Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

2D- och 3D-mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade modeller för att dissekera primärt ciliuminblandning under neokortisk utveckling

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar detaljerade protokoll för generering och karakterisering av 2D och 3D mänskliga inducerad pluripotent stamcell (hIPSC)-baserade modeller av neokortikal utveckling samt kompletterande metoder möjliggör kvalitativ och kvantitativ analys av primära cilium (PC) biogenes och funktion.

Abstract

Primära cilia (PC) är icke-motila dynamiska mikrotubule-baserade organeller som sticker ut från ytan av de flesta däggdjursceller. De kommer ut ur den äldre centriole under G1/G0-fasen av cellcykeln, medan de demonteras när cellerna återinträder i cellcykeln vid G2/M-fasgränsen. De fungerar som signalnav genom att upptäcka och omvandla extracellulära signaler som är avgörande för många cellprocesser. I likhet med de flesta celltyper har alla neokortikala neurala stam- och stamceller (NSPCs) visat sig hysa en dator så att de kan känna av och transleda specifika signaler som krävs för den normala cerebrala när utvecklingen. Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att generera och karakterisera tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) cellbaserade modeller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hIPSCs) för att ytterligare dissekera pc: s engagemang under neokortisk utveckling. I synnerhet presenterar vi protokoll för att studera PC biogenesis och funktion i 2D neural rosett-härledda NSPCs inklusive transduktion av Sonic Hedgehog (SHH) vägen. För att dra nytta av den tredimensionella (3D) organisationen av cerebrala organoider, beskriver vi en enkel metod för 3D imaging av in toto immunstained cerebrala organoider. Efter optisk clearing, snabb förvärv av hela organoider möjliggör detektion av både centrosomer och PC på neokortikala stamceller och nervceller av hela organoiden. Slutligen beskriver vi förfarandet för immunstaining och clearing av tjocka fritt flytande organoid avsnitt bevara en betydande grad av 3D rumslig information och möjliggöra den högupplösta förvärv som krävs för detaljerad kvalitativ och kvantitativ analys av PC biogenes och funktion.

Introduction

Primära cilia (PC) är mikrotubule-baserade organeller som känner av och omvandlar en mängd kemiska och mekaniska signaler från den extracellulära miljön. Pc är särskilt den centrala organellen för transduktion av igelkottsignalvägen hos ryggradsdjur1,2. Medan de flesta neurala celler länge har visats hysa en dator, har bidraget från denna organell i att forma centrala nervsystemet länge varit undervärderat. Studier på neokortikisk utveckling har lett till upptäckten av flera neurala stamceller och stamceller (NSPCs), som alla hyser en dator, vars plats har föreslagits vara avgörande för föregångarens ödesbestämning3,4,5,6,7. PC har visats avgörande för cell mekanismer som krävs för normala cerebrala när utveckling, inklusive NSPC expansion och engagemang8,9,10,11,12 samt apicobasal polaritet av radiell glia ställning stödja neuronal migration13. Dessutom krävs PC under interneurons tangentiell migrering till den närplattan14,15. Slutligen har en roll för pc föreslagits i upprättandet av synaptiska anslutningar av nervceller i hjärnbarken16,17. Sammantaget argumenterar dessa resultat för en avgörande roll av PC vid stora steg av cerebrala när utveckling18,19 och höja behovet av att undersöka deras engagemang i de patologiska mekanismerna bakom anomalier av cerebrala när utveckling.

Nyligen genomförda studier har till stor del förbättrat vår förståelse av viktiga cellulära och molekylära skillnader mellan när utveckling i mänskliga och animaliska modeller, med betoning på behovet av att utveckla mänskliga modellsystem. I detta synsätt representerar human inducerade pluripotenta stamceller (hIPSCs) ett lovande tillvägagångssätt för att studera sjukdom patogenes i ett relevant genetiskt och cellulärt sammanhang. Vidhäftande tvådimensionella (2D) cellbaserade modeller eller neurala rosetter innehåller NSPCs som liknar de som ses i den utvecklande hjärnbarken, som blir organiserade i rosettformade strukturer som visar korrekt apicobasal polaritet20,21,22. Dessutom tillåter det tredimensionella (3D) kultursystemet generering av dorsala förhjärnorganoider som rekapitulerar många funktioner i människans cerebrala när utveckling23,24,25,26. Dessa två kompletterande cellbaserade modelleringsmetoder erbjuder spännande perspektiv för att dissekera engagemanget av PC under normal och patologisk utveckling av hjärnbarken.

Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för generering och karakterisering av neurala rosetter och härledda NSPCs samt dorsala forebrain organoider. Vi tillhandahåller också detaljerade protokoll för att analysera biogenes och funktion av PC som finns på NSPCs genom att testa transduktionen av Sonic Hedgehog utbildningsavsnittet och analysera dynamiken hos viktiga molekyler som är involverade i denna väg. För att dra nytta av 3D-organisationen av cerebrala organoider, inrättade vi också en enkel och kostnadseffektiv metod för 3D-avbildning av in toto immunstained cerebrala organoider som möjliggör snabbt förvärv, tack vare ett ljusplåtmikroskop, av hela organoiden, med hög upplösning som gör det möjligt att visualisera PC på alla typer av neokortikala stamceller och neuroner i hela organoiden. Slutligen anpassade vi immunohistochemistry på 150 μm fritt flytande sektioner med efterföljande clearing och förvärv med hjälp av resonans skanning konfokal mikroskop möjliggör högupplöst bild förvärv, vilket krävs för detaljerad analys av PC biogenes och funktion. Specifikt tillåter 3D-imaging programvara 3D-rekonstruktion av PC med efterföljande analys av morfologiska parametrar inklusive längd, antal och orientering av PC samt signalintensitet mätning av ciliary komponenter längs axoneme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering av 2D hIPS-cellbaserade modeller av neokortisk utveckling

  1. Neural rosettbildning
    1. Börja med hIPSC-kulturer som hyser stora regelbundna kolonier, uppvisar mindre än 10% differentiering och högst 80% sammanflöde.
    2. Skölj hIPSCs med 2 ml PBS.
    3. Tillsätt 2 ml NSPC-induktionsmedium kompletterat med berghämmaren (NIM + 10 μM Y-27632).
    4. Dissekera varje hIPSC-koloni manuellt från en 35 mm skål med hjälp av en nål för att skära varje koloni exakt i horisontella och vertikala riktningar för att skapa ett rutmönster som delar varje koloni i lika stora kluster.
    5. Lossa kolonin med en cellskrap och överför dem till en ultralågtillsats 35 mm skål.
    6. Låt dem flyta över natten (ON) i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2, så att de kan bilda embryoida kroppar (EBs).
      OBS: Embryoidkroppar definieras som flytande sfäroidkluster eller aggregat av hIPSCs.
    7. Överför EB:erna till poly-L-ornitin/laminin (PO/lam)-belagda 35 mm rätter i 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Daglig uppdatering NSPC induktionsmedium (NIM utan Y-27632) tills bildandet av neurala rosetter som tar cirka 12 till 14 dagar. Kolla under mikroskopet.
      OBS: Efter detta steg neurala rosetter kan expanderas, differentieras och bearbetas för immunostaining analys eller dissocieras för att få isolerade neurala stam och stamceller (NSPCs).
  2. Neural rosettexpansion och tidig differentiering
    1. Skär neurala rosetter i ett rutnätsliknande mönster med en nål och lossa klustren med hjälp av en cellskrapor.
    2. Överför rosetterna till en 4-brunnsplatta som innehåller PO/lam-belagt glasöverdrag (4-5 rosetter/brunn) i 0,5 ml NSPC-underhållsmedium (NMM).
    3. Inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
    4. Uppdatera NMM varannan dag fram till dag 20.
    5. Från dag 20, kultur neurala rosetter i 0,5 mL cytokin utarmade NMM för att tillåta differentiering. Uppdatera mediet var 2-3 dagar.
    6. Vid dag 30 och dag 40 (10 eller 20 dagars differentiering), fixera rosetterna med 0,5 ml 4% PFA, 20 min, RT.
  3. PC-biogenes och funktionsanalys på isolerade NSPCs
    1. NSPC-dissociation
      1. Skär neurala rosetter från steg 1.1.8 i ett rutnätsliknande mönster med en nål och lossa klustren med hjälp av en cellskrapor. Överför cellerna till PO/lam-belagda 35 mm rätter i 2 ml NMM och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
      2. Uppdatera NMM varannan dag tills sammanflödet (cirka 5-7 dagar).
      3. Efter att ha skrapat bort de stora, tydliga cellerna som omger neurala rosetter, plocka dem manuellt och överför dem till färska PO / lam-belagda 35 mm rätter för att berika för NSPCs och tömma icke-neurala celltyper.
      4. Efter en eller två manuella passager (upprepa steg 1.3.1.3 om det behövs) som krävs för att avlägsna alla förorenande celltyper, ta bort mediet och skölj med PBS.
      5. Tillsätt 300 μL trypsin på 0,05 % och inkubera i 5 minuter vid 37 °C tills de flesta celler lossnar.
      6. Tillsätt 2 ml av mediet som innehåller 10% FBS (DMEM + 10% FBS) för att inaktivera trypsin. Samla cellfjädringen i ett koniskt rör på 15 ml. Rör försiktigt cellupphängningen upp och ner tre gånger för att bryta upp cellklumparna.
      7. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
      8. Aspirera försiktigt supernatanten och återanvänd cellerna i NMN.
      9. Så de dissocierade NSPCs som enstaka celler (1 x 105 celler/cm2) i NMM på PO/lam-belagda rätter och inkubera dem i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
      10. Expandera NSPCs i NMM genom att byta medium varannan dag.
        OBS: NSPCs sås med hög densitet för att undvika differentiering.
    2. PC biogenesis analys
      1. Frö dissocierade NSPCs vid 100 000 celler/cm2 och inkubera dem i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2 i NMM i 2 dagar.
      2. Aspirera på mediet och svälta NSPCs i cytokin utarmat medium (NSPC svältmedium, kompletterande tabell 1) för 48 h.
      3. Fixa NSPCs med 4% PFA i 20 min på RT.
      4. Tvätta två gånger med PBS i 5 min på RT innan du immunstainerar.
    3. PC-funktionsanalys: SHH-signalväg
      1. Frö dissocierade NSPCs vid 100 000 celler/cm2 på PO/lam-belagda 8-brunns kammarrutschbanor (300 μL) eller T25-rätter (5 ml) och inkuberas i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2 i NMM i 2 dagar.
      2. Svält NSPCs i NSPC svältmedium (300 μL per brunn av 8-brunnskammarerutschbana och 5 ml i T25-kolv) i 48 timmar.
      3. För att inducera SHH-vägen, inkubera NSPCs med svältmediet kompletterat med rekombinant SHH (100 ng/mL) eller SAG (500 nM); (150 μL per brunn i en 8-brunnskammarerutschbana och 2 ml i T25-kolv) i 24 timmar.
      4. Fix NSPCs odlade på 8-brunns kammarrutschbanor i 250 μL 4% PFA per brunn i 20 min vid RT och tvätta dem två gånger med 250 μL PBS i 5 min vid RT före immunostaining analys.
      5. Ta bort mediet och tvätta NSPCs odlade i T25-rätter med PBS.
      6. Tillsätt 500 μL trypsin på 0,05 % och inkubera i 5 minuter vid 37 °C tills cellerna lossnar.
      7. Tillsätt 2 ml medium som innehåller 10% FBS (DMEM + 10% FBS) för att inaktivera trypsin och samla cellfjädringen i ett 15 ml koniskt rör.
      8. Centrifugera vid 300 x g i 5 min och aspirera försiktigt supernatanten för att erhålla NSPC-pellets som kan kryopreserveras vid -80 °C före RNA-extraktion och RT-PCR-analys.

2. Generering av dorsala förhjärnorganoider

  1. Encellskultur av hIPSCs
    1. Börja med hIPSC-kulturer som hyser stora regelbundna kolonier som uppvisar mindre än 10% differentiering och som har passagets nästan en gång. Se till att cellerna inte är mer än 80% sammanflöde.
    2. Tvätta kolonierna med 2 ml PBS.
    3. Tillsätt 500 μL gentlecellsdesociationsreagens (GCDR) och inkubera i 5 till 7 minuter vid 37 °C.
    4. Aspirera GCDR och tillsätt 2 ml mTeRS1 medium kompletterat med 5 μM Y-27632.
    5. Pipettera cellerna försiktigt upp och ner 10 gånger för att separera alla kolonier till enstaka celler.
    6. Överför cellerna på vitronectinbelagda rätter och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
      OBS: Utför minst 1 passage av hIPSCs med hjälp av GCDR före differentieringsexperimentet för att anpassa hIPSCs till encelliga odlingsförhållanden.
  2. På dag 0, låt hIPSCs bilda embryonala kroppar i EB medium som innehåller en låg koncentration av FGF2 och en hög koncentration av berghämmare som krävs för hIPSC överlevnad. För att göra det följ stegen nedan.
    1. Tvätta kolonierna med 2 ml PBS.
    2. Tillsätt 500 μL gentlecellsdesociationsreagens (GCDR) och inkubera i 5 till 7 minuter vid 37 °C.
    3. Aspirera GCDR och tillsätt 1 ml EB-medium kompletterat med 50 μM Y-27632; Använd en 1 mL pipetter för att försiktigt lossa cellerna och överföra dem till ett koniskt rör på 15 ml.
    4. Skölj en gång till med 2 ml EB-medium kompletterat med 50 μM Y-27632, överför de återstående cellerna till det koniska röret på 15 ml. Tillsätt omedelbart 3 ml EB-medium kompletterat med 50 μM Y-27632 till koniska röret och homogenisera försiktigt lösningen med en 5 ml-pipett.
    5. Centrifugera de dissocierade cellerna vid 100 x g i 5 min.
    6. Aspirera försiktigt supernatanten och återanvända cellerna i 6 ml EB-medium kompletterat med 50 μM Y-27632.
    7. Centrifugera cellerna vid 100 x g i 5 min.
    8. Aspirera supernatanten och återanvända cellerna i 1 ml EB-medium kompletterat med 50 μM Y-27632. Använd en 1 mL pipett för att försiktigt separera cellerna till en encellsupphängning.
    9. Omedelbart efter att cellerna har spenderats, späd och räkna dem.
    10. Späd ut rätt volym cellfjädring (innehållande 900 000 celler) till 30 ml EB-medium kompletterat med 50 μM Y-27632 och 4 ng/ml bFGF och blanda försiktigt lösningen.
    11. Platta 9 000 celler/brunn i en ultralåg fastsättning 96U-platta (300 μL/brunn). För att undvika störande EB-formation, inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2 fram till dag 3 utan medelförändring.
  3. Neural induktion (dubbel SMAD-hämning)
    1. På dag 3, se till att EBs mäter 300-400 μm och visar regelbundna gränser. Om båda kriterierna uppnås, ersätt hälften av mediet (150 μL) med induktionsmedium-1 som innehåller dubbla SMAD-hämmare, vilket leder till att KONTUREN av EBs lyser upp dag 6 till dag 7, vilket indikerar neuroectodermal differentiering (kompletterande tabell 2).
    2. På dag 4, ersätt 3/4 av mediet (225 μL) med induktionsmedium-1.
    3. Dag 6 och dag 8: Uppdatera hälften av induktionsmediet-1 (150 μL).
  4. Organoid inbäddad i källarmembranmatris (Dag 10)
    1. På dag 10 bäddar du in EBs i tillväxtfaktor reducerad källarmembranmatris (BMM).
      OBS: Från detta steg, använd alltid steril sax för att skära öppningen av pipettens spetsar för att undvika att skada organoiderna genom upprepad pipettering.
    2. Överför först cirka 15-17 organoider i koniska rör. Låt EBs lösa och ta bort mediet. Tillsätt 50 μL induktionsmedium-2 och överför dem till ett mikrocentrifugerör som innehåller 100 μL BMM.
    3. Sprid matris-EB-blandningen på mitten av en brunn på en ultralågtillsättningsplatta och separera EBs för att förhindra att de smälter.
    4. Låt BMM stelna i inkubatorn vid 37 °C i 45 min.
    5. Tillsätt 3 ml induktionsmedium-2 i varje brunn och lägg plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2.
      OBS: Se till att denna procedur görs så snabbt som möjligt så att BMM stelnar vid rumstemperatur.
  5. Stationär kultur av organoider inbäddad i källarmembranmatris
    1. Dag 12, 14: Uppdatera induktionsmediet-2.
    2. Dag 16: Uppdatera induktionsmediet-2 och kontrollera under ett mikroskop expansionen av neuroepithelial loopar.
  6. Källarmembranmatris dissociation och kultur på en orbital shaker
    1. På dag 17, dissociera organoider från BMM genom pipettering upp och ner 10 gånger med en 5 mL pipett och överföra dem till differentiering medium-1 (utan vitamin A). Inkubera på en orbital shaker vid 80 rpm i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5% CO2 för att förbättra näringsupptaget.
      OBS: Använd en annan inkubator för stationär kultur och kultur på en orbital shaker för att undvika vibrationer som skadar vidhäftande hIPS-celltillväxt.
    2. Dag 19: Uppdatera differentiering medium-1.
    3. Dag 21: Ändra differentiering medium-1 till differentiering medium-2 (med vitamin A).
    4. Från dag 23 till dag 35: Uppdatera medium med differentiering medium-2 var 2-3 dagar.
    5. Från dag 35 till dag 70: Uppdatera differentiering medium-2 med 1% BMM och uppdatera var 2-3 dagar.
    6. Samla organoiderna efter 28, 42 och 70 +/- 2 dagars differentiering och fixera dem över natten vid 4 °C, i 5 ml 4% PFA på ett koniskt rör på 15 ml.
    7. För vidare in toto eller fritt flytande immunstaining analys sköljs sedan organoider två gånger i PBS och bevaras vid 4 °C i PBS + 0,05% natriumazid.
    8. För immunostaining analys på frysta sektioner, nedsänk 4% PFA fasta organoider i 10 mL 30% sackaros vid +4 °C ON (eller tills organoider sjunker). Bädda in dem i en frusen inbäddningsmatris och förvara vid -80 °C tills kryosektionen.

3. Vid immunmärkning , röjning och ljusbladsförvärv av dorsala forebrainorganoider

  1. Fixering
    1. Samla organoiderna i 6-brunnsplattor, ta bort mediet och fixera dem med 2 ml 4% PFA, vid 4 °C, över natten.
    2. Utför tre tvättar i 2 ml PBS vid rumstemperatur.
    3. Överför organoiderna till 2 ml-rör och förvara vid 4 °C i 2 ml PBS + 0,05% natriumazid.
  2. Permeabilisering
    1. Inkubera organoider i 1 ml PBS innehållande 0,2% Triton X100 vid RT i 1 timme. Gör det här två gånger.
    2. Inkubera i 1 ml PBS innehållande 0,2% Triton X100 och 20% DMSO, vid 37 °C, över natten.
    3. Inkubera i 1 ml PBS innehållande 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Deoxycholate, 0,1% NP40 och 20% DMSO, vid 37 °C, över natten.
    4. Inkubera i 1 ml PBS innehållande 0,2% Triton-X100, vid RT, i 1 timme. Gör det här två gånger.
  3. Blockering och immunmärkning
    1. Blockera i 1 ml blockeringslösning (PBS, 0,2% Triton X100, 6% åsneserum, 10% DMSO), vid 37 °C, PÅ.
    2. Inkubera med primära antikroppar utspädda i 250 μL PBS, 0,2% Interpolering20, 0,1 μg/ml Heparin, 5% DMSO och 3% åsneserum, vid 37 °C, i 2 dagar.
    3. Tvätta i 1 ml PBS innehållande 0,2% Interpolering20 och 0,1 μg/ml Heparin, i 1 tim vid 37 °C. Gör det här fyra gånger.
    4. Tvätta i 1 ml PBS innehållande 0,2% Interpolering20 och 0,1 μg/ml Heparin, över natten, vid 37 °C.
    5. Inkubera med sekundära antikroppar utspädda i 250 μL PBS innehållande 0, 2% Interpolering 20, 0, 1 μg/ml Heparin och 3% åsneserum vid 37 °C i 2 dagar.
    6. Tvätta i 1 ml PBS innehållande 0,2% Interpolering 20 och 0,1 μg/ml Heparin, i 1 tim, på ett hjul, vid RT. Gör det här fyra gånger.
    7. Tvätta i 1 ml PBS innehållande 0,2% Interpolering 20 och 0,1 μg/ml Heparin, över natten, på ett hjul, vid RT.
    8. Tvätta i 1 ml PBS, i 24 timmar, på RT.
    9. Lager vid +4 °C i 1 ml PBS och 0,05% natriumazid tills det röjs.
  4. Clearing i TDE (2,2′ -Tiodiethanol)
    1. Inkubera organoiderna i 1 ml 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS), i 24 timmar, vid RT.
    2. Inkubera i 1 ml 60% TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS), i 24 timmar, vid RT.
    3. Inkubera i 1 ml 80% TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS), i 24 timmar, vid RT.
  5. Organoidinbäddning före ljusplåtsförvärv
    OBS: Använd ett skräddarsytt system; med en 1 ml spruta med spetsen skuren med en skalpell.
    1. Förbered 100 ml 4% lågsmältande agarose i 60% TDE-lösning och alikvot i 2 ml-rör. Spara vid +4 °C.
    2. Före den organiska inbäddningen, förvärm ett rör som innehåller 1,5 ml 4% lågsmältande agaros i 60% TDE i ett vattenbad vid 37 °C tills det kondenserar.
    3. Under tiden förbered ett skräddarsytt formsystem tillverkat av en 1 ml spruta vars spets är avskuren med en skalpell.
    4. Pumpa in sprutan 600 μL av gellösningen med kolven.
    5. Placera provet med hjälp av en förstorad pipettspets vars öppning har skurits med steril sax.
    6. Fyll i sprutan med 400 μL gellösning så att provet placeras inom den nedre tredjedelen av sprutan.
    7. Låt gelen polymerisera och förvara i 80% TDE-lösning vid 4 °C skyddad från ljus till förvärv.
    8. För anskaffning av ljusplåt, använd ett 20x-mål nedsänkt i 80% TDE-lösning som lagts till i provkammaren för att göra det möjligt att exakt anpassa sig till brytningsindexet för clearingmetoden.
    9. Sätt in sprutan som innehåller agarosinbäddade organoiden i den största provhållaren som är utformad för att rymma en 1 ml spruta vars kolv kan manövreras för att placera organoiden framför målet.
      OBS: Ljusplåtsförvärv av en hel organoid tar cirka 5 till 10 min.

4. Immunstaining och röjning av fritt flytande sektioner av dorsala forebrainorganoider

  1. Fixering, agarosinbäddning och sektionering av organoiderna
    1. Samla organoider efter 28, 42 och 70 +/- 2 dagars differentiering i en 6-brunnsplatta och fixera över natten vid 4 °C i 2 ml 4% PFA.
    2. Skölj två gånger i 2 ml PBS och bevara vid 4 °C i 2 ml PBS + 0,05% natriumazid.
    3. Bädda in de fasta organoiderna i 4% lågsmältande agaros i en plastinbäddningsform (7 x 7 mm). Ta försiktigt bort agarosblocket från plastformen och limma den till vibratomstadiet.
    4. Dela upp de inbäddade organoiderna med en vibratom för att erhålla 150 μm fritt flytande sektioner som överförs i en brunn på en 24-brunnsplatta som innehåller 500 μL PBS med hjälp av en pensel för att undvika att skada sektionerna.
      OBS: Lågsmältande agaros rekommenderas eftersom dess smälttemperatur endast är cirka 60 °C. Förbered 4% lågsmältande agaros i PBS-lösning och låt den svalna strax över 37 °C i ett vattenbad innan organoidinbäddning.
  2. Permeabilisering, blockering och immunstainering
    1. Inkubera sektionerna i 500 μL PBS innehållande 0,3% Triton X100, vid RT, under omrörning, i 20 min. Gör det här tre gånger.
    2. Inkubera sektionerna i 500 μL PBS innehållande 0,3% Triton X100 och 5% fettfri mjölk, vid RT, under agitation, i 2 timmar.
    3. Inkubera sektionerna i 250 μL primär antikroppslösning (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% fettfri mjölk), under omrörning, vid +4 °C, över natten.
    4. Tvätta sektionerna i 500 μL PBS, vid RT, under omrörning, i 20 min. Gör det här fyra gånger.
    5. Inkubera sektionerna i 250 μL sekundär antikroppslösning (PBS + 0, 3% Triton X100 + 1% fettfri mjölk), vid RT, under agitation, i 2 timmar.
    6. Tvätta sektionerna i 500 μL PBS, vid RT, under omrörning, i 20 min. Gör det här fyra gånger.
    7. Förvara sektionerna i 500 μL PBS vid +4 °C tills de är klara.
  3. Clearing i TDE (2,2′ -Tiodiethanol)
    1. Inkubera sektionerna i 500 μL på 30% och 60% TDE i 1 h vardera vid RT, och sedan i 500 μL av 80% TDE över natten, vid RT.
    2. Förvara de rensade sektionerna i 500 μL på 80% TDE tills de förvärvas vid +4 °C.
  4. Montering av fritt flytande sektioner före förvärv med resonans skanning confocal
    1. Montera en fritt flytande sektion i en förseglad kammare som gör det möjligt att behålla provet i 80% TDE-lösning och utformad för att anpassa sig på ett motoriserat XY-steg av konfokala mikroskop.
    2. Lägg ett runt täckslip i kammarsystemet.
    3. Överför försiktigt den rensade immunstained sektionen med en pensel.
    4. Fyll kammaren med 80% TDE-lösning.
    5. Lägg till två standardöverdrag plus ett andra runt täckslip och en silikontätning.
    6. Skruva på kammarens skruvring för att perfekt försegla systemet.

5. Ljusplåt och resonans skanning konfokal analys

  1. Bearbeta ljusplåt och resonansskanningsförvärv med hjälp av programvara som möjliggör 3D-visualisering och analys av hela det immunstained provet.
    OBS: Sådan programvara gör det möjligt att snabbt öppna enorma data för att enkelt göra ögonblicksbilder och animationer. Det gör det möjligt att flytta provet i olika riktningar och generera 2D-vyer tack vare ett 2D-utsnittsverktyg i olika riktningar, XY och YZ till exempel.
  2. För automatisk detektering av både centrosomer och primära cilier, använd en punktguide som gör det möjligt att kvantifiera deras antal under patologiska kontra kontrollförhållanden.
  3. För 3D-rekonstruktion av PC som möjliggör exakt mätning av deras längd, använd en filamentguide för att manuellt fixa datorns startpunkt och programvaran använder fluorescenssignalen för att rekonstruera datorn exakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2D hIPS cellbaserade modeller för att studera primär cilium biogenes och funktion
Protokollet som beskrivs här har anpassats från tidigare publicerade studier20,21,22. Detta protokoll tillåter generering av neurala rosettstrukturer som innehåller neokortikala stamceller och nervceller som liknar de som ses i den utvecklande neocortex. Detaljerad validering kan utföras genom konventionell immunstaininganalys med hjälp av specifika tillverkare3. Till exempel bör apikala stamceller (AP) dubbelfläckas med SOX2 och PAX6, mellanliggande stamceller (IP) avslöjas av TBR2/EOMES färgning och tidigfödda neokortikala nervceller avslöjas av CTIP2 färgning (figur 1A-C). Sådana neurala rosettliknande strukturer modellerar interkinetisk nukleär migration (INM) av AP som kan visualiseras genom immunstaining med antikroppar upplyfta mot fosfo-vimentin, som fläckar mitotiska atomkärnor och TPX2 som fläckar den mitotiska spindeln. Dessa markörer gör det därför möjligt att analysera flera egenskaper hos AP, inklusive INM med celldelning, att ske apiskt runt den centrala lumen (figur 1D,D'), liksom det delningsläge som bestäms genom att mäta vinkeln mellan delningsplanet och den apikala ytan. Slutligen kan ciliogenesis analyseras genom immunstaining med antikroppar uppfödda mot PCNT, som fläckar den basala kroppen av PC, och ARL13B som fläckar axonemen. På sådana rosettstrukturer sträcker sig PC från apical polen av APs till den centrala lumen i varje ventrikelliknande region (figur 1E, E'), medan de också sticker ut från CTIP2 + nervceller (figur 1E'' ).

Dissociation av dessa rosett strukturer gör det möjligt att erhålla isolerade NSPCs odlade på poly-L-ornitin/laminin-belagda odlingsplattor i NMM med hög densitet för att möjliggöra underhåll av en stabil och expanderbar population av NSPCs för minst 15 passager utan att ackumulera karyotyp avvikelser21,27. För att analysera PC biogenesis odlas dissocierade NSPCs för att sammanflöde och svälter i 48 h. Immunostaining analyser med hjälp av antikroppar som höjts mot PC markörer visar att dessa NSPCs hyser PC (figur 2A). Genom att kombinera två kompletterande verktyg med öppen källkod, Ilastik, ett maskininlärningsbaserat bildanalysverktyg användbart för PC-segmentering28 och CiliaQ, ett Fiji / ImageJ-pluginpaket29, som möjliggör 3D-rekonstruktion av PC från 3D-konfokala bildstackar, kan flera strukturella parametrar enkelt utvärderas, inklusive antalet PC och deras längd.

PC-funktionen hos NSPCs kan också utvärderas genom att testa flyttning av Hedgehog-signalvägen. För att bedöma transduktionen av SHH-signalvägen svälter NSPCs i 48 timmar och behandlas med rekombinant SHH (rSHH) eller en utjämnad agonist (SAG) i 24 timmar. Med hjälp av antikroppar som höjts mot GPR161, SMO och GLI2, immunofluorescent (IF) analys gör det möjligt att testa handeln med dessa viktiga SHH-signalering aktörer längs datorn, med GPR161 normalt lämnar datorn medan GLI2 och SMO ackumuleras inom datorn som svar på SHH utbildningsaktivering (figur 2C-D). Analys av 3D-konfokala bildstaplar med CiliaQ-verktyg gör det möjligt att kvantifiera GPR161-utgång från datorn samt GLI2- och SMO-ackumulering inom datorn efter AKTIVERING AV SHH-vägar (figur 2F-G). Dessutom visar semi-kvantitativ RT-PCR-analys på mRNA extraherad från rSHH- eller SAG-behandlade NSPCs induktion av två SHH-målgener, GLI1 och PTCH1, vilket intygar för normal SHH-signaltransduktion i NSPCs som härrör från kontroll hIPSCs (figur 2B).

Sammantaget reproducerar 2D cell-baserade modeller av att utveckla dorsala forebrain tydligt flera aspekter av normala hjärnbarken utveckling och representerar lovande verktyg för att dissekera PC-associerade mekanismer underliggande anomalier av neokortikal utveckling med hjälp av kontroll kontra patientens hIPSCs som hyser mutationer i gener som ansvarar för mänskliga utvecklingsmässiga anomalier i hjärnbarken.

3D hIPS cellbaserade modeller för att studera primärt ciliuminblandning under neokortikal utveckling
Protokollet som beskrivs här (figur 3A) har anpassats från tidigare publicerade protokoll23,24,25,26,30 och framgångsrikt testats på fem distinkta kontroll hIPSC-linjer. Det tillåter generering av hIPSC-härledda dorsala forebrain organoider som ökar i storlek över tiden samtidigt som de bildar stora neuroepithelial slingor (figur 3B). Immunolabeling analys antingen på organoid cryosections (cryostat, 20 μm), fritt flytande sektioner (vibratom, 150 μm), eller in toto, kan utföras för kvalitetskontroll. Dag 28 ± 2 består organoider av stratifierade neuroepithelial slingor co-uttrycker neurala stamceller markören SOX2 och dorsala förhjärna markör PAX6, intyga för dorsala förhjärna identitet. På dag 42 ± 2 (6 veckors differentiering) bör dessa slingor visa en mer komplex stratifierad organisation. Från den apikala till den basala ytan av dessa slingstrukturer kan en ventrikulär zon (VZ)-liknande region med SOX2/PAX6-positiva apikala radiella glia stamceller (aRG) avgränsas samt en subventrikulär zon (SVZ)-liknande region med TBR2-positiva mellanliggande stamceller (IPs) och en kortikalplatta (CP)-liknande region som innehåller CTIP2-positiva neocortical neuroner (Figur 3- E). ARG:s apikala molekylära polaritet kan utvärderas genom den apikala berikningen vid ventrikulära ytan av ZO-1 och N-CADH (figur 4A, video 1). ARG-stamcellerna kan utvärderas med hjälp av TP2X- och P-VIM-markörer för att analysera INM som normalt leder till justering av aRG mitotiska kärnor vid den ventrikulära ytan av närslingorna (figur 4B, video 2). Sådan immunolabeling gör det också möjligt att mäta delningsvinkeln för att utvärdera symmetrisk kontra asymmetriskt delningsläge för aRG. P-Vim positiva stamceller kan också observeras i SVZ-liknande regionen, med en unik basal process som sträcker sig till den basala ytan som påminner om yttre radiell glia (oRG eller basal radiell glia, figur 4C, video 2). Medan de är frånvarande från dag 42 organoider, SATB2 positiva senfödda nervceller bör detekteras från dag 70 (10 veckor av differentiering) (figur 3D, F), intyga för in vivo-liknande timing av neokortikala neuronal differentiering.

Immunolabeling experiment med hjälp av basalkroppen (gamma Tubulin) och axoneme (ARL13B) markörer möjliggör visualisering av PC på 20 μm cryosections (figur 3G, H). För att dra nytta av 3D-organisationen av dorsala förhjärnorganoider kan hela monteringen immunstaining utföras. Ljusplåt förvärv av sådana in toto immunstained och rensade organoider möjliggör detektion av både centrosomer och PC på alla NSPC typer samt på neokortikala nervceller (Video 3). För att utföra mer exakta analyser av PC biogenes, immunohistochemistry analys på fritt flytande tjocka sektioner (150 μm) av dorsala forebrain organoider kan utföras. Efter röjning kan sådana sektioner förvärvas med hjälp av ett oljemål på 40x (NA 1.3) eller 63x (NA 1.4) av ett inverterat resonant vitt ljuskonfokalt lasermikroskop, vilket gör det möjligt att förbättra upplösningen samtidigt som 3D-rumslig information om organoider bevaras. Ett sådant konfokalt mikroskop för laserskanning möjliggör snabbt förvärv av tjocka sektioner, med en exakt och flexibel excitation och detektering utan störningar (Video 4). Flera strukturella parametrar för pc kan utvärderas, inklusive PC-nummer, längd och orientering, med hjälp av 3D-bildbehandlingsprogram. Dedikerade verktyg med öppen källkod, fritt tillgängliga som Ilastik28, ett maskininlärningsbaserat bildanalysverktyg samt CiliaQ-pluginpaketet på Fiji / ImageJ29 är mycket användbara för automatisk PC-segmentering som möjliggör efterföljande kvalitativ och kvantitativ analys av PC-biogenes och funktion i kontroll kontra patologiska förhållanden.

Figure 1
Bild 1: Generering och karakterisering av 2D-neurala rosetter. Immunohistochemical karakterisering av neurala rosett strukturer med (A) SOX2 och PAX6 antikroppar för att upptäcka AP, (B) TBR2/EOMES att avslöja IP och (C) CTIP2 att fläcka tidigt födda neocortical nervceller. Prolifererande AP detekteras med fospho-vimentin och TPX2 antikroppar och ligger på den apikala ytan (D,D'). PC avslöjas av dubbel immunostaining med PCNT och ARL13B antikroppar. PC sträcker sig från varje AP till den centrala lumen i varje rosett, medan de också detekteras på IP och tidigfödda nervceller (E,E',E''). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Isolerade NSPCs som härrör från 2D neurala rosetter har funktionell PC. Dissociation av 2D-neurala rosetter ger upphov till isolerade NSPCs som hyser PC efter svält i 48 h som avslöjas av ARL13B och PCNT immunostaining (A). NSPCs hamn funktionella PC som framgår av RT-PCR kvantifiering av två SHH mål gener GLI1 och PTCH1 efter svält i 48 h och efterföljande aktivering av vägen genom behandling med rekombinant SHH (rSHH) för 24 h. GLI1 och PTCH1 uttryck data utfördes i tre exemplar och normaliserades till ACTB uttryck data. Data analyserades med 2−ΔΔCt metoden och presenteras som relativa uttryck ± SEM (Mann Whitney test) (B). OM analys av svälta NSPCs med (D) eller utan (C) rSHH behandling för att testa dynamiken hos två viktiga aktörer i SHH signalvägen, GLI2 och GPR161, som ackumuleras eller lämnar datorn efter SHH utbildnings aktivering. Genom att kombinera Ilastik- och CiliaQ-verktyg för analys av konfokala bilder, GPR161 (F) och GLI2 (G) signalintensitet inom PC jämfördes i +/- rSHH behandlade NSPCs. ARL13B färgning användes för PC segmentering, och som förväntat PC längd var oförändrad i +/- rSHH behandlade NSPCs (E). Data sammanfattas i ruta och morrhårsdiagram (medelvärden ± SEM). p < 0,0001 (Mann Whitney-test). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Generering och karakterisering av dorsala förhjärnorganoider. (A) Schematisk översikt över protokollet för att generera dorsala forebrainorganoider. B) Representativa ljusfältsbilder av organoider vid dag 1, 3, 7, 24 och 42 av differentiering. Konfokal bilder av 20 μm cryosections av organoider dag 42 (C) och 70 (D) efter immunostaining med SOX2, TBR2 och CTIP2 antikroppar avgränsar ventrikulär zon (VZ), subventrikulära zonen (SVZ) som innehåller TBR2 positiva IP och preplate-liknande regionen (CP) som innehåller CTIP2 positiva neocortical nervceller. Konfokala bilder av 20 μm kryosektioner av organoider dag 42 (E) och 70 (F) efter immunstaining med PAX6, CTIP2 och SATB2 antikroppar som visar utseendet på SATB2 positiva senfödda nervceller på dag 70. Konfokala bilder av 20 μm kryosektioner av en organoid dag 42 efter immunstaining med ARL13B och PCNT antikroppar avslöjar PC vid den apikala polen av radiell glia stamceller (G) medan de också finns på CTIP2 positiva nervceller (H). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: 3D-avbildning av dorsala forebrainorganoider. (A) Ljus ark förvärv av en hel dorsal forebrain organoid (dag 42) färgade med PAX6, N-CADH och CTIP2 antikroppar visar flera neuroepithelial slingor med PAX6 positiva radiell glia stamceller uppvisar korrekt apicobasal polaritet som framgår av ackumulering av N-Cadherin vid deras apikala sida. (B) Ljusplåt förvärv av en hel dorsala forebrain organoid (dag 42) färgade med TPX2, P-Vim och CTIP2 antikroppar illustrerar interkinetic nukleära migration av ventrikulära radiell glia stamceller. (C) Zooma på ljusplåtsförvärvet av en hel dorsala förhjärnorganoid (dag 42) fläckad med TPX2- och P-Vim-antikroppar som visar en stamfader som förlänger en unik basal process och lokaliseras i subventrikulär zon, som påminner om en yttre radiell glia stamfader. (D) Resonant Scanner förvärv av en 150 μm sektion av en dorsal forebrain organoid (dag 42) färgade med PCNT och ARL13B antikroppar som visar PC i NSPCs och neokortikala nervceller. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Generering och karakterisering av 2D och 3D hIPS cellbaserade modeller av dorsala forebrain utveckling för att dissekera PC engagemang till patofysiologi av cerebrala när anomalier. hIPS celler får bilda embryoid organ (EBs) till låg vidhäftning kultur plattor, och inkuberas sedan i ett induktionsmedium som innehåller dubbla SMAD-hämmare för att inducera neuroectodermal differentiering. Vidhäftning av EBs i PO/ lam-belagda rätter tillåter generering av 2D neurala rosettstrukturer medan den fritt flytande kulturen av EBs med efterföljande inbäddning i BMM möjliggör generering av dorsala förhjärnor. Tillbakadragande av mitogenic faktorer från vidhäftande neural rosettmedium främjar uppkomsten av neurogenes som kan testas genom IF analys. Dissociation av vidhäftande neurala rosetter gör det möjligt att generering av isolerade NSPC kulturer användbart för PC biogenesis och funktion analys. Dorsala förhjärneorganoider samlas in efter 4, 6 eller 10 veckors differentiering och fixeras för efterföljande immunstaininganalys antingen i toto, på 150 μm tjocka sektioner eller 20 μm kryosektioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Video 1: Ljusplåt förvärv av en hel dorsal forebrain organoid (dag 42) immunstained med PAX6, CTIP2 och NCADH antikroppar. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: Ljusplåt förvärv av en hel dorsal forebrain organoid (dag 42) immunstained med TPX2, P-VIM och CTIP2 antikroppar. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 3: Ljusplåt förvärv av en hel dorsal forebrain organoid (dag 42) immunstained med PCNT och ARL13B antikroppar. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 4: Resonans skanning confocal förvärv av en 150 μm avsnitt av en dorsal forebrain organoid (dag 42) immunstained med ARL13B och PCNT antikroppar. Klicka här för att ladda ner den här videon.

KOMPLETTERANDE FILER: Klicka här för att ladda ner tabellerna.

Tilläggstabell 1: Recept på de medier som används för generering av 2D-neurala rosetter och NSPCs.

Tilläggstabell 2: Recept på de medier som används för generering av dorsala förhjärnorganoider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PC betraktas nu som viktiga organeller som reglerar avgörande steg under normal cerebral när utveckling18,19,31 inklusive NSPC-expansion och åtagande8,9,10,11,12 samt neuronal migration13,14 och synaptogenes16,17 . Förutom analys i djurmodeller eller mänskliga fetala cerebrala vävnader, är generering av mycket innovativa och relevanta patient-härledda hIPSC-baserade modeller av neokortikal utveckling avgörande för att dissekera rollen som PC under både normala och patologiska cerebrala när utveckling.

Det 2D hIPSC-baserade modelleringsprotokollet som beskrivs här anpassades från tre större publikationer20,21,22. Neuroepithelial differentiering induceras av dubbel SMAD-hämning med hjälp av små molekylhämmare av activin/nodal (SB-431542) och BMP (LDN-193189) vägar22. Cellerna är organiserade i rosettformade strukturer som innehåller NSPCs samt neokortikala djupa skikt nervceller efter 20 dagars differentiering. Dessutom visar dessa rosettliknande strukturer korrekt apicobasal polaritet, interkinetisk nukleär migration av apikala stamceller samt PC som sträcker sig från alla NSPCs och nervceller. Efter dissociation av dessa rosettstrukturer erhålls en homogen och stabil population av näratiska stamceller21. När odlade för att sammanflöde och svälta i 48 h, de näratiska stamceller hyser PC för vilken morfologi, nummer och längd lätt kan analyseras genom att kombinera Ilastik28 och CiliaQ28,29 plugin paket på Fiji / ImageJ. Genom att använda cytokiner för att inducera SHH-signalvägen kan PC-funktionen också användas av IF för att testa dynamiken hos viktiga signalvägsaktörer längs datorn som GLI2, SMO och GPR161. Dessutom möjliggör semi-kvantitativa RT-PCR-analyser testning av induktion av SHH-målgenuttryck, inklusive GLI1 och PTCH1, som svar på aktivering av SHH-vägar. Andra signalvägar som är beroende av PC-funktionen bör också testas, inklusive WNT- och IGF-vägar2,32,33. För att avsluta på denna 2D modellering strategi, som tydligt reproducerar flera aspekter av normala hjärnbarken utveckling, det representerar ett användbart och relevant verktyg för testning PC biogenesis och funktion i normala kontra patologiska villkor och bör bidra till att få ytterligare insikt i deltagandet av PC under neokortikal utveckling.

Som komplement till 2D hIPSC-baserade modelleringsmetoder, erbjuder dorsala forebrain organoider oöverträffade möjligheter att undersöka normala och patologiska cerebrala utveckling in vitro som de rekapitulerar många funktioner och egenskaper hos den tidiga utveckla mänskliga hjärnbarken. Två huvudtyper av protokoll används för närvarande: de inneboende och de guidade metoderna. Det inneboende protokollet som utvecklats av Lancaster och kollegor23 förlitar sig på IPSCs inneboende förmåga att självorganiserad med minimala yttre faktorer och ger upphov till cerebrala organoider som innehåller rudiment av distinkta hjärnregioner som erbjuder en unik möjlighet att modellera interaktionerna mellan olika hjärnregioner. Den stora variationen och heterogeniteten i en sådan modelleringsstrategi innebär dock betydande utmaningar för reproducerbarhet. Guidade organoid differentiering protokoll tillåter generering av hjärnan region-specifika organoider med minimal heterogenitet24,25,26. Detta tillvägagångssätt tillät oss att framgångsrikt generera dorsala forebrain organoider med ventrikel-liknande strukturer som rekapitulerar stora processer av tidiga mänskliga cerebrala när utveckling. Den första kritiska frågan är att börja med högkvalitativa hIPSC-kulturer som hyser stora regelbundna kolonier som uppvisar mindre än 10% differentiering och som har antagits nästan en gång som en monolayer för att anpassa hIPCs till encelliga odlingsförhållanden. För att begränsa organoid heterogenitet, en av de största utmaningarna på området, är bildandet av EBs med en homogen storlek en förutsättning som innebär behovet av dissociation av hIPSC-kolonier i encells suspension som möjliggör sådd vid den definierade celltätheten. Ett annat kritiskt steg är BMM-inkludering av EBs, som behövs för att stödja 3D-struktur och neuroepithelial expansion. Vi föredrog gruppen inkludering av cirka femton organoider framför individuell inkludering även om det innebär ett ytterligare steg, BMM dissociation. BMM dissociation före skakning kultur har visat sig minska variabilitet inom och mellan organoida partier, vilket resulterar i högre reproducerbarhet34. Dessutom gör det det möjligt att bli av med cellprocesser som sträcker sig in i BMM som inte är skadliga för följande differentieringssteg men som gör det svårt att observera organoider för kvalitetsinspektion under efterföljande steg i förfarandet. För att förbättra näringsupptag och syreutbyte jämförde vi organoid mognad på orbital shakers och snurrande bioreaktorer som ledde till liknande resultat. Vi valde därför alternativet orbital shaker, eftersom det gör det möjligt att avsevärt minska medelvolymerna och därmed den totala kostnaden för experimenten. Viktigt, använd en annan inkubator för stationär och skakig kultur på en orbital shaker för att undvika vibrationer som skadar vidhäftande hIPSC-tillväxt. Vi tillämpade framgångsrikt detta protokoll på fem distinkta kontroll hIPSC linjer35 som ger upphov till homogena resultat som säkerställer robustheten i denna procedur.

Karakterisering av sådana organoider kan uppnås med flera metoder. För att bevara den rumsliga 3D-informationen inom organoider upprättade vi ett protokoll som tillåter hela montering immunostaining och clearing av hela organoider med efterföljande ljusplåt förvärv. Olika clearingmetoder har uppstått med effektivitet beroende på provursprung och tjocklek36,37. Här sätter vi upp en enkel, snabb och kostnadseffektiv clearingmetod som förlitar sig på TDE (2,2'-thiodiethanol), ett glykolderivat som tidigare användes för att rensa mushjärna och intestinala organoider38,39. Förvärv av immunstained och rensade organoider utfördes på en ljus ark mikroskop med hjälp av ett 20x mål nedsänkt i 80% TDE. I jämförelse med andra 3D-bildförvärvsmetoder är ljusplåtsmikroskopi av intresse av flera skäl: snabb förvärv, god penetration och minskad fotobleaching. Optimering av permeabiliseringssteget gör det möjligt att nå effektiv och homogen antikroppsinträngning som gör det möjligt att visualisera basala kroppar och axonemes av PC som sträcker sig från alla stamceller och neuronala celltyper av hela organoiden. Förvärv av fritt flytande 150 μm tjocka sektioner med hjälp av ett inverterat resonant scanning confokal mikroskop med 40x (NA 1.3) eller 63x (NA 1.4) oljemål gör det dessutom möjligt att få ytterligare upplösning, samtidigt som en betydande grad av 3D-rumslig information bevaras och möjliggöra kvalitativ och kvantitativ analys av PC-biogenes och funktion.

Kombinera sådana 2D- och 3D-cellbaserade modeller och 3D-avbildningsanalys (figur 5) på hIPSCs som genereras antingen genom omprogrammering av ciliopathy patientceller eller genom att använda CRISPR/CAS9-teknik för att specifikt redigera centrosomala eller ciliary gener bör möjliggöra betydande framsteg i förståelsen av datorns bidrag under normal och patologisk utveckling av hjärnbarken. Viktigt är att genomredigeringstekniken också gör det möjligt att specifikt rädda patientmutationer för att erhålla isogena kontroll hIPSCs för att övervinna genetisk heterogenitet som utmanar upptäckten av sjukdomsmekanismer. Dessutom används encelliga genomiska metoder nu i stor utsträckning inom hela fältet och representerar relevanta och kompletterande metoder för immunostaininganalys. Trots vissa begränsningar och svårigheter som är inneboende i alla framväxande tekniker, och som behandlas i stor utsträckning, erbjuder sådana 2D- och 3D hIPSC-baserade modeller och de karakteriseringsmetoder som vi presenterade här kraftfulla och relevanta verktyg för att dissekera PC-engagemang i de patologiska mekanismerna bakom mänskliga utvecklingsmässiga neokortikala anomalier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från Agence Nationale de la Recherche (ANR) till S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) och N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 och ANR-19-CE16-0002-01). LB stöds av ANR under Investissements d'avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01) och Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-program). Imagine Institute stöds av statlig finansiering från ANR inom ramen för Investissements d'avenir-programmet (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-projekt) och som en del av det andra Investissements d'Avenir-programmet (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 181 primär cilium humaninducerade pluripotenta stamceller hIPSCs neurala stamceller och stamceller human cerebral när utveckling neurala rosetter dorsala forebrainorganoider 2D- och 3D-hIPSC-baserade modeller av neokortikisk utveckling cerebrala organoider Sonic igelkott full montering immunostaining optisk clearing ljus arkmikroskop
2D- och 3D-mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade modeller för att dissekera primärt ciliuminblandning under neokortisk utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter