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Developmental Biology

2 डी और 3 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-आधारित मॉडल नियोकॉर्टिकल विकास के दौरान प्राथमिक सिलियम भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

हम 2 डी और 3 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) के उत्पादन और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं- नियोकॉर्टिकल विकास के मॉडल के साथ-साथ पूरक तरीके जो प्राथमिक सिलियम (पीसी) बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं।

Abstract

प्राथमिक सिलिया (पीसी) गैर-गतिशील गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित ऑर्गेनेल हैं जो अधिकांश स्तनधारी कोशिकाओं की सतह से निकलते हैं। वे सेल चक्र के जी 1 / जी 0 चरण के दौरान पुराने सेंट्रिओल से उभरते हैं, जबकि वे अलग हो जाते हैं क्योंकि कोशिकाएं जी 2 / एम चरण सीमा पर सेल चक्र में फिर से प्रवेश करती हैं। वे कई सेल प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण बाह्य कोशिकीय संकेतों का पता लगाने और ट्रांसड्यूसिंग करके सिग्नल हब के रूप में कार्य करते हैं। अधिकांश सेल प्रकारों के समान, सभी नियोकॉर्टिकल न्यूरल स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एनएसपीसी) को एक पीसी को आश्रय देते हुए दिखाया गया है जो उन्हें सामान्य सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास के लिए आवश्यक विशिष्ट संकेतों को समझने और ट्रांसड्यूस करने की अनुमति देता है। यहां, हम नियोकोर्टिकल विकास के दौरान पीसी की भागीदारी को और अधिक विच्छेदन करने के लिए मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से दो आयामी (2 डी) और तीन-आयामी (3 डी) सेल-आधारित मॉडल उत्पन्न करने और चिह्नित करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, हम पीसी बायोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और 2 डी न्यूरल रोसेट-व्युत्पन्न एनएसपीसी में कार्य करते हैं, जिसमें सोनिक हेजहोग (एसएचएच) मार्ग का ट्रांसडक्शन शामिल है। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के तीन आयामी (3 डी) संगठन का लाभ उठाने के लिए, हम टोटो इम्युनोस्टेन्ड सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स में 3 डी इमेजिंग के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। ऑप्टिकल समाशोधन के बाद, पूरे ऑर्गेनोइड्स का तेजी से अधिग्रहण नियोकोर्टिकल पूर्वजों और पूरे ऑर्गेनोइड के न्यूरॉन्स पर सेंट्रोसोम और पीसी दोनों का पता लगाने की अनुमति देता है। अंत में, हम 3 डी स्थानिक जानकारी की एक महत्वपूर्ण डिग्री को संरक्षित करने और पीसी बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के विस्तृत गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक उच्च-रिज़ॉल्यूशन अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए मोटी मुक्त-फ्लोटिंग ऑर्गेनोइड वर्गों के इम्युनोस्टेनिंग और समाशोधन के लिए प्रक्रिया का विस्तार करते हैं।

Introduction

प्राथमिक सिलिया (पीसी) सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित ऑर्गेनेल हैं जो बाह्य कोशिकीय वातावरण से रासायनिक और यांत्रिक संकेतों की अधिकता को समझते हैं और ट्रांसड्यूस करते हैं। विशेष रूप से, पीसी कशेरुकी 1,2 में हेजहोग सिग्नलिंग मार्ग के ट्रांसडक्शन के लिए केंद्रीय ऑर्गेनेल है। जबकि अधिकांश तंत्रिका कोशिकाओं को लंबे समय से एक पीसी को आश्रय देते हुए दिखाया गया है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को आकार देने में इस ऑर्गेनेल के योगदान को लंबे समय से कम आंका गया है। नियोकॉर्टिकल विकास पर अध्ययन ने कई तंत्रिका स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एनएसपीसी) की खोज का नेतृत्व किया है, जो सभी एक पीसी को आश्रय देते हैं, जिसका स्थान पूर्वज भाग्य निर्धारण 3,4,5,6,7 के लिए महत्वपूर्ण होने का प्रस्ताव दिया गया है। पीसी को सेल तंत्र के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है जो सामान्य सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास के लिए आवश्यक हैं, जिसमें एनएसपीसी विस्तार और प्रतिबद्धता 8,9,10,11,12 के साथ-साथ रेडियल ग्लियाल पाड़ की एपिकोबेसल ध्रुवीयता भी शामिल है जो न्यूरोनल माइग्रेशन 13 का समर्थन करती है। इसके अलावा, पीसी cortical plate14,15 के लिए interneurons स्पर्शरेखा प्रवास के दौरान आवश्यक हैं। अंत में, पीसी के लिए एक भूमिका सेरेब्रल कॉर्टेक्स 16,17 में न्यूरॉन्स के सिनैप्टिक कनेक्शन की स्थापना में प्रस्तावित की गई है। कुल मिलाकर, ये निष्कर्ष सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास 18,19 के प्रमुख चरणों में पीसी की एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए तर्क देते हैं और सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास की विसंगतियों को अंतर्निहित रोग तंत्र में उनकी भागीदारी की जांच करने की आवश्यकता को बढ़ाते हैं।

हाल के अध्ययनों ने मानव और पशु मॉडल में कॉर्टिकल विकास के बीच महत्वपूर्ण सेलुलर और आणविक अंतरों की हमारी समझ में काफी हद तक सुधार किया है, मानव मॉडल सिस्टम विकसित करने की आवश्यकता पर जोर दिया है। इस दृष्टिकोण में, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) एक प्रासंगिक आनुवंशिक और सेलुलर संदर्भ में रोग रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। अनुयायी दो आयामी (2 डी) सेल-आधारित मॉडल या तंत्रिका रोसेट में विकासशील सेरेब्रल कॉर्टेक्स में देखे गए लोगों के समान एनएसपीसी होते हैं, जो रोसेट के आकार की संरचनाओं में व्यवस्थित हो जाते हैं जो सही एपिकोबेसल ध्रुवीयता 20,21,22 दिखाते हैं। इसके अलावा, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणाली पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी की अनुमति देती है जो मानव सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास की कई विशेषताओं को दोहराती है23,24,25,26। उन दो पूरक सेल-आधारित मॉडलिंग दृष्टिकोण सेरेब्रल कॉर्टेक्स के सामान्य और रोग विकास के दौरान पीसी की भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए रोमांचक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

यहां, हम तंत्रिका रोसेट और व्युत्पन्न एनएसपीसी के साथ-साथ पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी और लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम सोनिक हेजहोग मार्ग के ट्रांसडक्शन का परीक्षण करके और इस मार्ग में शामिल महत्वपूर्ण अणुओं की गतिशीलता का विश्लेषण करके एनएसपीसी पर मौजूद पीसी के बायोजेनेसिस और कार्य का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के 3 डी संगठन का लाभ उठाने के लिए, हमने 3 डी इमेजिंग के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विधि भी स्थापित की है , जो तेजी से अधिग्रहण की अनुमति देता है, एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप के लिए धन्यवाद, पूरे ऑर्गेनोइड के, उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे ऑर्गेनोइड के सभी प्रकार के नियोकॉर्टिकल पूर्वजों और न्यूरॉन्स पर पीसी की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। अंत में, हमने 150 μm फ्री-फ्लोटिंग वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को अनुकूलित किया, जिसमें बाद में समाशोधन और अधिग्रहण का उपयोग करके अनुनादी स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि अधिग्रहण की अनुमति दी गई, जो पीसी बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के विस्तृत विश्लेषण के लिए आवश्यक है। विशेष रूप से, 3 डी-इमेजिंग सॉफ्टवेयर पीसी की लंबाई, संख्या और अभिविन्यास के साथ-साथ एक्सोनेम के साथ सिलिअरी घटकों के सिग्नल तीव्रता माप सहित रूपात्मक मापदंडों के बाद के विश्लेषण के साथ पीसी के 3 डी-पुनर्निर्माण की अनुमति देता है।

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Protocol

1. 2 डी hIPS सेल की पीढ़ी-neocortical विकास के आधारित मॉडल

  1. तंत्रिका रोसेट गठन
    1. HIPSC संस्कृतियों के साथ शुरू करें जो बड़े नियमित उपनिवेशों को आश्रय देते हैं, जो 10% से कम भेदभाव प्रदर्शित करते हैं और 80% से अधिक confluency नहीं।
    2. पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ hIPSCs कुल्ला।
    3. रॉक अवरोधक (एनआईएम + वाई -27632 के 10 μM) के साथ पूरक एनएसपीसी प्रेरण माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
    4. मैन्युअल रूप से एक 35 मिमी डिश से प्रत्येक hIPSC कॉलोनी विच्छेदन एक सुई का उपयोग कर प्रत्येक कॉलोनी को क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में ठीक से काटने के लिए एक चेकर-बोर्ड पैटर्न बनाने के लिए एक चेकर-बोर्ड पैटर्न बनाने के लिए एक समान क्लस्टर में विभाजित करने के लिए।
    5. एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कॉलोनी को अलग करें और उन्हें अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट 35 मिमी डिश पर स्थानांतरित करें।
    6. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रात भर (ओएन) तैरने दें, ताकि वे भ्रूण निकायों (ईबी) का निर्माण कर सकें।
      नोट: Embryoid निकायों (EBs) को फ़्लोटिंग गोलाकार क्लस्टर या hIPSCs के समुच्चय के रूप में परिभाषित किया गया है।
    7. ईबी को पॉली-एल-ऑर्निथिन / लैमिनिन (पीओ / लैम) में स्थानांतरित करें - 2 एमएल एनआईएम में 35 मिमी व्यंजनों को लेपित + वाई -27632 के 10 μM।
    8. दैनिक ताज़ा एनएसपीसी प्रेरण माध्यम (वाई -27632 के बिना एनआईएम) तंत्रिका रोसेट के गठन तक जो लगभग 12 से 14 दिन लेता है। माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच करें।
      नोट: इस चरण के बाद तंत्रिका रोसेट का विस्तार किया जा सकता है, विभेदित किया जा सकता है, और immunostaining विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है या अलग-थलग तंत्रिका स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (NSPCs) को प्राप्त करने के लिए अलग किया जा सकता है।
  2. तंत्रिका रोसेट विस्तार और प्रारंभिक विभेदन
    1. एक सुई के साथ एक ग्रिड की तरह पैटर्न में तंत्रिका rosettes कटौती और एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर समूहों dislodge.
    2. एनएसपीसी रखरखाव माध्यम (एनएमएम) के 0.5 मिलीलीटर में पीओ / लैम-लेपित ग्लास कवरस्लिप (4-5 रोसेट / अच्छी तरह से) युक्त एक 4-अच्छी तरह से प्लेट में रोसेट को स्थानांतरित करें।
    3. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    4. 20 वें दिन तक हर दूसरे दिन NMM ताज़ा करें।
    5. दिन 20 से, साइटोकाइन के 0.5 मिलीलीटर में संस्कृति तंत्रिका रोसेट ने भेदभाव की अनुमति देने के लिए एनएमएम को समाप्त कर दिया। माध्यम को हर 2-3 दिनों में ताज़ा करें।
    6. दिन 30 और दिन 40 (भेदभाव के 10 या 20 दिन) पर, 4% पीएफए, 20 मिनट, आरटी के 0.5 मिलीलीटर के साथ रोसेट को ठीक करें।
  3. पीसी biogenesis और अलग एनएसपीसी पर समारोह विश्लेषण
    1. एनएसपीसी पृथक्करण
      1. एक सुई के साथ एक ग्रिड की तरह पैटर्न में चरण 1.1.8 से तंत्रिका rosettes कटौती और एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर समूहों dislodge. NMM के 2 mL में PO/ lam-लेपित 35 मिमी व्यंजनों में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और 37 °C और 5% CO2 पर एक humidified इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      2. NMM को हर दूसरे दिन ताज़ा करें जब तक कि confluency (लगभग 5-7 दिन)।
      3. तंत्रिका रोसेट के आसपास की बड़ी, स्पष्ट कोशिकाओं को स्क्रैप करने के बाद, उन्हें मैन्युअल रूप से चुनें और एनएसपीसी के लिए समृद्ध करने और गैर-तंत्रिका सेल प्रकारों को कम करने के लिए उन्हें ताजा पीओ / लैम-लेपित 35 मिमी व्यंजनों पर स्थानांतरित करें।
      4. एक या दो मैनुअल मार्ग के बाद (यदि आवश्यक हो तो चरण 1.3.1.3 को दोहराएं) सभी दूषित सेल प्रकारों को हटाने, माध्यम को हटाने और पीबीएस के साथ कुल्ला करने के लिए आवश्यक है।
      5. 0.05% ट्रिप्सिन के 300 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि अधिकांश कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
      6. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए 10% FBS (DMEM + 10% FBS) वाले माध्यम के 2 mL जोड़ें। एक 15 मिली शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए। धीरे से सेल निलंबन ऊपर और नीचे तीन बार सेल clumps तोड़ने के लिए पिपेट.
      7. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
      8. सावधानी से supernatant aspirate और NMN में कोशिकाओं resuspend.
      9. NMM में एकल कोशिकाओं (1 x 105 कोशिकाओं / सेमी 2) के रूप में विघटित एनएसपीसी को पीओ / लैम-लेपित व्यंजनों पर बीज दें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      10. हर दूसरे दिन माध्यम बदलकर NMM में NSPCs का विस्तार करें।
        नोट: NSPCs भेदभाव से बचने के लिए उच्च घनत्व पर seeded हैं।
    2. पीसी बायोजेनेसिस विश्लेषण
      1. बीज 100,000 कोशिकाओं / सेमी 2 पर एनएसपीसी को अलग करता है और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में और 2 दिनों के लिए एनएमएम में 5% सीओ 2 में इनक्यूबेट करता है।
      2. साइटोकाइन में मध्यम और भूखे एनएसपीसी को 48 घंटे के लिए समाप्त माध्यम (एनएसपीसी भुखमरी माध्यम, पूरक तालिका 1) में एस्पिरेट करें।
      3. आरटी में 20 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ एनएसपीसी को ठीक करें।
      4. इम्युनोस्टेनिंग से पहले आरटी में 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    3. पीसी समारोह विश्लेषण: SHH सिग्नलिंग मार्ग
      1. बीज पीओ / लैम-लेपित 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड (300 μL) या T25 व्यंजन (5 एमएल) पर 100,000 कोशिकाओं / सेमी 2 पर एनएसपीसी को अलग कर दिया गया और 2 दिनों के लिए एनएमएम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया गया।
      2. एनएसपीसी भुखमरी माध्यम में भूखे एनएसपीसी (8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से 300 μL और T25 फ्लास्क में 5 एमएल) 48 घंटे के लिए।
      3. SHH मार्ग को प्रेरित करने के लिए, पुनः संयोजक SHH (100 ng / mL) या SAG (500 nM) के साथ पूरक भुखमरी माध्यम के साथ एनएसपीसी को इनक्यूबेट करें; (150 μL एक 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से और T25 फ्लास्क में 2 मिलीलीटर) 24 घंटे के लिए।
      4. आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए प्रति अच्छी तरह से 4% पीएफए के 250 μL में 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड पर सुसंस्कृत एनएसपीसी को ठीक करें और उन्हें इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण से पहले आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के 250 μL के साथ दो बार धोएं।
      5. मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ T25 व्यंजनों में सुसंस्कृत NSPCs धोएं।
      6. 0.05% ट्रिप्सिन के 500 μL जोड़ें और कोशिकाओं के अलग होने तक 37 °C पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      7. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए 10% FBS (DMEM + 10% FBS) वाले माध्यम के 2 mL जोड़ें और 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन एकत्र करें।
      8. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज और ध्यान से NSPC छर्रों को प्राप्त करने के लिए supernatant aspirate है कि आरएनए निष्कर्षण और आरटी-पीसीआर विश्लेषण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर cryopreserved किया जा सकता है।

2. पृष्ठीय forebrain organoids की पीढ़ी

  1. HIPSCs की एकल-सेल संस्कृति
    1. एचआईपीएससी संस्कृतियों के साथ शुरू करें जो बड़े नियमित उपनिवेशों को 10% से कम भेदभाव प्रदर्शित करते हैं और जिन्हें लगभग एक बार पारित किया गया है। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं 80% से अधिक confluent नहीं हैं।
    2. पीबीएस के 2 एमएल के साथ कॉलोनियों को धोएं।
    3. कोमल सेल पृथक्करण अभिकर्मक (GCDR) के 500 μL जोड़ें और 37 °C पर 5 से 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. GCDR aspirate और y-27632 के 5 μM के साथ पूरक mTeRS1 माध्यम के 2 mL जोड़ें।
    5. सभी उपनिवेशों को एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए कोशिकाओं को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे 10 बार पिपेट करें।
    6. विट्रोनेक्टिन-लेपित व्यंजनों पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      नोट:: एकल-सेल संस्कृति स्थितियों के लिए hIPSCs को अनुकूलित करने के लिए विभेदन प्रयोग से पहले GCDR का उपयोग कर hIPSCs के कम से कम 1 मार्ग निष्पादित करें।
  2. दिन 0 पर, एचआईपीएससी को ईबी माध्यम में भ्रूण निकायों को बनाने की अनुमति दें जिसमें एफजीएफ 2 की कम एकाग्रता और एचआईपीएससी अस्तित्व के लिए आवश्यक रॉक अवरोधक की उच्च एकाग्रता शामिल है। ऐसा करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. पीबीएस के 2 एमएल के साथ कॉलोनियों को धोएं।
    2. कोमल सेल पृथक्करण अभिकर्मक (GCDR) के 500 μL जोड़ें और 37 °C पर 5 से 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. GCDR aspirate और Y-27632 के 50 μM के साथ पूरक EB माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें; कोशिकाओं को धीरे से अलग करने और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
    4. Y-27632 के 50 μM के साथ पूरक EB माध्यम के 2 mL के साथ एक बार फिर से कुल्ला, शेष कोशिकाओं को 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। तुरंत शंक्वाकार ट्यूब के लिए Y-27632 के 50 μM के साथ पूरक EB माध्यम के 3 mL जोड़ें और धीरे से एक 5 mL पिपेट का उपयोग कर समाधान homogenize.
    5. 5 मिनट के लिए 100 x g पर विघटित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. धीरे supernatant aspirate और 6 मिलीलीटर ईबी माध्यम में कोशिकाओं resuspend Y-27632 के 50 μM के साथ पूरक.
    7. 5 मिनट के लिए 100 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. Supernatant aspirate और Y-27632 के 50 μM के साथ पूरक EB माध्यम के 1 mL में कोशिकाओं resuspend. एक एकल सेल निलंबन में कोशिकाओं को धीरे से अलग करने के लिए एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
    9. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के तुरंत बाद, उन्हें पतला करें और गिनें।
    10. सेल निलंबन की उचित मात्रा (900,000 कोशिकाओं युक्त) को ईबी माध्यम के 30 मिलीलीटर में पतला करें, जो वाई -27632 के 50 μM और BFGF के 4 ng / mL के साथ पूरक है और धीरे से समाधान को मिलाएं।
    11. प्लेट 9,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक अल्ट्रा-कम अनुलग्नक 96U प्लेट (300 μL / अच्छी तरह से) में। ईबी गठन को परेशान करने से बचने के लिए, मध्यम परिवर्तन के बिना दिन 3 तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. Neural induction (Dual SMAD inhibition)
    1. दिन 3 पर, सुनिश्चित करें कि EBs 300-400 μm को मापते हैं और नियमित सीमाओं को दिखाते हैं। यदि दोनों मानदंड ों तक पहुंच जाते हैं, तो मध्यम (150 μL) के आधे हिस्से को प्रेरण माध्यम -1 के साथ बदलें जिसमें दोहरी SMAD अवरोधक होते हैं, जिससे दिन 6 से दिन 7 तक ईबी के समोच्च को उज्ज्वल किया जा सकता है जो न्यूरोइक्टोडर्मल भेदभाव (पूरक तालिका 2) को दर्शाता है।
    2. दिन 4 पर, माध्यम (225 μL) के 3/4 को प्रेरण माध्यम -1 के साथ बदलें।
    3. दिन 6 और दिन 8 पर: प्रेरण माध्यम -1 (150 μL) के आधे हिस्से को ताज़ा करें।
  4. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडिंग ऑर्गेनोइड (दिन 10)
    1. दिन 10 पर, विकास कारक में EBs एम्बेड तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (BMM) कम कर दिया.
      नोट: इस चरण से, हमेशा बार-बार पिपेटिंग द्वारा ऑर्गेनोइड्स को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए पिपेट युक्तियों के उद्घाटन में कटौती करने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें।
    2. पहले शंक्वाकार ट्यूबों में लगभग 15-17 ऑर्गेनोइड्स का स्थानांतरण। ईबी को बसने दें और माध्यम को हटा दें। प्रेरण माध्यम -2 के 50 μL जोड़ें और उन्हें BMM के 100 μL युक्त एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. मैट्रिक्स-ईबी मिश्रण को एक अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट प्लेट के कुएं के केंद्र पर फैलाएं और उन्हें फ्यूजिंग से रोकने के लिए ईबी को अलग करें।
    4. बीएमएम को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में ठोस होने दें।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रेरण माध्यम -2 के 3 मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि यह प्रक्रिया जितनी जल्दी हो सके की जाती है क्योंकि BMM कमरे के तापमान पर जम जाता है।
  5. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड organoids की स्थिर संस्कृति
    1. दिन 12, 14: प्रेरण माध्यम-2 ताज़ा करें.
    2. दिन 16: प्रेरण माध्यम -2 ताज़ा करें और एक माइक्रोस्कोप के तहत न्यूरोएपिथेलियल लूप के विस्तार की जांच करें।
  6. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पृथक्करण और एक कक्षीय शेकर पर संस्कृति
    1. दिन 17 पर, 5 एमएल पिपेट के साथ 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके बीएमएम से ऑर्गेनोइड्स को अलग करें और उन्हें भेदभाव माध्यम -1 (विटामिन ए के बिना) में स्थानांतरित करें। पोषण अवशोषण में सुधार करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 80 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: अनुयायी hIPS सेल विकास के लिए हानिकारक किसी भी कंपन से बचने के लिए एक कक्षीय शेकर पर स्थिर संस्कृति और संस्कृति के लिए एक अलग इनक्यूबेटर का उपयोग करें।
    2. दिन 19: भेदभाव माध्यम-1 ताज़ा करें.
    3. दिन 21: विभेदन माध्यम -1 को विभेदन माध्यम -2 (विटामिन ए के साथ) में बदलें।
    4. दिन 23 से दिन 35 तक: हर 2-3 दिनों में भेदभाव माध्यम -2 के साथ माध्यम को ताज़ा करें।
    5. दिन 35 से दिन 70 तक: 1% BMM के साथ भेदभाव मध्यम -2 को ताज़ा करें और हर 2-3 दिनों में ताज़ा करें।
    6. 28, 42, और 70 +/- 2 दिनों के भेदभाव के बाद ऑर्गेनोइड्स को इकट्ठा करें और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर 5 एमएल 4% पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर ठीक करें।
    7. टोटो या फ्री-फ्लोटिंग इम्युनोस्टेनिंग विश्लेषण में आगे के लिए, ऑर्गेनोइड्स को फिर पीबीएस में दो बार कुल्ला किया जाता है और पीबीएस + 0.05% सोडियम एजाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जाता है।
    8. जमे हुए वर्गों पर immunostaining विश्लेषण के लिए, 4% PFA 10 mL में 30% सुक्रोज में 4% PFA निश्चित organoids +4 °C पर (या जब तक organoids सिंक) विसर्जित करें। उन्हें एक जमे हुए एम्बेडिंग मैट्रिक्स में एम्बेड करें और क्रायोसेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. toto immunolabeling में, समाशोधन, और पृष्ठीय forebrain organoids के lightsheet अधिग्रहण

  1. ग्रस्तता
    1. 6-अच्छी तरह से प्लेटों में ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें, माध्यम को हटा दें, और उन्हें 4% पीएफए के 2 एमएल के साथ ठीक करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर, रात भर।
    2. कमरे के तापमान पर पीबीएस के 2 मिलीलीटर में तीन धोना प्रदर्शन करें।
    3. ऑर्गेनोइड्स को 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और पीबीएस + 0.05% सोडियम एजाइड के 2 एमएल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. परमीबिलाइजेशन
    1. 1 घंटे के लिए आरटी पर 0.2% ट्राइटन X100 युक्त पीबीएस के 1 मिलीलीटर में ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें। ऐसा दो बार करें।
    2. PBS के 1 मिलीलीटर में इनक्यूबेट करें जिसमें 0.2% ट्राइटन X100 और 20% DMSO शामिल हैं, 37 डिग्री सेल्सियस पर, रात भर में।
    3. PBS के 1 mL में इनक्यूबेट करें जिसमें 0.1% Tween20, 0.1% Triton X100, 0.1% Deoxycholate, 0.1% NP40 और 20% DMSO शामिल हैं, 37 °C पर, रात भर।
    4. 0.2% Triton-X100 युक्त PBS के 1 mL में इनक्यूबेट, आरटी पर, 1 ज के लिए। ऐसा दो बार करें।
  3. अवरुद्ध और immunolabeling
    1. ब्लॉकिंग समाधान के 1 मिलीलीटर में ब्लॉक (PBS, 0.2% Triton X100, 6% गधा सीरम, 10% DMSO), 37 डिग्री सेल्सियस, पर पर।
    2. पीबीएस के 250 μL, 0.2% Tween20, हेपरिन के 0.1 μg / mL, 5% DMSO और 3% गधा सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट, 37 डिग्री सेल्सियस पर, 2 दिनों के लिए।
    3. 0.2% Tween20 और हेपरिन के 0.1 μg / mL युक्त PBS के 1 mL में धोएं, 1 घंटे के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर। ऐसा चार बार करें।
    4. पीबीएस के 1 मिलीलीटर में धोएं जिसमें 0.2% Tween20 और हेपरिन के 0.1 μg / mL शामिल हैं, रात भर, 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. पीबीएस के 250 μL में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें जिसमें 0.2% ट्वीन 20, हेपरिन के 0.1 μg / mL और 3% गधा सीरम, 37 डिग्री सेल्सियस पर, 2 दिनों के लिए शामिल हैं।
    6. पीबीएस के 1 मिलीलीटर में धोएं जिसमें 0.2% Tween 20 और 0.1 μg / mL हेपरिन शामिल हैं, 1 घंटे के लिए, एक पहिया पर, आरटी पर। ऐसा चार बार करें।
    7. 0.2% Tween 20 और हेपरिन के 0.1 μg / mL युक्त PBS के 1 mL में धोएं, रात भर, एक पहिया पर, आरटी पर।
    8. पीबीएस के 1 मिलीलीटर में धोएं, 24 घंटे के लिए, आरटी पर।
    9. PBS के 1 mL में +4 °C पर स्टॉक और समाशोधन तक 0.05% सोडियम azide.
  4. टीडीई में समाशोधन (2,2' -Thiodiethanol)
    1. 30% TDE के 1 mL (TDE के 3 mL + PBS के 7 mL) में ऑर्गेनोइड्स को 24 h के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    2. आरटी पर 24 घंटे के लिए 60% टीडीई (टीडीई के 6 एमएल + पीबीएस के 4 एमएल) के 1 एमएल में इनक्यूबेट करें।
    3. 80% TDE के 1 mL (TDE के 8 mL + PBS के 2 mL) में इनक्यूबेट करें, RT पर 24 h के लिए।
  5. Light Sheet acquisition से पहले Organoid embedding
    नोट:: किसी कस्टम-निर्मित सिस्टम का उपयोग करें; एक scalpel के साथ कटौती टिप के साथ एक 1 एमएल सिरिंज के साथ बनाया गया.
    1. 60% TDE समाधान में 4% कम पिघलने वाले Agarose के 100 mL और 2 mL ट्यूबों में ऐलीकोट तैयार करें। +4 °C पर संरक्षित करें।
    2. ऑर्गेनोइड एम्बेडिंग से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 60% टीडीई में 4% कम-पिघलने वाले एगारोज़ के 1.5 मिलीलीटर युक्त एक ट्यूब को प्रीहीट करें जब तक कि यह तरलीकृत न हो जाए।
    3. इस बीच, एक कस्टम-निर्मित मोल्डिंग सिस्टम तैयार करें जो 1 एमएल सिरिंज से बना है, जिसकी नोक को स्केलपेल का उपयोग करके काट दिया जाता है।
    4. प्लंजर का उपयोग कर जेल समाधान के सिरिंज 600 μL में पंप.
    5. एक बढ़े हुए पिपेट टिप का उपयोग करके नमूने की स्थिति जिसमें से उद्घाटन बाँझ कैंची का उपयोग करके काटा गया है।
    6. जेल समाधान के 400 μL के साथ सिरिंज में भरें ताकि नमूना सिरिंज के निचले तीसरे के भीतर स्थित है।
    7. जेल polymerize और 4 डिग्री सेल्सियस पर 80% TDE समाधान में स्टोर करने के लिए अधिग्रहण तक प्रकाश से संरक्षित.
    8. लाइट शीट अधिग्रहण के लिए, समाशोधन विधि के अपवर्तक सूचकांक को सही ढंग से समायोजित करने की अनुमति देने के लिए नमूना कक्ष में जोड़े गए 80% टीडीई समाधान में डूबे 20x उद्देश्य का उपयोग करें।
    9. सबसे बड़े नमूना धारक में agarose एम्बेडेड organoid युक्त सिरिंज डालें जो एक 1 mL सिरिंज को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें से प्लंजर को उद्देश्य के सामने ऑर्गेनोइड की स्थिति के लिए संचालित किया जा सकता है।
      नोट: एक पूरे ऑर्गेनोइड के लाइट शीट अधिग्रहण में लगभग 5 से 10 मिनट लगते हैं।

4. Immunostaining और पृष्ठीय forebrain organoids के मुक्त फ्लोटिंग वर्गों के समाशोधन

  1. निर्धारण, agarose एम्बेडिंग, और organoids के विभाजन
    1. 28, 42, और 70 +/- 2 दिनों के भेदभाव के बाद ऑर्गेनोइड्स को 6-वेल प्लेट में इकट्ठा करें और 4% पीएफए के 2 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर ठीक करें।
    2. पीबीएस के 2 एमएल में दो बार कुल्ला करें और पीबीएस के 2 मिलीलीटर + 0.05% सोडियम एज़ाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षण करें।
    3. एक प्लास्टिक एम्बेडिंग मोल्ड (7 x 7 मिमी) में 4% कम पिघलने वाले agarose में निश्चित organoids एम्बेड करें। ध्यान से प्लास्टिक मोल्ड से agarose ब्लॉक को हटाने और vibratome चरण के लिए यह गोंद.
    4. अनुभाग एम्बेडेड organoids एक vibratome का उपयोग करने के लिए 150 μm मुक्त फ्लोटिंग वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित एक 24-अच्छी तरह से प्लेट युक्त PBS के 500 μL एक पेंटब्रश का उपयोग कर वर्गों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए.
      नोट: कम पिघलने वाले agarose की सिफारिश की जाती है क्योंकि इसका पिघलने का तापमान केवल लगभग 60 डिग्री सेल्सियस है। पीबीएस समाधान में 4% कम पिघलने वाले एगारोज़ तैयार करें और ऑर्गेनोइड एम्बेडिंग से पहले पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस से ऊपर ठंडा होने के लिए छोड़ दें।
  2. Permeabilization, अवरुद्ध, और immunostaining
    1. 20 मिनट के लिए आंदोलन के तहत, आरटी पर 0.3% ट्राइटन X100 युक्त पीबीएस के 500 μL में वर्गों को इनक्यूबेट करें। ऐसा तीन बार करें।
    2. 0.3% Triton X100 और 5% nonfat दूध युक्त PBS के 500 μL में वर्गों को इनक्यूबेट, आरटी पर, आंदोलन के तहत, 2 घंटे के लिए।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (PBS + 0.3% Triton X100 + 1% nonfat Milk) के 250 μL में वर्गों को इनक्यूबेट करें, आंदोलन के तहत, +4 °C पर, रात भर।
    4. पीबीएस के 500 μL में वर्गों को धोएं, आरटी पर, आंदोलन के तहत, 20 मिनट के लिए। ऐसा चार बार करें।
    5. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान (PBS + 0.3% Triton X100 + 1% nonfat दूध) के 250 μL में वर्गों को इनक्यूबेट करें, RT पर, आंदोलन के तहत, 2 घंटे के लिए।
    6. पीबीएस के 500 μL में वर्गों को धोएं, आरटी पर, आंदोलन के तहत, 20 मिनट के लिए। ऐसा चार बार करें।
    7. समाशोधन तक +4 ° C पर PBS के 500 μL में वर्गों को स्टोर करें।
  3. टीडीई में समाशोधन (2,2' -Thiodiethanol)
    1. 30% के 500 μL और 60% TDE में RT पर प्रत्येक 1 h के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें, और फिर RT पर, रात भर में 80% TDE के 500 μL में।
    2. 80% TDE के 500 μL में साफ़ किए गए अनुभागों को तब तक संग्रहीत करें जब तक कि +4 °C पर अधिग्रहण न हो जाए।
  4. अनुनादी स्कैनिंग confocal के साथ अधिग्रहण से पहले मुक्त फ्लोटिंग वर्गों के बढ़ते
    1. 80% TDE समाधान में नमूने को बनाए रखने के लिए सक्षम एक सील कक्ष में एक मुक्त-फ्लोटिंग अनुभाग माउंट करें और confocal माइक्रोस्कोप के एक motorized XY चरण पर अनुकूलित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
    2. कक्ष प्रणाली में एक दौर coverslip रखो.
    3. ध्यान से एक पेंटब्रश का उपयोग कर साफ immunostained अनुभाग हस्तांतरण.
    4. 80% TDE समाधान के साथ कक्ष भरें।
    5. दो मानक coverslips प्लस एक दूसरे दौर coverslips और एक सिलिकॉन सील जोड़ें.
    6. पूरी तरह से प्रणाली को सील करने के लिए कक्ष की पेंच अंगूठी पर पेंच।

5. लाइट शीट और अनुनादी स्कैनिंग confocal विश्लेषण

  1. 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और पूरे immunostained नमूने के विश्लेषण को सक्षम करने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रकाश शीट और अनुनादी स्कैनिंग अधिग्रहण को संसाधित करें।
    नोट: इस तरह के सॉफ़्टवेयर आसानी से स्नैपशॉट और एनिमेशन बनाने के लिए विशाल डेटा को जल्दी से खोलने की अनुमति देता है। यह विभिन्न अभिविन्यासों में नमूने को स्थानांतरित करने और उदाहरण के लिए विभिन्न अभिविन्यासों, XY और YZ में एक 2 डी स्लाइसर उपकरण के लिए 2 डी दृश्यों को उत्पन्न करने की अनुमति देता है।
  2. दोनों centrosomes और प्राथमिक सिलिया का स्वत: पता लगाने के लिए, एक स्पॉट विज़ार्ड का उपयोग करें जो पैथोलॉजिकल बनाम नियंत्रण स्थितियों में उनकी संख्या को मापने में सक्षम बनाता है।
  3. अपनी लंबाई के सटीक माप को सक्षम करने वाले पीसी के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, पीसी के शुरुआती बिंदु को मैन्युअल रूप से ठीक करने के लिए एक फिलामेंट विज़ार्ड का उपयोग करें और सॉफ्टवेयर पीसी को ठीक से पुनर्निर्माण करने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग करता है।

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Representative Results

प्राथमिक सिलियम बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए 2 डी एचआईपीएस सेल-आधारित मॉडल
यहां विस्तृत प्रोटोकॉल को पहले प्रकाशित अध्ययन20,21,22 से अनुकूलित किया गया है। यह प्रोटोकॉल तंत्रिका रोसेट संरचनाओं की पीढ़ी की अनुमति देता है जिसमें नियोकॉर्टिकल पूर्वज और न्यूरॉन्स होते हैं जो विकासशील नियोकॉर्टेक्स में देखे गए लोगों के समान होते हैं। विस्तृत सत्यापन विशिष्ट निर्माताओं का उपयोग करके पारंपरिक immunostaining विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है3. उदाहरण के लिए, एपिकल पूर्वजों (एपी) को SOX2 और PAX6 के साथ डबल-दाग होना चाहिए, मध्यवर्ती पूर्वजों (आईपी) को TBR2 / EOMES धुंधला द्वारा प्रकट किया जाता है, और प्रारंभिक जन्म वाले नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स को सीटीआईपी 2 स्टेनिंग (चित्रा 1 ए-सी) द्वारा प्रकट किया जाता है। इस तरह के तंत्रिका रोसेट जैसी संरचनाएं एपी के इंटरकाइनेटिक परमाणु प्रवास (आईएनएम) को मॉडल करती हैं जिन्हें फॉस्फो-विमेंटिन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है, जो माइटोटिक नाभिक और टीपीएक्स 2 को दागता है जो माइटोटिक स्पिंडल को दागता है। इसलिए, ये मार्कर एपी की कई विशेषताओं के विश्लेषण की अनुमति देते हैं, जिसमें सेल विभाजन के साथ आईएनएम भी शामिल है, जो केंद्रीय लुमेन (चित्रा 1 डी, डी') के आसपास एपिकल रूप से जगह लेता है, साथ ही साथ डिवीजन प्लेन और एपिकल सतह के बीच के कोण को मापने के द्वारा निर्धारित विभाजन मोड भी शामिल है। अंत में, ciliogenesis PCNT के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ immunostaining द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, जो पीसी के बेसल शरीर को दाग देता है, और ARL13B जो axoneme को दागता है। इस तरह के रोसेट संरचनाओं पर, पीसी एपी के एपिकल पोल से प्रत्येक वेंट्रिकल जैसे क्षेत्र (चित्रा 1ई, ई') के केंद्रीय लुमेन में विस्तारित होता है, जबकि वे सीटीआईपी 2 + न्यूरॉन्स (चित्रा 1 ई') से भी निकल रहे हैं।

इन रोसेट संरचनाओं का पृथक्करण एक उच्च घनत्व पर एनएमएम में पॉली-एल-ऑर्निथिन / लैमिनिन-लेपित संस्कृति प्लेटों पर सुसंस्कृत पृथक एनएसपीसी प्राप्त करने की अनुमति देता है ताकि कैरियोटाइप असामान्यताओं को जमा किए बिना कम से कम 15 मार्गों के लिए एनएसपीसी की एक स्थिर और विस्तार योग्य आबादी के रखरखाव की अनुमति मिल सके21,27। पीसी बायोजेनेसिस का विश्लेषण करने के लिए, विघटित एनएसपीसी को संगम के लिए सुसंस्कृत किया जाता है और 48 घंटे के लिए भूखा रखा जाता है। पीसी मार्करों के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोस्टेनिंग विश्लेषण से पता चलता है कि उन एनएसपीसी पीसी (चित्रा 2 ए) को हार्बर करते हैं। दो पूरक ओपन-सोर्स टूल, इलास्टिक, पीसी सेगमेंटेशन 28 और सिलियाक्यू के लिए उपयोगी एक मशीन-लर्निंग-आधारित छवि विश्लेषण उपकरण के संयोजन से, एक फिजी / इमेजजे प्लगइन पैकेज 29, जो 3 डी कॉन्फोकल इमेज स्टैक से पीसी के 3 डी पुनर्निर्माण को सक्षम करता है, कई संरचनात्मक मापदंडों का आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें पीसी की संख्या और उनकी लंबाई शामिल है।

एनएसपीसी के पीसी फ़ंक्शन का मूल्यांकन हेजहोग सिग्नलिंग मार्ग के ट्रांसडक्शन का परीक्षण करके भी किया जा सकता है। एसएचएच सिग्नलिंग मार्ग के ट्रांसडक्शन का आकलन करने के लिए, एनएसपीसी को 48 घंटे के लिए भूखा रखा जाता है और 24 घंटे के लिए पुनः संयोजक एसएचएच (आरएसएचएच) या एक चिकनी एगोनिस्ट (एसएजी) के साथ इलाज किया जाता है। GPR161, SMO, और GLI2 के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, immunofluorescent (IF) विश्लेषण पीसी के साथ इन प्रमुख SHH सिग्नलिंग अभिनेताओं की तस्करी का परीक्षण करने की अनुमति देता है, GPR161 के साथ आमतौर पर पीसी से बाहर निकलता है जबकि GLI2 और SMO SHH Pathway activation (चित्रा 2C-D) के जवाब में पीसी के भीतर जमा होते हैं। CiliaQ उपकरण ों का उपयोग करके 3 D confocal छवि स्टैक का विश्लेषण GPR161 को पीसी से बाहर निकलने के साथ-साथ GLI2 और SMO संचय को एसएचएच मार्ग सक्रियण (चित्रा 2F-G) के बाद पीसी के भीतर परिमाणित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, आरएसएचएच- या एसएजी-उपचारित एनएसपीसी से निकाले गए एमआरएनए पर अर्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण दो एसएचएच लक्ष्य जीन, जीएलआई 1 और पीटीसीएच 1 के प्रेरण को दर्शाता है, जो नियंत्रण एचआईपीएससी (चित्रा 2 बी) से व्युत्पन्न एनएसपीसी में सामान्य एसएचएच सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन के लिए प्रमाणित करता है।

कुल मिलाकर, पृष्ठीय फोरब्रेन विकसित करने के 2 डी सेल-आधारित मॉडल स्पष्ट रूप से सामान्य सेरेब्रल कॉर्टेक्स विकास के कई पहलुओं को पुन: पेश करते हैं और नियंत्रण बनाम रोगी एचआईपीएससी का उपयोग करके नियोकॉर्टिकल विकास की अंतर्निहित विसंगतियों को विच्छेदित करने के लिए पीसी से जुड़े तंत्र को विच्छेदित करने के लिए आशाजनक उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो सेरेब्रल कॉर्टेक्स के मानव विकास विसंगतियों के लिए जिम्मेदार जीन में उत्परिवर्तन को रोकते हैं।

नियोकॉर्टिकल विकास के दौरान प्राथमिक सिलियम भागीदारी का अध्ययन करने के लिए 3 डी एचआईपीएस सेल-आधारित मॉडल
यहां वर्णित प्रोटोकॉल (चित्रा 3 ए) को पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल 23,24,25,26,30 से अनुकूलित किया गया है और पांच अलग-अलग नियंत्रण hIPSC लाइनों पर सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है। यह hIPSC-व्युत्पन्न पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी की अनुमति देता है जो समय के साथ आकार में वृद्धि करते हैं, जबकि बड़े न्यूरोएपिथेलियल लूप (चित्रा 3 बी) बनाते हैं। Immunolabeling विश्लेषण या तो organoid cryosections (cryostat, 20 μm), मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों (वाइब्रेटोम, 150 μm), या टोटो में, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए किया जा सकता है। दिन 28 ± 2 पर, ऑर्गेनोइड्स में स्तरीकृत न्यूरोएपिथेलियल लूप होते हैं जो तंत्रिका पूर्वज मार्कर SOX2 और पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क मार्कर PAX6 को सह-व्यक्त करते हैं, जो पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क पहचान के लिए प्रमाणित करते हैं। दिन 42 ± 2 (भेदभाव के 6 सप्ताह) में, उन छोरों को एक अधिक जटिल स्तरीकृत संगठन प्रदर्शित करना चाहिए। एपिकल से इन लूप संरचनाओं की बेसल सतह तक, एक वेंट्रिकुलर ज़ोन (वीजेड) जैसे क्षेत्र में SOX2 / PAX6-पॉजिटिव एपिकल रेडियल ग्लियाल पूर्वजों (एआरजी) के साथ-साथ एक सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) जैसे क्षेत्र को भी चित्रित किया जा सकता है- टीबीआर 2-पॉजिटिव इंटरमीडिएट पूर्वजों (आईपी) और एक कॉर्टिकल प्लेट (सीपी) जैसे क्षेत्र में सीटीआईपी 2-पॉजिटिव अर्ली-बोर्न नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स (चित्रा 3 सी, ई)। एआरजी की एपिकल आणविक ध्रुवीयता का मूल्यांकन ZO-1 और N-CADH (चित्रा 4A, वीडियो 1) की वेंट्रिकुलर सतह पर एपिकल संवर्धन द्वारा किया जा सकता है। एआरजी पूर्वज विभाजन गुणों का मूल्यांकन TP2X और P-VIM मार्करों का उपयोग करके INM का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है जो आमतौर पर कॉर्टिकल लूप (चित्रा 4B, वीडियो 2) की वेंट्रिकुलर सतह पर एआरजी माइटोटिक नाभिक के संरेखण की ओर जाता है। इस तरह के immunolabeling भी विभाजन कोण के माप की अनुमति देता है करने के लिए सममित बनाम असममित विभाजन मोड का मूल्यांकन करने के लिए aRG. पी-विम सकारात्मक पूर्वजों को एसवीजेड जैसे क्षेत्र में भी देखा जा सकता है, जो बाहरी रेडियल ग्लिया (ओआरजी या बेसल रेडियल ग्लिया, चित्रा 4 सी, वीडियो 2) की याद दिलाने वाली बेसल सतह तक फैली एक अनूठी बेसल प्रक्रिया को आश्रय देता है। जबकि वे दिन 42 ऑर्गेनोइड्स से अनुपस्थित हैं, SATB2 सकारात्मक देर से पैदा हुए न्यूरॉन्स को दिन 70 (भेदभाव के 10 सप्ताह) (चित्रा 3 डी, एफ) से पता लगाया जाना चाहिए, जो नियोकॉर्टिकल न्यूरोनल भेदभाव के विवो-जैसे समय के लिए प्रमाणित करता है।

बेसल बॉडी (गामा ट्यूबुलिन) और एक्सोनेम (एआरएल 13 बी) मार्करों का उपयोग करके इम्युनोलेबलिंग प्रयोग 20 μm क्रायोसेक्शन (चित्रा 3 जी, एच) पर पीसी के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं। पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स के 3 डी संगठन का लाभ उठाने के लिए, पूरे-माउंट इम्युनोस्टेनिंग का प्रदर्शन किया जा सकता है। टोटो immunostained और साफ organoids में इस तरह के प्रकाश शीट अधिग्रहण दोनों NSPC प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neocortical न्यूरॉन्स (वीडियो 3) पर centrosomes और पीसी का पता लगाने की अनुमति देता है. इसके अलावा, पीसी बायोजेनेसिस के अधिक सटीक विश्लेषण करने के लिए, पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स के फ्री-फ्लोटिंग मोटे वर्गों (150 μm) पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण किया जा सकता है। समाशोधन के बाद, इस तरह के वर्गों को एक 40x (एनए 1.3) या 63x (एनए 1.4) एक उल्टे अनुनादी सफेद प्रकाश कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप के तेल उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित किया जा सकता है, जिससे ऑर्गेनोइड्स की 3 डी स्थानिक जानकारी को संरक्षित करते हुए रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने की अनुमति मिलती है। इस तरह के लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप एक सटीक और लचीला उत्तेजना और किसी भी हस्तक्षेप के बिना पता लगाने के साथ मोटे वर्गों के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम बनाता है (वीडियो 4). पीसी के कई संरचनात्मक मापदंडों का मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें पीसी नंबर, लंबाई और अभिविन्यास शामिल हैं, 3 डी-इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके। समर्पित ओपन-सोर्स, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरण जैसे कि Ilastik28, एक मशीन-लर्निंग-आधारित छवि विश्लेषण उपकरण के साथ-साथ फिजी / ImageJ29 पर सिलियाक्यू प्लगइन पैकेज स्वचालित पीसी विभाजन के लिए अत्यधिक उपयोगी हैं जो पीसी बायोजेनेसिस के बाद के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है और नियंत्रण बनाम रोग स्थितियों में कार्य करता है।

Figure 1
चित्रा 1: पीढ़ी और 2 डी तंत्रिका rosettes के लक्षण वर्णन. AP का पता लगाने के लिए (A) SOX2 और PAX6 एंटीबॉडी का उपयोग करके तंत्रिका रोसेट संरचनाओं के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लक्षण वर्णन, (बी) आईपी को प्रकट करने के लिए TBR2 / EOMES, और (सी) CTIP2 जल्दी पैदा हुए नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स को दागने के लिए। AP को फॉस्फो-विमेंटिन और TPX2 एंटीबॉडी के साथ पाया जाता है और एपिकल सतह (डी, डी') पर स्थित होते हैं। पीसी PCNT और ARL13B एंटीबॉडी के साथ डबल immunostaining द्वारा पता चला है। पीसी प्रत्येक एपी से प्रत्येक रोसेट के केंद्रीय लुमेन में विस्तारित होता है, जबकि वे आईपी और शुरुआती पैदा हुए न्यूरॉन्स (ई, ई', ई') पर भी पाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 2 डी तंत्रिका rosettes बंदरगाह कार्यात्मक पीसी से व्युत्पन्न अलग एनएसपीसी. 2 डी-न्यूरल रोसेट का पृथक्करण 48 घंटे के लिए भुखमरी के बाद पीसी को आश्रय देने वाले अलग-अलग एनएसपीसी को जन्म देता है जैसा कि एआरएल 13 बी और पीसीएनटी इम्युनोस्टेनिंग (ए) द्वारा पता चला है। एनएसपीसी कार्यात्मक पीसी को बंदरगाह करते हैं जैसा कि दो एसएचएच लक्ष्य जीन जीएलआई 1 और पीटीसीएच 1 के आरटी-पीसीआर परिमाणीकरण द्वारा 48 घंटे के लिए भुखमरी के बाद और 24 घंटे के लिए पुनः संयोजक एसएचएच (आरएसएचएच) के साथ उपचार द्वारा मार्ग के बाद के सक्रियण से पता चला है। डेटा का विश्लेषण 2-ΠCt विधि के साथ किया गया था और SEM (Mann Whitney test) (B) ± सापेक्ष अभिव्यक्ति के रूप में प्रस्तुत किया गया था। (डी) के साथ या बिना (सी) आरएसएचएच उपचार के साथ भूखे एनएसपीसी पर विश्लेषण एसएचएच सिग्नलिंग मार्ग, जीएलआई 2 और जीपीआर 161 के दो महत्वपूर्ण अभिनेताओं की गतिशीलता का परीक्षण करने के लिए, जो क्रमशः एसएचएच मार्ग सक्रियण के बाद पीसी को जमा या बाहर निकालते हैं। Confocal छवियों के विश्लेषण के लिए Ilastik और CiliaQ उपकरण ों के संयोजन से, PC के भीतर GPR161 (F) और GLI2 (G) सिग्नल तीव्रता की तुलना +/- rSHH उपचारित NSPCs में की गई थी। ARL13B धुंधला पीसी विभाजन के लिए उपयोग किया गया था, और जैसा कि अपेक्षित पीसी लंबाई +/- rSHH उपचारित NSPCs (E) में अपरिवर्तित थी। डेटा को बॉक्स और व्हिस्कर प्लॉट्स (SEM ± मतलब मान) में संक्षेप ति किया जाता है। पी < 0.0001 (मान व्हिटनी परीक्षण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन और लक्षण वर्णन। (ए) पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। (बी) विभेदन के 1, 3, 7, 24, और 42 दिनों में ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। दिन 42 (सी) और 70 (डी) में ऑर्गेनोइड्स के 20 μm क्रायोसेक्शन की कन्फॉकल छवियां SOX2, TBR2, और CTIP2 एंटीबॉडी के साथ immunostaining के बाद, क्रमशः, वेंट्रिकुलर ज़ोन (VZ), सबवेंट्रिकुलर ज़ोन (SVZ) जिसमें TBR2 सकारात्मक आईपी होता है, और प्रीप्लेट-जैसे क्षेत्र (सीपी) जिसमें CTIP2 सकारात्मक प्रारंभिक जन्म वाले नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स होते हैं। PAX6, CTIP2, और SATB2 एंटीबॉडी के साथ immunostaining के बाद दिन 42 (ई) और 70 (एफ) पर ऑर्गेनोइड्स के 20 μm cryosections की कन्फॉकल छवियां 70 दिन में SATB2 सकारात्मक देर से पैदा हुए न्यूरॉन्स की उपस्थिति दिखाती हैं। ARL13B और PCNT एंटीबॉडी रेडियल ग्लियाल पूर्वजों (जी) के एपिकल पोल पर पीसी का खुलासा करने के बाद दिन 42 पर एक ऑर्गेनोइड के 20 μm क्रायोसेक्शन के 20 μm क्रायोसेक्शन की कन्फॉकल छवियां, जबकि वे सीटीआईपी 2 सकारात्मक न्यूरॉन्स (एच) पर भी मौजूद हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की 3 डी इमेजिंग( ए) एक पूरे पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड (दिन 42) का प्रकाश शीट अधिग्रहण PAX6, N-CADH, और CTIP2 एंटीबॉडी के साथ कई न्यूरोएपिथेलियल लूप दिखा रहा है जो PAX6 सकारात्मक रेडियल ग्लियाल पूर्वजों के साथ कई न्यूरोएपिथेलियल लूप दिखाता है, जो सही एपिकोबेसल ध्रुवीयता का प्रदर्शन करता है जैसा कि उनके एपिकल साइड में एन-कैडरिन के संचय से पता चलता है और CTIP2 सकारात्मक प्रारंभिक जन्मे नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स एक प्रीप्लेट-जैसे क्षेत्र को चित्रित करते हैं। (बी) एक पूरे पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड (दिन 42) का प्रकाश पत्रक अधिग्रहण TPX2, P-Vim, और CTIP2 एंटीबॉडी के साथ दाग वेंट्रिकुलर रेडियल ग्लियाल पूर्वजों के इंटरकाइनेटिक परमाणु प्रवास को दर्शाता है। (सी) एक पूरे पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड (दिन 42) के प्रकाश शीट अधिग्रहण पर ज़ूम करें जो टीपीएक्स 2 और पी-विम एंटीबॉडी के साथ सना हुआ है, जो एक पूर्वज को एक अद्वितीय बेसल प्रक्रिया का विस्तार करता है और सबवेंट्रिकुलर ज़ोन में स्थानीयकृत होता है, जो एक बाहरी रेडियल ग्लियाल पूर्वज की याद दिलाता है। (डी) एक पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड (दिन 42) के 150 μm अनुभाग का अनुनादी स्कैनर अधिग्रहण PCNT और ARL13B एंटीबॉडी एनएसपीसी और नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स में पीसी दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सेरेब्रल कॉर्टिकल विसंगतियों के पैथोफिजियोलॉजी में पीसी भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क विकास के 2 डी और 3 डी एचआईपीएस सेल-आधारित मॉडल का उत्पादन और लक्षण वर्णन। एचपीपीएस कोशिकाओं को कम आसंजन संस्कृति प्लेटों में भ्रूण निकायों (ईबी) बनाने की अनुमति दी जाती है, और फिर न्यूरोइक्टोडर्मल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए दोहरे एसएमएडी अवरोधकों वाले एक प्रेरण माध्यम में इनक्यूबेट किया जाता है। पीओ / लैम-लेपित व्यंजनों में ईबी का आसंजन 2 डी तंत्रिका रोसेट संरचनाओं की पीढ़ी की अनुमति देता है जबकि बीएमएम में बाद में एम्बेडिंग के साथ ईबी की मुक्त-फ्लोटिंग संस्कृति पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी की अनुमति देती है। अनुयायी तंत्रिका रोसेट माध्यम से माइटोजेनिक कारकों की वापसी न्यूरोजेनेसिस की शुरुआत को बढ़ावा देती है जिसे आईएफ विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। अनुयायी तंत्रिका rosettes के पृथक्करण पीसी biogenesis और समारोह विश्लेषण के लिए उपयोगी अलग एनएसपीसी संस्कृतियों की पीढ़ी की अनुमति देता है। पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को 4, 6, या 10 सप्ताह के भेदभाव के बाद एकत्र किया जाता है और बाद के इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण के लिए तय किया जाता है, या तो टोटो में, 150 μm मोटे वर्गों, या 20 μm क्रायोसेक्शन पर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: एक पूरे पृष्ठीय forebrain organoid (दिन 42) PAX6, CTIP2, और NCADH एंटीबॉडी के साथ immunostained की लाइट शीट अधिग्रहण. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: TPX2, P-VIM, और CTIP2 एंटीबॉडी के साथ immunostained एक पूरे पृष्ठीय forebrain organoid (दिन 42) के प्रकाश शीट अधिग्रहण. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 3: एक पूरे पृष्ठीय forebrain organoid (दिन 42) PCNT और ARL13B एंटीबॉडी के साथ immunostained की प्रकाश शीट अधिग्रहण. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 4: अनुनादी स्कैनिंग एक पृष्ठीय forebrain organoid (दिन 42) ARL13B और PCNT एंटीबॉडी के साथ immunostained के एक 150 μm अनुभाग के confocal अधिग्रहण. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइलें: तालिकाओं को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: 2 डी-न्यूरल रोसेट और एनएसपीसी की पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया का नुस्खा।

अनुपूरक तालिका 2: पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया का नुस्खा।

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Discussion

पीसी को अब सामान्य सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास के दौरान महत्वपूर्ण चरणों को विनियमित करने वाले प्रमुख ऑर्गेनेल के रूप में माना जाता है18,19,31 एनएसपीसी विस्तार और प्रतिबद्धता 8,9,10,11,12 के साथ-साथ न्यूरोनल माइग्रेशन 13,14 और synaptogenesis16,17 सहित . पशु मॉडल या मानव भ्रूण सेरेब्रल ऊतकों में विश्लेषण के अलावा, नियोकॉर्टिकल विकास के अत्यधिक अभिनव और प्रासंगिक रोगी-व्युत्पन्न hIPSC-आधारित मॉडल की पीढ़ी सामान्य और पैथोलॉजिकल सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास दोनों के दौरान पीसी की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए आवश्यक है।

यहां विस्तृत 2 डी एचआईपीएससी-आधारित मॉडलिंग प्रोटोकॉल को तीन प्रमुख प्रकाशनों 20,21,22 से अनुकूलित किया गया था। न्यूरोएपिथेलियल भेदभाव दोहरी एसएमएडी निषेध द्वारा प्रेरित होता है जो एक्टिविन / नोडल (एसबी -431542) और बीएमपी (एलडीएन -193189) मार्गों के छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करता है। कोशिकाओं को रोसेट के आकार की संरचनाओं में व्यवस्थित किया जाता है जिसमें एनएसपीसी के साथ-साथ नियोकॉर्टिकल गहरी परत न्यूरॉन्स होते हैं, जो 20 दिनों के भेदभाव के बाद होते हैं। इसके अलावा, इन rosette जैसी संरचनाओं सही apicobasal polarity, एपिकल पूर्वजों के interkinetic परमाणु प्रवास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सभी NSPCs और न्यूरॉन्स से विस्तार पीसी दिखाने के लिए. इन रोसेट संरचनाओं के पृथक्करण के बाद, कॉर्टिकल पूर्वजों की एक सजातीय और स्थिर आबादी प्राप्त की जाती है21। जब संगम के लिए सुसंस्कृत और 48 ज के लिए भूखे, उन cortical पूर्वजों को पीसी बंदरगाह जिसके लिए आकृति विज्ञान, संख्या, और लंबाई आसानी से Ilastik28 और CiliaQ28,29 फिजी / ImageJ पर प्लगइन पैकेज के संयोजन से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, एसएचएच सिग्नलिंग मार्ग को प्रेरित करने के लिए साइटोकिन्स का उपयोग करके, पीसी फ़ंक्शन का उपयोग आईएफ द्वारा पीसी के साथ महत्वपूर्ण सिग्नलिंग पाथवे अभिनेताओं की गतिशीलता का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है जैसे कि जीएलआई 2, एसएमओ और जीपीआर 161। इसके अलावा, अर्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर assays SHH मार्ग सक्रियण के जवाब में GLI1 और PTCH1 सहित SHH लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के प्रेरण के परीक्षण को सक्षम करते हैं। पीसी फ़ंक्शन पर निर्भर अन्य सिग्नलिंग मार्गों का भी परीक्षण किया जाना चाहिए, जिसमें WNT और IGF pathways2,32,33 शामिल हैं। इस 2 डी मॉडलिंग दृष्टिकोण पर निष्कर्ष निकालने के लिए, जो स्पष्ट रूप से सामान्य सेरेब्रल कॉर्टेक्स विकास के कई पहलुओं को पुन: पेश करता है, यह पीसी बायोजेनेसिस के परीक्षण के लिए एक उपयोगी और प्रासंगिक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और सामान्य बनाम रोग संबंधी स्थितियों में कार्य करता है और नियोकॉर्टिकल विकास के दौरान पीसी की भागीदारी में आगे की अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में योगदान करना चाहिए।

2 डी एचआईपीएससी-आधारित मॉडलिंग दृष्टिकोणों के पूरक, पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स विट्रो में सामान्य और पैथोलॉजिकल सेरेब्रल विकास की जांच करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं क्योंकि वे शुरुआती विकासशील मानव सेरेब्रल कॉर्टेक्स की कई विशेषताओं और विशेषताओं को दोहराते हैं। वर्तमान में दो मुख्य प्रकार के प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है: आंतरिक और निर्देशित तरीके। लैंकेस्टर और सहकर्मियों द्वारा विकसित आंतरिक प्रोटोकॉल 23 आईपीएससी की आंतरिक क्षमता पर निर्भर करता है ताकि कम से कम बाहरी कारकों के साथ आत्म-संगठित किया जा सके और विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच बातचीत को मॉडल करने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करने वाले मस्तिष्क के अलग-अलग क्षेत्रों के रूडिमेंट्स वाले सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को जन्म देता है। हालांकि, इस तरह की मॉडलिंग रणनीति के लिए अंतर्निहित उच्च परिवर्तनशीलता और विषमता पुनरुत्पादन की महत्वपूर्ण चुनौतियों को प्रस्तुत करती है। निर्देशित ऑर्गेनोइड भेदभाव प्रोटोकॉल मस्तिष्क क्षेत्र-विशिष्ट ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी को न्यूनतम विषमता 24,25,26 के साथ अनुमति देते हैं। इस दृष्टिकोण ने हमें वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के साथ पृष्ठीय फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने की अनुमति दी जो प्रारंभिक मानव सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास की प्रमुख प्रक्रियाओं को दोहराते हैं। पहला महत्वपूर्ण मुद्दा उच्च गुणवत्ता वाली एचआईपीएससी संस्कृतियों के साथ शुरू करना है जो बड़े नियमित उपनिवेशों को 10% से कम भेदभाव प्रदर्शित करते हैं और जिन्हें एकल-सेल संस्कृति स्थितियों के लिए एचआईपीसी को अनुकूलित करने के लिए लगभग एक मोनोलेयर के रूप में पारित किया गया है। दरअसल, ऑर्गेनोइड विषमता को सीमित करने के लिए, क्षेत्र में प्रमुख चुनौतियों में से एक, एक सजातीय आकार के साथ ईबी का गठन एक शर्त है जो एक शर्त है जिसका तात्पर्य है कि एकल-सेल निलंबन में एचआईपीएससी कॉलोनियों के पृथक्करण की आवश्यकता है जो परिभाषित सेल घनत्व पर सीडिंग की अनुमति देता है। एक और महत्वपूर्ण कदम बीएमएम ईबी को शामिल करना है, जो 3 डी संरचना और न्यूरोएपिथेलियल विस्तार का समर्थन करने के लिए आवश्यक है। हमने व्यक्तिगत समावेश पर लगभग पंद्रह ऑर्गेनोइड्स के समूह को शामिल करने का समर्थन किया, भले ही इसमें एक अतिरिक्त कदम शामिल हो, बीएमएम पृथक्करण। मिलाते हुए संस्कृति से पहले बीएमएम पृथक्करण को ऑर्गेनोइड बैचों के भीतर और उनके बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए दिखाया गया है, इस प्रकार उच्च पुनरुत्पादकता 34 के परिणामस्वरूप। इसके अलावा, यह बीएमएम में विस्तारित सेल प्रक्रियाओं से छुटकारा पाने की अनुमति देता है जो निम्नलिखित भेदभाव चरणों के लिए हानिकारक नहीं हैं, लेकिन जो प्रक्रिया के बाद के चरणों के दौरान गुणवत्ता निरीक्षण के लिए ऑर्गेनोइड्स का निरीक्षण करना मुश्किल बनाते हैं। पोषण अवशोषण और ऑक्सीजन विनिमय में सुधार करने के लिए, हमने ऑर्बिटल शेकर्स और कताई बायोरिएक्टर पर ऑर्गेनोइड परिपक्वता की तुलना की, जिसके समान परिणाम हुए। इसलिए, हमने कक्षीय शेकर विकल्प को चुना, क्योंकि यह मध्यम मात्रा को काफी कम करने की अनुमति देता है और इसलिए प्रयोगों की कुल लागत। महत्वपूर्ण रूप से, एक कक्षीय शेकर पर स्थिर और मिलाते हुए संस्कृति के लिए एक अलग इनक्यूबेटर का उपयोग करें ताकि अनुयायी hIPSC विकास के लिए हानिकारक किसी भी कंपन से बचा जा सके। हमने इस प्रोटोकॉल को पांच अलग-अलग नियंत्रण hIPSC lines35 पर सफलतापूर्वक लागू किया जो इस प्रक्रिया की मजबूती सुनिश्चित करने वाले सजातीय परिणामों को जन्म देते हैं।

इस तरह के ऑर्गेनोइड्स के लक्षण वर्णन को कई तरीकों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स के भीतर 3 डी स्थानिक जानकारी को संरक्षित करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है जो बाद के प्रकाश शीट अधिग्रहण के साथ पूरे-माउंट इम्युनोस्टेनिंग और पूरे ऑर्गेनोइड्स को साफ करने की अनुमति देता है। नमूना मूल और मोटाई 36,37 के आधार पर दक्षता के साथ विभिन्न समाशोधन विधियां उभरी हैं। यहां, हमने एक सरल, तेज और लागत प्रभावी समाशोधन विधि स्थापित की है जो टीडीई (2,2'-थायोडेथेनॉल) पर निर्भर करती है, एक ग्लाइकोल व्युत्पन्न जो पहले माउस मस्तिष्क और आंतों के ऑर्गेनोइड्स 38,39 को साफ करने के लिए उपयोग किया जाता था। immunostained और साफ organoids के अधिग्रहण एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप पर 80% TDE में डूबे एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. अन्य 3 डी इमेजिंग अधिग्रहण विधियों की तुलना में, लाइट शीट माइक्रोस्कोपी कई कारणों से ब्याज की है: तेजी से अधिग्रहण, अच्छा प्रवेश, और कम फोटोब्लीचिंग। Permeabilization चरण का अनुकूलन कुशल और सजातीय एंटीबॉडी प्रवेश तक पहुंचने में सक्षम बनाता है जो बेसल निकायों और पीसी के एक्सोनेम्स को पूरे ऑर्गेनोइड के सभी पूर्वजों और न्यूरोनल सेल प्रकारों से विस्तारित करने की कल्पना करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, 40x (एनए 1.3) या 63x (एनए 1.4) तेल उद्देश्यों के साथ एक उल्टे अनुनादी स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्री-फ्लोटिंग 150 μm मोटे वर्गों का अधिग्रहण 3 डी स्थानिक जानकारी की एक महत्वपूर्ण डिग्री को संरक्षित करते हुए, और पीसी बायोजेनेसिस और फ़ंक्शन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हुए, संकल्प में आगे बढ़ने में सक्षम बनाता है।

इस तरह के 2 डी और 3 डी सेल-आधारित मॉडल और 3 डी इमेजिंग विश्लेषण (चित्रा 5) के संयोजन से या तो सिलियोपैथी रोगी कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम करके या विशेष रूप से सेंट्रोसोमल या सिलियरी जीन को संपादित करने के लिए CRISPR / CAS9 तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न एचआईपीएससी पर सेरेब्रल कॉर्टेक्स के सामान्य और रोग संबंधी विकास के दौरान पीसी के योगदान की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति की अनुमति देनी चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, जीनोम संपादन तकनीक भी विशेष रूप से रोगी उत्परिवर्तन को बचाने के लिए isogenic नियंत्रण hIPSCs प्राप्त करने के लिए आनुवंशिक विषमता है कि रोग तंत्र का पता लगाने को चुनौती देने के लिए दूर करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, एकल-सेल जीनोमिक दृष्टिकोण अब पूरे क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं और इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण के लिए प्रासंगिक और पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस प्रकार, सभी उभरती प्रौद्योगिकियों में निहित कुछ सीमाओं और कठिनाइयों के बावजूद, और जिन्हें बड़े पैमाने पर संबोधित किया जा रहा है, जैसे कि 2 डी और 3 डी एचआईपीएससी-आधारित मॉडल और हमारे द्वारा प्रस्तुत लक्षण वर्णन विधियां यहां प्रस्तुत की गई लक्षण वर्णन विधियां मानव विकासात्मक नियोकॉर्टिकल विसंगतियों के अंतर्निहित रोग तंत्र में पीसी की भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए शक्तिशाली और प्रासंगिक उपकरण प्रदान करती हैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को Agence Nationale de la Recherche (ANR) से S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) और N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 और ANR-19-CE16-0002-01) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एलबी को एएनआर द्वारा Investissements d'avenir कार्यक्रम (ANR-10-IAHU-01) और Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD कार्यक्रम) के तहत समर्थित किया जाता है। इमेजिन इंस्टीट्यूट को इन्वेस्टिसमेंट्स डी'एवेनिर प्रोग्राम (एएनआर -10-आईएएचयू -01, क्रॉसलैब परियोजनाओं) के तहत एएनआर से राज्य वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया जाता है और दूसरे निवेश डी'एवेनिर कार्यक्रम (एएनआर -17-आरएचयूएस -0002) के हिस्से के रूप में।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 181 प्राथमिक सिलियम मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं एचआईपीएससी तंत्रिका स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं मानव सेरेब्रल कॉर्टिकल विकास तंत्रिका रोसेट पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स 2 डी और 3 डी एचआईपीएससी-आधारित मॉडल नियोकॉर्टिकल विकास सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स सोनिक हेजहोग पूरे-माउंट इम्युनोस्टेनिंग ऑप्टिकल क्लियरिंग लाइट शीट माइक्रोस्कोप माइक्रोस्कोप
2 डी और 3 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-आधारित मॉडल नियोकॉर्टिकल विकास के दौरान प्राथमिक सिलियम भागीदारी को विच्छेदित करने के लिए
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