام المضادة المرفوعة ضد علامات الكمبيوتر الشخصي أن تلك NSPCs تؤوي جهاز كمبيوتر (الشكل 2A). من خلال الجمع بين أداتين متكاملتين مفتوحتي المصدر، Ilastik، وهي أداة تحليل صور قائمة على التعلم الآلي مفيدة لتجزئة الكمبيوتر الشخصي28 و CiliaQ، حزمة المكونات الإضافية فيجي/ImageJ29، التي تمكن من إعادة بناء الكمبيوتر ثلاثي الأبعاد للكمبيوتر الشخصي من مكدسات الصور متحدة البؤرة ثلاثية الأبعاد، يمكن تقييم العديد من المعلمات الهيكلية بسهولة، بما في ذلك عدد أجهزة الكمبيوتر وطولها.

يمكن أيضا تقييم وظيفة الكمبيوتر الشخصي ل NSPCs عن طريق اختبار نقل مسار إشارات القنفذ. لتقييم نقل مسار إشارات SHH ، يتم تجويع NSPCs لمدة 48 ساعة ومعالجتها باستخدام SHH المؤتلف (rSHH) أو ناهض أملس (SAG) لمدة 24 ساعة. باستخدام الأجسام المضادة التي تم رفعها ضد GPR161 و SMO و GLI2 ، يسمح تحليل الفلورسنت المناعي (IF) باختبار الاتجار بهذه الجهات الفاعلة الرئيسية في إشارات SHH على طول جهاز الكمبيوتر ، مع خروج GPR161 عادة من جهاز الكمبيوتر بينما تتراكم GLI2 و SMO داخل جهاز الكمبيوتر استجابة لتنشيط مسار SHH (الشكل 2C-D). يسمح تحليل مكدسات الصور ثنائية البؤرة ثلاثية الأبعاد باستخدام أدوات CiliaQ بتحديد خروج GPR161 من جهاز الكمبيوتر بالإضافة إلى تراكم GLI2 و SMO داخل جهاز الكمبيوتر بعد تنشيط مسار SHH (الشكل 2F-G). بالإضافة إلى ذلك، يظهر تحليل RT-PCR شبه الكمي على الحمض النووي الريبوزي المرسال المستخرج من NSPCs المعالجة ب rSHH أو SAG تحريض اثنين من الجينات المستهدفة SHH، GLI1 و PTCH1، مما يشهد على نقل إشارات SHH الطبيعي في NSPCs المشتقة من hIPSCs الضابطة (الشكل 2B).

بشكل عام ، من الواضح أن النماذج القائمة على الخلايا 2D لتطوير الدماغ الأمامي الظهري تتكاثر بوضوح عدة جوانب من تطور القشرة الدماغية الطبيعية وتمثل أدوات واعدة لتشريح الآليات المرتبطة بالكمبيوتر الشخصي الكامنة وراء الشذوذ في تطور القشرة المخية الجديدة باستخدام التحكم مقابل hIPSCs المريض الذي يؤوي طفرات في الجينات المسؤولة عن الشذوذ التنموي البشري في القشرة الدماغية.

3D hIPS النماذج القائمة على الخلايا لدراسة مشاركة السيليوم الأولية أثناء تطوير القشرة المخية الجديدة
تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 3A) من البروتوكولات المنشورة سابقا23،24،25،26،30 وتم اختباره بنجاح على خمسة خطوط تحكم hIPSC متميزة. يسمح بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية المشتقة من hIPSC والتي يزداد حجمها بمرور الوقت مع تشكيل حلقات ظهارية عصبية كبيرة (الشكل 3B). يمكن إجراء تحليل وضع العلامات المناعية إما على أقسام التبريد العضوية (cryostat ، 20 ميكرومتر) ، أو الأقسام العائمة الحرة (الاهتزاز ، 150 ميكرومتر) ، أو في toto ، لمراقبة الجودة. في اليوم 28 ± 2 ، تتكون المواد العضوية من حلقات عصبية ظهارية طبقية تشترك في التعبير عن علامة السلف العصبي SOX2 وعلامة الدماغ الأمامي الظهرية PAX6 ، مما يدل على هوية الدماغ الأمامي الظهري. في اليوم 42 ± 2 (6 أسابيع من التمايز) ، يجب أن تعرض هذه الحلقات منظمة طبقية أكثر تعقيدا. من السطح القمي إلى السطح القاعدي لهذه الهياكل الحلقية ، يمكن تحديد منطقة تشبه منطقة البطين (VZ) مع أسلاف دبقية شعاعية قمية إيجابية SOX2 / PAX6 (aRG) بالإضافة إلى منطقة تشبه المنطقة تحت البطينية (SVZ) مع أسلاف وسيطة إيجابية TBR2 (IPs) ومنطقة تشبه الصفيحة القشرية (CP) تحتوي على خلايا عصبية حديثة الولادة إيجابية CTIP2 (الشكل 3C ، E). يمكن تقييم القطبية الجزيئية القمية ل aRG عن طريق التخصيب القمي على السطح البطيني ل ZO-1 و N-CADH (الشكل 4A ، الفيديو 1). يمكن تقييم خصائص تقسيم السلف aRG باستخدام علامات TP2X و P-VIM لتحليل INM الذي يؤدي عادة إلى محاذاة النوى الانقسامية aRG على السطح البطيني للحلقات القشرية (الشكل 4B ، الفيديو 2). يسمح هذا الوسم المناعي أيضا بقياس زاوية القسمة لتقييم وضع التقسيم المتماثل مقابل غير المتماثل ل aRG. يمكن أيضا ملاحظة أسلاف P-Vim الموجبين في المنطقة الشبيهة ب SVZ ، حيث تؤوي عملية قاعدية فريدة تمتد إلى السطح القاعدي الذي يذكرنا بالدبقية الشعاعية الخارجية (oRG أو الدبقية الشعاعية القاعدية ، الشكل 4C ، الفيديو 2). في حين أنها غائبة عن اليوم 42 من المواد العضوية ، يجب اكتشاف الخلايا العصبية الإيجابية SATB2 المتأخرة من اليوم 70 (10 أسابيع من التمايز) (الشكل 3D ، F) ، مما يدل على ذلك في توقيت يشبه الجسم الحي للتمايز العصبي القشري الجديد.

تسمح تجارب وضع العلامات المناعية باستخدام علامات الجسم القاعدي (غاما توبولين) وأكسونيم (ARL13B) بتصور الكمبيوتر الشخصي على 20 ميكرومتر من المقاطع المبردة (الشكل 3G ، H). للاستفادة من تنظيم 3D من المواد العضوية الظهرية في الدماغ الأمامي ، يمكن إجراء تلطيخ مناعي كامل. يتيح الحصول على صفائح خفيفة من هذا القبيل في المواد العضوية الملطخة بالمناعة والواضحة الكشف عن كل من الجسيمات المركزية والكمبيوتر الشخصي على جميع أنواع NSPC وكذلك على الخلايا العصبية القشرية الجديدة (فيديو 3). بالإضافة إلى ذلك ، لإجراء تحليلات أكثر دقة للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ، يمكن إجراء تحليل الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام سميكة عائمة بحرية (150 ميكرومتر) من عضويات الدماغ الأمامي الظهرية. بعد التطهير ، يمكن الحصول على هذه الأقسام باستخدام هدف زيتي 40x (NA 1.3) أو 63x (NA 1.4) لمجهر ليزر مقلوب بالضوء الأبيض الرنانة ، مما يسمح بتحسين الدقة مع الحفاظ على المعلومات المكانية ثلاثية الأبعاد للعضويات. يتيح هذا المجهر البؤري المسح الضوئي بالليزر الحصول السريع على الأقسام السميكة ، مع إثارة وكشف دقيق ومرن دون أي تدخل (فيديو 4). يمكن تقييم العديد من المعلمات الهيكلية للكمبيوتر الشخصي ، بما في ذلك رقم الكمبيوتر وطوله واتجاهه ، باستخدام برنامج التصوير 3D. تعد الأدوات المخصصة مفتوحة المصدر والمتاحة مجانا مثل Ilastik28 ، وهي أداة تحليل صور قائمة على التعلم الآلي بالإضافة إلى حزمة المكون الإضافي CiliaQ على فيجي / ImageJ29 مفيدة للغاية لتجزئة الكمبيوتر الشخصي تلقائيا مما يسمح بالتحليل النوعي والكمي اللاحق للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته في التحكم مقابل الظروف المرضية.

Figure 1
الشكل 1: توليد وتوصيف الورود العصبية ثنائية الأبعاد. التوصيف الكيميائي النسيجي المناعي لهياكل الوردة العصبية باستخدام (A) الأجسام المضادة SOX2 و PAX6 للكشف عن AP ، (B) TBR2 / EOMES للكشف عن IP ، و (C) CTIP2 لتلطيخ الخلايا العصبية القشرية الجديدة المولودة مبكرا. يتم الكشف عن AP المنتشر باستخدام الأجسام المضادة للفوسفو فيمنتين و TPX2 وتقع على السطح القمي (D ، D'). يتم الكشف عن جهاز الكمبيوتر عن طريق تلطيخ المناعة المزدوج مع الأجسام المضادة PCNT و ARL13B. يمتد الكمبيوتر الشخصي من كل نقطة وصول إلى التجويف المركزي لكل وردة ، بينما يتم اكتشافها أيضا على IP والخلايا العصبية المبكرة (E ، E ، E '''). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: NSPCs المعزولة المشتقة من الورود العصبية ثنائية الأبعاد تؤوي جهاز كمبيوتر وظيفي. يؤدي تفكك الورود العصبية ثنائية الأبعاد إلى وجود NSPCs معزولة تؤوي جهاز كمبيوتر بعد المجاعة لمدة 48 ساعة كما هو موضح في ARL13B و PCNT immunostaining (A). تحتوي NSPCs على جهاز كمبيوتر وظيفي كما هو موضح في القياس الكمي ل RT-PCR لاثنين من الجينات المستهدفة SHH GLI1 و PTCH1 بعد التجويع لمدة 48 ساعة والتنشيط اللاحق للمسار عن طريق العلاج باستخدام SHH المؤتلف (rSHH) لمدة 24 ساعة. تم تحليل البيانات باستخدام طريقة 2−ΔΔCt وتقديمها كتعبير نسبي ± SEM (اختبار مان ويتني) (B). تحليل IF على NSPCs الجائعة مع (D) أو بدون (C) rSHH العلاج لاختبار ديناميكيات اثنين من الجهات الفاعلة الحاسمة في مسار إشارات SHH ، GLI2 ، و GPR161 ، والتي تتراكم أو تخرج على التوالي من جهاز الكمبيوتر بعد تنشيط مسار SHH. من خلال الجمع بين أدوات Ilastik و CiliaQ لتحليل الصور متحدة البؤرة ، تمت مقارنة كثافة إشارة GPR161 (F) و GLI2 (G) داخل الكمبيوتر الشخصي في +/- rSHH معالجة NSPCs. تم استخدام تلطيخ ARL13B لتجزئة الكمبيوتر الشخصي ، وكما هو متوقع ، لم يتغير طول الكمبيوتر في +/- rSHH تعامل NSPCs (E). يتم تلخيص البيانات في مخططات مربعة وشعيرات (القيم المتوسطة ± SEM). ص < 0.0001 (اختبار مان ويتني). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توليد وتوصيف عضويات الدماغ الأمامي الظهرية. (أ) نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول توليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية. (ب) صور تمثيلية ذات مجال ساطع للعضويات في الأيام 1 و 3 و 7 و 24 و 42 من التمايز. صور متحدة البؤرة ل 20 ميكرومتر من المقاطع المبردة للعضويات في اليوم 42 (C) و 70 (D) بعد تلطيخ المناعة مع الأجسام المضادة SOX2 و TBR2 و CTIP2 التي تحدد ، على التوالي ، المنطقة البطينية (VZ) ، والمنطقة تحت البطينية (SVZ) التي تحتوي على TBR2 IP إيجابي ، والمنطقة الشبيهة بالصفيحة (CP) التي تحتوي على الخلايا العصبية القشرية الجديدة الإيجابية CTIP2 الإيجابية في وقت مبكر. صور متحدة البؤرة للأقسام المبردة 20 ميكرومتر من المواد العضوية في اليوم 42 (E) و 70 (F) بعد تلطيخ المناعة مع الأجسام المضادة PAX6 و CTIP2 و SATB2 تظهر ظهور الخلايا العصبية الإيجابية SATB2 المتأخرة في اليوم 70. صور متحدة البؤرة ل 20 ميكرومتر من المقاطع المبردة للعضوي في اليوم 42 بعد تلطيخ المناعة مع الأجسام المضادة ARL13B و PCNT التي تكشف عن الكمبيوتر الشخصي في القطب القمي للأسلاف الدبقية الشعاعية (G) بينما تكون موجودة أيضا على الخلايا العصبية الإيجابية CTIP2 (H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصوير ثلاثي الأبعاد للعضويات الظهرية في الدماغ الأمامي . (أ) اكتساب ورقة الضوء لكامل عضوي دماغي أمامي ظهري (اليوم 42) ملطخ بالأجسام المضادة PAX6 و N-CADH و CTIP2 التي تظهر الحلقات الظهارية العصبية المتعددة مع السلف الدبقي الشعاعي الإيجابي PAX6 الذي يظهر قطبية أبيكوباسية صحيحة كما هو موضح في تراكم N-Cadherin في جانبها القمي و CTIP2 الخلايا العصبية القشرية الجديدة الإيجابية المولودة في وقت مبكر تحدد منطقة تشبه الصفيحة. (ب) الحصول على ورقة ضوئية لكامل الجسم العضوي الظهري الأمامي (اليوم 42) ملطخ بالأجسام المضادة TPX2 و P-Vim و CTIP2 التي توضح الهجرة النووية بين الحركية للأسلاف الدبقية الشعاعية البطينية. (ج) تكبير على اكتساب ورقة الضوء لكامل الدماغ الأمامي الظهري العضوي (اليوم 42) ملطخ بالأجسام المضادة TPX2 و P-Vim التي تظهر سلفا يمتد عملية قاعدية فريدة من نوعها ومتمركزة في المنطقة تحت البطينية ، تذكرنا بالسلف الدبقي الشعاعي الخارجي. (د) الحصول على الماسح الضوئي الرنانة لقسم 150 ميكرومتر من عضوي ظهري في الدماغ الأمامي (اليوم 42) ملطخ بالأجسام المضادة PCNT و ARL13B التي تظهر الكمبيوتر الشخصي في NSPCs والخلايا العصبية القشرية الجديدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: توليد وتوصيف النماذج القائمة على الخلايا 2D و 3D hIPS لتطور الدماغ الأمامي الظهري لتشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي في الفيزيولوجيا المرضية للتشوهات القشرية الدماغية. يسمح لخلايا hIPS بتكوين أجسام جنينية (EBs) في لوحات ثقافة منخفضة الالتصاق ، ثم يتم احتضانها في وسط تحريضي يحتوي على مثبطات SMAD مزدوجة للحث على التمايز العصبي الوديكتوديرالي. يسمح التصاق EBs في الأطباق المطلية ب PO / lam بتوليد هياكل وردة عصبية 2D بينما تسمح الثقافة العائمة الحرة ل EBs مع التضمين اللاحق في BMM بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية. سحب العوامل الميتوجينيك من وسط وردة عصبية ملتصقة يعزز بداية تكوين الخلايا العصبية التي يمكن اختبارها عن طريق تحليل IF. يسمح تفكك الورود العصبية الملتصقة بتوليد ثقافات NSPC معزولة مفيدة للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي وتحليل الوظائف. يتم جمع المواد العضوية الظهرية للدماغ الأمامي بعد 4 أو 6 أو 10 أسابيع من التمايز ويتم تثبيتها لتحليل التلطيخ المناعي اللاحق إما في toto أو على أقسام بسمك 150 ميكرومتر أو 20 ميكرومتر من المقاطع المبردة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: الحصول على ورقة خفيفة من الجسم العضوي الظهري الخلفي بأكمله (اليوم 42) ملطخ بالمناعة مع الأجسام المضادة PAX6 و CTIP2 و NCADH. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو 2: الحصول على ورقة خفيفة من كامل الدماغ الأمامي الظهري العضوي (اليوم 42) ملطخة بالمناعة مع TPX2 و P-VIM و CTIP2 الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو 3: الحصول على ورقة خفيفة من كامل الجسم الأمامي الظهري (اليوم 42) ملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة PCNT و ARL13B. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 4: اكتساب بؤري للمسح الرنانة لقسم 150 ميكرومتر من جسم عضوي ظهري في الدماغ الأمامي (اليوم 42) ملطخ بالمناعة مع الأجسام المضادة ARL13B و PCNT. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الملفات التكميلية: يرجى النقر هنا لتنزيل الجداول.

الجدول التكميلي 1: وصفة الوسائط المستخدمة لتوليد الورود العصبية 2D و NSPCs.

الجدول التكميلي 2: وصفة الوسائط المستخدمة لتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعتبر الكمبيوتر الشخصي الآن عضيات رئيسية تنظم الخطوات الحاسمة أثناء التطور القشري الدماغي الطبيعي18،19،31 بما في ذلك توسيع NSPC والالتزام 8،9،10،11،12 وكذلك الهجرة العصبية13،14 وتكوين التشابك العصبي16،17 . بالإضافة إلى التحليل في النماذج الحيوانية أو الأنسجة الدماغية الجنينية البشرية ، فإن توليد نماذج مبتكرة للغاية وذات صلة بالمريض تستند إلى hIPSC لتطوير القشرة المخية الجديدة أمر ضروري لتشريح دور الكمبيوتر الشخصي أثناء كل من التطور القشري الدماغي الطبيعي والمرضي.

تم تكييف بروتوكول النمذجة القائم على hIPSC ثنائي الأبعاد المفصل هنا من ثلاثة منشورات رئيسية20،21،22. يتم تحفيز التمايز الظهاري العصبي عن طريق تثبيط SMAD المزدوج باستخدام مثبطات جزيئية صغيرة من مسارات أكتيفين / العقدية (SB-431542) و BMP (LDN-193189) 22. يتم تنظيم الخلايا في هياكل على شكل وردة تحتوي على NSPCs وكذلك الخلايا العصبية ذات الطبقة العميقة القشرية الجديدة بعد 20 يوما من التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر هذه الهياكل الشبيهة بالوردة قطبية أبيكوباسية صحيحة ، وهجرة نووية بين الحركية للأسلاف القمية بالإضافة إلى أجهزة الكمبيوتر الشخصية الممتدة من جميع NSPCs والخلايا العصبية. بعد تفكك هذه الهياكل الوردية ، يتم الحصول على مجموعة متجانسة ومستقرة من السلف القشرية 21. عندما يتم استزراعها إلى الالتقاء وتجويعها لمدة 48 ساعة ، فإن هؤلاء السلف القشرية يؤوون جهاز كمبيوتر يمكن من خلاله تحليل المورفولوجيا والعدد والطول بسهولة من خلال الجمع بين حزمة البرنامج المساعد Ilastik28 و CiliaQ28,29 على فيجي / ImageJ. علاوة على ذلك ، باستخدام السيتوكينات لتحفيز مسار إشارات SHH ، يمكن أيضا استخدام وظيفة الكمبيوتر بواسطة IF لاختبار ديناميكيات الجهات الفاعلة في مسار الإشارات الحاسمة على طول الكمبيوتر مثل GLI2 و SMO و GPR161. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح اختبارات RT-PCR شبه الكمية اختبار تحريض التعبير الجيني المستهدف SHH ، بما في ذلك GLI1 و PTCH1 ، استجابة لتنشيط مسار SHH. يجب أيضا اختبار مسارات الإشارات الأخرى التي تعتمد على وظيفة الكمبيوتر الشخصي ، بما في ذلك مسارات WNT و IGF 2,32,33. في الختام على هذا النهج النمذجة 2D ، الذي يستنسخ بوضوح عدة جوانب من تطور القشرة الدماغية الطبيعية ، فإنه يمثل أداة مفيدة وذات صلة لاختبار التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته في الظروف الطبيعية مقابل الظروف المرضية ويجب أن يساهم في اكتساب مزيد من البصيرة في مشاركة الكمبيوتر أثناء تطور القشرة المخية الجديدة.

مكملة لنهج النمذجة القائمة على 2D hIPSC ، توفر عضويات الدماغ الأمامي الظهرية فرصا غير مسبوقة للتحقيق في التطور الدماغي الطبيعي والمرضي في المختبر لأنها تلخص العديد من ميزات وخصائص القشرة الدماغية البشرية النامية المبكرة. يتم حاليا استخدام نوعين رئيسيين من البروتوكولات: الأساليب الجوهرية والطرق الموجهة. يعتمد البروتوكول الجوهري الذي طوره لانكستر وزملاؤه(23) على القدرة الجوهرية ل IPSCs على التنظيم الذاتي مع الحد الأدنى من العوامل الخارجية ويؤدي إلى عضويات دماغية تحتوي على أساسيات لمناطق دماغية متميزة توفر فرصة فريدة لنمذجة التفاعلات بين مناطق الدماغ المختلفة. بيد أن التباين الكبير وعدم التجانس المتأصلين في استراتيجية النمذجة هذه يشكلان تحديات كبيرة تتعلق بقابلية الاستنساخ. تسمح بروتوكولات التمايز العضوي الموجهة بتوليد عضويات خاصة بمنطقة الدماغ مع الحد الأدنى من عدم التجانس24،25،26. سمح لنا هذا النهج بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية بنجاح مع هياكل تشبه البطين تلخص العمليات الرئيسية للنمو القشري الدماغي البشري المبكر. القضية الحرجة الأولى هي البدء بثقافات hIPSC عالية الجودة التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة تظهر أقل من 10٪ من التمايز والتي تم تمريرها مرة واحدة تقريبا كطبقة واحدة لتكييف hIPCs مع ظروف زراعة الخلية الواحدة. في الواقع ، للحد من عدم التجانس العضوي ، أحد التحديات الرئيسية في هذا المجال ، فإن تكوين EBs بحجم متجانس هو شرط أساسي ينطوي على الحاجة إلى فصل مستعمرات hIPSC إلى تعليق أحادي الخلية يسمح بالبذر في كثافة الخلية المحددة. خطوة حاسمة أخرى هي تضمين BMM من EBs ، اللازمة لدعم بنية 3D والتوسع الظهاري العصبي. لقد فضلنا الإدراج الجماعي لحوالي خمسة عشر عضويا على التضمين الفردي حتى لو كان ينطوي على خطوة إضافية ، وهي تفكك BMM. وقد تبين أن تفكك BMM قبل زراعة الاهتزاز يقلل من التباين داخل الدفعات العضوية وفيما بينها، مما يؤدي إلى زيادة قابلية التكاثر34. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح بالتخلص من عمليات الخلايا الممتدة إلى BMM والتي لا تضر بخطوات التمايز التالية ولكنها تجعل من الصعب مراقبة المواد العضوية لفحص الجودة خلال الخطوات اللاحقة من الإجراء. لتحسين الامتصاص الغذائي وتبادل الأكسجين ، قارنا نضج العضوية على الهزازات المدارية والمفاعلات الحيوية الدوارة التي أدت إلى نتائج مماثلة. لذلك ، اخترنا خيار الاهتزاز المداري ، لأنه يسمح بتقليل الأحجام المتوسطة بشكل كبير وبالتالي التكلفة الإجمالية للتجارب. الأهم من ذلك ، استخدم حاضنة مختلفة للثقافة الثابتة والاهتزازية على شاكر مداري لتجنب أي اهتزازات ضارة بنمو hIPSC الملتصقة. لقد طبقنا هذا البروتوكول بنجاح على خمسة خطوط تحكم hIPSC متميزة35 تؤدي إلى نتائج متجانسة تضمن متانة هذا الإجراء.

يمكن تحقيق توصيف هذه المواد العضوية باستخدام عدة طرق. للحفاظ على المعلومات المكانية 3D داخل المواد العضوية ، قمنا بإعداد بروتوكول يسمح بتلطيخ المناعة الكامل وتطهير المواد العضوية بأكملها مع اكتساب ورقة الضوء اللاحقة. ظهرت طرق تطهير مختلفة بكفاءة اعتمادا على أصل العينة وسمكها36,37. هنا ، أنشأنا طريقة مسح بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة تعتمد على TDE (2,2'-thiodiethanol) ، وهو مشتق جليكول كان يستخدم سابقا لمسح دماغ الفأر والمواد العضوية المعوية38,39. تم إجراء الحصول على المواد العضوية الملطخة بالمناعة ومسحها على مجهر ورقة الضوء باستخدام هدف 20x مغمور في 80٪ TDE. بالمقارنة مع طرق الحصول على التصوير 3D الأخرى ، فإن الفحص المجهري للصفائح الضوئية ذو أهمية لعدة أسباب: الاكتساب السريع ، والاختراق الجيد ، وانخفاض التبييض الضوئي. يتيح تحسين خطوة النفاذية الوصول إلى اختراق فعال ومتجانس للأجسام المضادة مما يسمح بتصور الأجسام القاعدية ومحاور الكمبيوتر الشخصي الممتدة من جميع أنواع الخلايا السلفية والعصبية للجسم العضوي بأكمله. علاوة على ذلك ، فإن الحصول على مقاطع بسمك 150 ميكرومتر عائمة بحرية باستخدام مجهر بؤري بؤري ضوئي رنين مقلوب مع أهداف نفطية 40x (NA 1.3) أو 63x (NA 1.4) تمكن من الحصول على مزيد من الدقة ، مع الحفاظ على درجة كبيرة من المعلومات المكانية ثلاثية الأبعاد ، والسماح بالتحليل النوعي والكمي للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته.

إن الجمع بين هذه النماذج القائمة على الخلايا ثنائية وثلاثية الأبعاد وتحليل التصوير ثلاثي الأبعاد (الشكل 5) على hIPSCs الناتجة إما عن طريق إعادة برمجة خلايا مرضى اعتلال الأهداب أو باستخدام تقنية CRISPR / CAS9 لتحرير الجينات المركزية أو الهدبية على وجه التحديد يجب أن يسمح بإحراز تقدم كبير في فهم مساهمة الكمبيوتر أثناء التطور الطبيعي والمرضي للقشرة الدماغية. الأهم من ذلك ، أن تقنية تحرير الجينوم تسمح أيضا بإنقاذ طفرات المرضى على وجه التحديد للحصول على hIPSCs للتحكم متساوي المنشأ للتغلب على عدم التجانس الجيني الذي يتحدى الكشف عن آليات المرض. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم الآن النهج الجينومية أحادية الخلية على نطاق واسع في جميع أنحاء الميدان وتمثل النهج ذات الصلة والتكميلية لتحليل التلطيخ المناعي. وهكذا ، على الرغم من بعض القيود والصعوبات المتأصلة في جميع التقنيات الناشئة ، والتي يتم تناولها على نطاق واسع ، فإن هذه النماذج القائمة على hIPSC 2D و 3D وطرق التوصيف التي قدمناها هنا توفر أدوات قوية وذات صلة لتشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي في الآليات المرضية الكامنة وراء الشذوذ القشري الجديد التنموي البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح من الوكالة الوطنية للبحوث (ANR) إلى S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) و N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 و ANR-19-CE16-0002-01). يتم دعم LB من قبل ANR في إطار برنامج Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) ومؤسسة Bettencourt Schueller (برنامج MD-PhD). يتم دعم معهد Imagine بتمويل حكومي من ANR في إطار برنامج Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01 ، مشاريع CrossLab) وكجزء من برنامج Investissements d'Avenir الثاني (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 181 ، cilium الأولي ، الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان ، hIPSCs ، الخلايا الجذعية العصبية والسلف ، التطور القشري الدماغي البشري ، الورود العصبية ، الأعضاء العضوية الظهرية الأمامية ، النماذج القائمة على hIPSC 2D و 3D من تطور القشرة المخية الجديدة ، الأعضاء الدماغية ، القنفذ الصوتي ، تلطيخ المناعة الكامل ، التطهير البصري ، المجهر ورقة الضوء
2D و 3D المستحثة من قبل الإنسان نماذج الخلايا الجذعية متعددة القدرات القائمة على تشريح تورط سيليوم الأولية أثناء تطور القشرة المخية الجديدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter