Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

Abstract

עיגולים ראשוניים (PC) הם אברונים דינמיים שאינם מבוססי מיקרוטובולה שאינם בעלי רגש, הבולטים מפני השטח של רוב תאי היונקים. הם מגיחים מהמרכז הישן יותר במהלך שלב G1/G0 של מחזור התא, בעוד הם מתפרקים כאשר התאים נכנסים מחדש למחזור התא בגבול הפאזה G2/M. הם מתפקדים כרכזות אותות, על ידי זיהוי והעברה של אותות חוץ-תאיים החיוניים לתהליכי תאים רבים. בדומה לרוב סוגי התאים, כל תאי הגזע העצבי הניאו-קורטיקלי ותאי האב (NSPCs) הוכחו כמעניקים מחסה למחשב המאפשר להם לחוש ולהעביר אותות ספציפיים הנדרשים להתפתחות קליפת המוח המוחית הרגילה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי ליצור ולאפיין מודלים דו-ממדיים (2D) ותלת-ממדיים (3D) מבוססי תאים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSCs) כדי לנתח עוד יותר את המעורבות של המחשב במהלך התפתחות ניאוקורטית. בפרט, אנו מציגים פרוטוקולים כדי ללמוד את biogenesis PC ולתפקד ב 2D עצבי רוזט נגזר NSPCs כולל ההמרה של מסלול קיפוד סוניק (SHH). כדי לנצל את הארגון התלת מימדי (3D) של אורגנוידים מוחיים, אנו מתארים שיטה פשוטה להדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים מוחיים מחוסנים טוטו . לאחר ניקוי אופטי, רכישה מהירה של organoids שלם מאפשר זיהוי של צנטרוזומים ומחשב על אבות neocortical ונוירונים של האורגנויד כולו. לבסוף, אנו מפרטים את ההליך לחיסון וניקוי של מקטעי אורגנויד עבים וצפים חופשיים המשמרים מידה משמעותית של מידע מרחבי תלת-ממדי ומאפשרים את הרכישה ברזולוציה גבוהה הנדרשת לניתוח האיכותי והכמותי המפורט של ביוגנזה ותפקוד PC.

Introduction

עיגולים ראשוניים (PC) הם אברונים מבוססי מיקרוטובול החושים ומשדרים שפע של רמזים כימיים ומכאניים מהסביבה החוץ-תאית. בפרט, PC הוא האברונים המרכזיים עבור transduction של מסלול איתות קיפוד בחולייתנים1,2. בעוד רוב התאים העצביים כבר זמן רב הוכח מחסה מחשב, התרומה של אברון זה בעיצוב מערכת העצבים המרכזית כבר מזמן מוערך. מחקרים על התפתחות ניאוקורטית הובילו לגילוי של תאי גזע עצביים ואבות מרובים (NSPCs), כולם מחסה מחשב, אשר מיקומו הוצע להיות מכריע לקביעת גורל האבות 3,4,5,5,6,7. המחשב הוכח חיוני עבור מנגנוני תאים הנדרשים להתפתחות קליפת המוח המוחית הרגילה, כולל הרחבת NSPC ומחויבות8,9,10,10,11,12, כמו גם קוטביות אפיקובסל של פיגום גליה רדיאלי התומך הגירה עצבית13. בנוסף, מחשב נדרשים במהלך נדידה משיקה interneurons לצלחת קליפת המוח14,15. לבסוף, תפקיד עבור המחשב הוצע בהקמת קשרים סינפטיים של נוירונים בקליפת המוח16,17. בסך הכל, ממצאים אלה טוענים לתפקיד מכריע של המחשב בשלבים העיקריים של התפתחות קליפת המוח18,19 ולהעלות את הצורך לחקור את מעורבותם במנגנונים הפתולוגיים שבבסיס אנומליות של התפתחות קליפת המוח.

מחקרים שנערכו לאחרונה שיפרו במידה רבה את הבנתנו לגבי הבדלים תאיים ומולקולריים חשובים בין התפתחות קליפת המוח במודלים אנושיים ובעלי חיים, תוך הדגשת הצורך לפתח מערכות מודל אנושיות. בתפיסה זו, תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hIPSCs) מייצגים גישה מבטיחה לחקר פתוגנזה של מחלות בהקשר גנטי ותאי רלוונטי. מודלים דו-ממדיים (2D) מבוססי תאים או רוזטות עצביות מכילים NSPCs דומים לאלה שנראו בקליפת המוח המתפתחת, שהופכים מאורגנים למבנים בצורת רוזט המראים קוטביות אפיקובסל נכונה20,21,222. יתר על כן, מערכת התרבות התלת-ממדית (3D) מאפשרת יצירת אורגנוידים עוריים שמכסים מחדש תכונות רבות של התפתחות קליפת המוח האנושית23,24,24,25,26. שתי גישות מידול משלימות אלה מבוססות תאים מציעות פרספקטיבות מרגשות לנתח את המעורבות של המחשב במהלך התפתחות נורמלית ופתולוגית של קליפת המוח.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים עבור הדור והאפיון של רוזטות עצביות NSPCs נגזר, כמו גם organoids המוח הקדמי הגב. אנו מספקים גם פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח את הביוגנזה ואת הפונקציה של PC הנוכחי על NSPCs על ידי בדיקת ההמרה של מסלול קיפוד סוניק וניתוח הדינמיקה של מולקולות מכריעות המעורבות במסלול זה. כדי לנצל את הארגון התלת-ממדי של האורגנוידים המוחיים, הקמנו גם שיטה פשוטה וחסכונית להדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים מוחיים מחוסנים בטוטו המאפשרים רכישה מהירה, הודות למיקרוסקופ יריעת אור, של האורגנויד כולו, ברזולוציה גבוהה המאפשרת לדמיין מחשב על כל סוגי האבות הניאוקורטיים והנוירונים של האורגנויד כולו. לבסוף, התאמנו אימונוהיסטוכימיה על 150 מיקרומטר משטחים צפים חופשיים עם ניקוי ורכישה לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה מהדהד המאפשר רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה, אשר נדרש לניתוח מפורט של ביוגנזה ותפקוד PC. באופן ספציפי, תוכנת הדמיה תלת-ממדית מאפשרת שחזור תלת-ממדי של המחשב עם ניתוח מאוחר יותר של פרמטרים מורפולוגיים כולל אורך, מספר וכיוון של המחשב, כמו גם מדידת עוצמת האות של רכיבי ciliary לאורך האקסונמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דור של מודלים מבוססי תאים hIPS 2D של התפתחות ניאוקורטית

  1. היווצרות רוזטה עצבית
    1. התחל עם תרבויות hIPSC מחסה מושבות רגילות גדולות, הפגנת פחות מ 10% בידול ולא יותר מ 80% מפגש.
    2. יש לשטוף את ה-hIPSCs עם 2 מ"ל של PBS.
    3. הוסף 2 מ"ל של מדיום אינדוקציה NSPC בתוספת מעכב הסלע (NIM + 10 מיקרומטר של Y-27632).
    4. לנתח באופן ידני כל מושבת hIPSC מצלחת אחת של 35 מ"מ באמצעות מחט כדי לחתוך כל מושבה בדיוק בכיוונים אופקיים ואנכיים כדי ליצור תבנית לוח דמקה המחלקת כל מושבה לאשכולות שווים.
    5. נתק את המושבה באמצעות מגרד תאים והעבר אותם לצלחת אולטרה-נמוכה של 35 מ"מ.
    6. תן להם לצוף בן לילה (ON) בחממה לחה ב 37 °C (5 ° C ) ו 5% CO2, כך שהם יכולים ליצור גופים עובריים (EBs).
      הערה: גופים עובריים (EBs) מוגדרים כצבירי כדוריים צפים או אגרגטים של hIPSCs.
    7. מעבירים את ה- EBs לתוך פולי-L-ornithine / למינין (PO / lam) מצופה 35 מ"מ מנות ב 2 מ"ל NIM + 10 מיקרומטר של Y-27632.
    8. מדיום אינדוקציה NSPC רענון יומי (NIM ללא Y-27632) עד להיווצרות של rosettes עצביים זה לוקח בערך 12 עד 14 ימים. תבדוק מתחת למיקרוסקופ.
      הערה: לאחר שלב זה ניתן להרחיב, להבדיל ולעבד רוזטות עצביות לניתוח חיסוני או להתנתק כדי לקבל גזע עצבי מבודד ותאי אב (NSPCs).
  2. הרחבת רוזט עצבית ובידול מוקדם
    1. חותכים רוזטות עצביות בתבנית דמוית רשת עם מחט ומוציאים את האשכולות באמצעות מגרד תאים.
    2. מעבירים את הרוזטות לצלחת של 4 בארות המכילה כיסוי זכוכית מצופה PO/lam (4-5 רוזטות/טוב) ב-0.5 מ"ל של מדיום תחזוקה NSPC (NMM).
    3. לדגור על הצלחת בחממה לחה ב 37 °C (5 ° F) ו 5% CO2.
    4. רענן את NMM כל יומיים עד היום ה-20.
    5. מהיום ה-20, רוזטות עצביות תרבותיות ב-0.5 מ"ל של ציטוקינים התרוקנו מ-NMM כדי לאפשר בידול. רענן את המדיום כל 2-3 ימים.
    6. ביום 30 וביום 40 (10 או 20 ימים של בידול), לתקן את rosettes עם 0.5 מ"ל של 4% PFA, 20 דקות, RT.
  3. ביוגנזה של מחשב וניתוח פונקציות ב- NSPCs מבודדים
    1. ניתוק NSPC
      1. חותכים רוזטות עצביות משלב 1.1.8 בתבנית דמוית רשת עם מחט ומוציאים את האשכולות באמצעות מגרד תאים. מעבירים את התאים למנות 35 מ"מ מצופות PO/lam ב-2 מ"ל של NMM ודוללים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      2. רענן NMM כל יומיים עד למפגש (כ 5-7 ימים).
      3. לאחר גירוד התאים הגדולים והצלולים המקיפים רוזטות עצביות, בחרו אותם ידנית והעבירו אותם לכלים טריים מצופים PO/lam 35 מ"מ כדי להעשיר עבור NSPCs ולרוקן סוגי תאים לא עצביים.
      4. לאחר מעבר ידני אחד או שניים (חזור על שלב 1.3.1.3 במידת הצורך) נדרש כדי להסיר את כל סוגי התאים המזהמים, להסיר את המדיום ולשטוף עם PBS.
      5. מוסיפים 300 μL של 0.05% טריפסין ודגור במשך 5 דקות ב 37 °C (37 °F) עד שרוב התאים להתנתק.
      6. הוסף 2 מ"ל של המדיום המכיל 10% FBS (DMEM + 10% FBS) כדי להשבית את הטריפסין. לאסוף את ההשעיה התא בצינור חרוטי 15 מ"ל. בעדינות פיפטה השעיית התא למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לשבור את גושי התא.
      7. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
      8. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב- NMN.
      9. זרעו את ה- NSPCs המנותקים כתאים בודדים (1 x 105 תאים / cm2) ב- NMM על מנות מצופות PO / lam ודגרו אותם בחממה לחה ב 37 °C (5% CO2).
      10. הרחב את NSPCs ב- NMM על-ידי שינוי המדיום כל יומיים.
        הערה: NSPCs נזרעים בצפיפות גבוהה כדי למנוע בידול.
    2. ניתוח ביוגנזה של מחשב אישי
      1. זרעים ניתקו NSPCs ב 100,000 תאים / cm2 ודגרו אותם בחממה לחה ב 37 °C (37 °F) ו 5% CO2 ב NMM במשך 2 ימים.
      2. שאפו את NSPCs בינוני ורעב במדיום מדולדל ציטוקינים (מדיום רעב NSPC, שולחן משלים 1) במשך 48 שעות.
      3. תקן NSPCs עם 4% PFA במשך 20 דקות ב- RT.
      4. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות ב RT לפני imunostaining.
    3. ניתוח פונקציות מחשב: מסלול איתות SHH
      1. זרעים ניתקו NSPCs ב 100,000 תאים / cm2 על PO / lam מצופה שקופיות קאמרית 8-well (300 μL) או T25 מנות (5 מ"ל) ודגרה בחממה לחה ב 37 °C (5 ° C ו 5% CO2 ב NMM במשך 2 ימים.
      2. להרעיב NSPCs במדיום רעב NSPC (300 μL לכל באר של שקופית תא 8 בארות ו 5 מ"ל בבקבוק T25) במשך 48 שעות.
      3. כדי לגרום למסלול SHH, לדגור NSPCs עם מדיום רעב בתוספת SHH רקומביננטי (100 ננוגרם / מ"ל) או SAG (500 nM); (150 μL לבאר של שקופית תא 8 בארות ו 2 מ"ל בבקבוק T25) במשך 24 שעות.
      4. תקן NSPCs תרבית על שקופיות קאמריות 8-well ב 250 μL של 4% PFA לבאר במשך 20 דקות ב RT ולשטוף אותם פעמיים עם 250 μL של PBS במשך 5 דקות ב RT לפני ניתוח חיסוני.
      5. הסר את המדיום ולשטוף NSPCs תרבית מנות T25 עם PBS.
      6. מוסיפים 500 μL של 0.05% טריפסין ודגור במשך 5 דקות ב 37 °C (37 °F) עד התאים להתנתק.
      7. הוסף 2 מ"ל של בינוני המכיל 10% FBS (DMEM + 10% FBS) כדי להשבית את הטריפסין ולאסוף את ההשעיה התא בצינור חרוטי 15 מ"ל.
      8. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בזהירות לשאוף את supernatant כדי להשיג כדורי NSPC שניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F) לפני מיצוי RNA וניתוח RT-PCR.

2. דור של אורגנוידים קדמיים גביים

  1. תרבית של תאים בודדים של hIPSCs
    1. התחל עם תרבויות hIPSC מחסה מושבות רגילות גדולות המציגות פחות מ -10% בידול וכי כבר עבר כמעט פעם אחת. ודא שהתאים אינם עולים על 80% זה מזה.
    2. לשטוף את המושבות עם 2 מ"ל של PBS.
    3. מוסיפים 500 μL של ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים (GCDR) ודגור במשך 5 עד 7 דקות ב 37 °C (37 °F).
    4. שאפו את GCDR ולהוסיף 2 מ"ל של mTeRS1 בינוני בתוספת 5 מיקרומטר של Y-27632.
    5. פיפטה התאים בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לנתק את כל המושבות לתאים בודדים.
    6. מעבירים את התאים על כלים מצופים ויטרונקטין ודגורים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: בצע לפחות קטע אחד של hIPSCs באמצעות GCDR לפני ניסוי הבידול כדי להתאים את hIPSCs לתנאי תרבית של תא יחיד.
  2. ביום 0, לאפשר hIPSCs ליצור גופים עובריים במדיום EB המכיל ריכוז נמוך של FGF2 וריכוז גבוה של מעכבי סלע הנדרש להישרדות hIPSC. לשם כך בצע את השלבים שלהלן.
    1. לשטוף את המושבות עם 2 מ"ל של PBS.
    2. מוסיפים 500 μL של ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים (GCDR) ודגור במשך 5 עד 7 דקות ב 37 °C (37 °F).
    3. לשאוף את GCDR ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632; השתמש פיפטה 1 מ"ל לנתק בעדינות את התאים ולהעביר אותם צינור חרוטי 15 מ"ל.
    4. יש לשטוף פעם נוספת עם 2 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632, להעביר את התאים הנותרים לצינור החרוטי 15 מ"ל. מיד להוסיף 3 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632 לצינור החרוטי בעדינות הומוגניזציה הפתרון באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
    5. צנטריפוגה התאים מנותקים ב 100 x g במשך 5 דקות.
    6. שאפו בעדינות את העל-טבעי וחידשו את התאים ב-6 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632.
    7. צנטריפוגה התאים ב 100 x g במשך 5 דקות.
    8. לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום EB בתוספת עם 50 מיקרומטר של Y-27632. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לנתק בעדינות את התאים לתוך השעיה של תא יחיד.
    9. מיד לאחר שימוש חוזר בתאים, לדלל ולספור אותם.
    10. לדלל את הנפח הנכון של השעיית התא (המכיל 900,000 תאים) לתוך 30 מ"ל של מדיום EB בתוספת 50 מיקרומטר של Y-27632 ו 4 ng/mL של bFGF בעדינות לערבב את הפתרון.
    11. צלחת 9,000 תאים / גם לתוך צלחת 96U קובץ מצורף נמוך במיוחד (300 μL / טוב). כדי למנוע היווצרות EB מטרידה, לדגור על הצלחת בחממה לחה ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 עד יום 3 ללא שינוי בינוני.
  3. אינדוקציה עצבית (עיכוב SMAD כפול)
    1. ביום 3, ודא EBs למדוד 300-400 מיקרומטר ולהראות גבולות קבועים. אם מגיעים לשני הקריטריונים, החלף מחצית מהמדיום (150 μL) במדיום אינדוקציה-1 המכיל מעכבי SMAD כפולים, מה שמוביל להבהרת קווי המתאר של ה- EBs ביום 6 עד יום 7 המציין הבחנה נוירוקטודרמלית (טבלה משלימה 2).
    2. ביום 4, החלף 3/4 של המדיום (225 μL) עם אינדוקציה בינונית-1.
    3. ביום 6 וביום 8: רענן חצי מאמצעי האינדוקציה-1 (150 μL).
  4. אורגנויד המשובץ במטריצת קרום המרתף (יום 10)
    1. ביום 10, הטמע EBs בגורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתף (BMM).
      הערה: משלב זה, השתמש תמיד במספריים סטריליות כדי לחתוך את הפתיחה של טיפים פיפטה כדי למנוע פגיעה organoids על ידי צינורות חוזרים ונשנים.
    2. העברה ראשונה סביב 15-17 organoids בצינורות חרוטיים. תן EBs להתיישב ולהסיר את המדיום. הוסף 50 μL של אינדוקציה בינוני-2 ולהעביר אותם לתוך צינור microcentrifuge המכיל 100 μL של BMM.
    3. מורחים את תערובת מטריצה-EB על מרכז באר של צלחת אולטרה-נמוכה-קובץ מצורף ולהפריד את EBs כדי למנוע מהם היתוך.
    4. תן BMM להתמצק באינקובטור ב 37 °C (50 °F) במשך 45 דקות.
    5. מוסיפים 3 מ"ל של אינדוקציה בינוני-2 בכל באר ולשים את הצלחת בחממה לחה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2.
      הערה: ודא כי הליך זה נעשה מהר ככל האפשר כמו BMM מתמצק בטמפרטורת החדר.
  5. תרבות נייחת של אורגנוידים המוטמעים במטריצת ממברנת המרתף
    1. יום 12, 14: רענן אינדוקציה בינונית-2.
    2. יום 16: רענן אינדוקציה בינונית-2 ובדוק תחת מיקרוסקופ את הרחבת לולאות נוירו-אפיתל.
  6. פירוק מטריצת ממברנה במרתף ותרבות על שייקר מסלולי
    1. ביום 17, לנתק organoids מ BMM על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 5 מ"ל ולהעביר אותם לתוך בידול בינוני-1 (ללא ויטמין A). יש לדגור על שייקר מסלולי ב-80 סל"ד באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לשפר את הספיגה התזונתית.
      הערה: השתמש באינקובטור אחר לתרבות ותרבות נייחת על שייקר מסלולית כדי למנוע תנודות מזיקות לצמיחת תאי hIPS דבקים.
    2. יום 19: בידול רענון בינוני-1.
    3. יום 21: שנה את הבידול בינוני-1 לבידול בינוני-2 (עם ויטמין A).
    4. מיום 23 עד יום 35: רענן מדיום עם בידול בינוני-2 כל 2-3 ימים.
    5. מיום 35 עד יום 70: רענן את הבידול בינוני-2 עם 1% BMM ורענן כל 2-3 ימים.
    6. לאסוף את organoids לאחר 28, 42, ו 70 +/- 2 ימים של בידול ולתקן אותם לילה ב 4 °C (60 °F), ב 5 מ"ל 4% PFA על צינור חרוטי 15 מ"ל.
    7. להמשך ניתוח טוטו או חיסון צף חופשי, אורגנוידים נשטפים פעמיים ב- PBS ונשמרים ב-4 °C (4 °F) ב- PBS + 0.05% נתרן אזיד.
    8. לניתוח חיסוני על חלקים קפואים, טבול 4% אורגנוידים קבועים PFA ב 10 מ"ל 30% סוכרוז ב +4 °C (או עד organoids לשקוע). הטמעתם במטריצת הטבעה קפואה ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להקפאה.

3. בטוטו אימונובליבלינג, סליקה, ורכישת גליון אור של אורגנוידים עוריים

  1. קיבוע
    1. לאסוף את organoids בצלחות 6-well, להסיר את המדיום, ולתקן אותם עם 2 מ"ל של 4% PFA, ב 4 °C (6 °F), לילה.
    2. בצע שלוש שטיפות ב 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
    3. מעבירים את האורגנוידים לצינורות של 2 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 °C ב-2 מ"ל של PBS + 0.05% נתרן אזיד.
  2. פרמביליזציה
    1. אורגנוידים מדגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% טריטון X100 ב RT במשך 1 שעות. תעשה את זה פעמיים.
    2. דגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% טריטון X100 ו 20% DMSO, ב 37 °C (60 °F), לילה.
    3. דגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% Tween20, 0.1% טריטון X100, 0.1% Deoxycholate, 0.1% NP40 ו 20% DMSO, ב 37 °C (60 °F), לילה.
    4. דגירה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% טריטון-X100, ב RT, במשך 1 שעות. תעשה את זה פעמיים.
  3. חסימה וחיסונים
    1. חסום ב-1 מ"ל של תמיסת חסימה (PBS, 0.2% טריטון X100, 6% סרום חמורים, 10% DMSO), ב-37°C,ON.
    2. דגירה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב 250 μL של PBS, 0.2% Tween20, 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, 5% DMSO ו 3% סרום חמור, ב 37 °C (37 °F), במשך 2 ימים.
    3. יש לשטוף ב-1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween20 ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל של הפרין, למשך שעה אחת, בטמפרטורה של 37°C (37°F). תעשה את זה ארבע פעמים.
    4. לשטוף 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween20 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, לילה, ב 37 °C (37 °F).
    5. דגירה עם נוגדנים משניים מדוללים ב 250 μL של PBS המכיל 0.2% Tween 20, 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין ו 3% סרום חמור, ב 37 °C (50 °F), במשך 2 ימים.
    6. לשטוף ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween 20 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, במשך 1 שעה, על גלגל, ב RT. תעשה את זה ארבע פעמים.
    7. לשטוף ב 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% Tween 20 ו 0.1 מיקרוגרם / מ"ל של הפרין, לילה, על גלגל, ב RT.
    8. יש לשטוף ב-1 מ"ל של PBS, למשך 24 שעות, ב-RT.
    9. מלאי ב +4 °C (65 °F) ב 1 מ"ל של PBS ו 0.05% נתרן אזיד עד ניקוי.
  4. סליקה ב- TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. דגירה האורגנוידים ב 1 מ"ל של 30% TDE (3 מ"ל של TDE + 7 מ"ל של PBS), עבור 24 שעות, ב RT.
    2. דגירה ב 1 מ"ל של 60% TDE (6 מ"ל של TDE + 4 מ"ל של PBS), עבור 24 שעות, ב RT.
    3. דגירה ב 1 מ"ל של 80% TDE (8 מ"ל של TDE + 2 מ"ל של PBS), עבור 24 שעות, ב RT.
  5. הטמעת אורגנויד לפני רכישת יריעות אור
    הערה: השתמש במערכת מותאמת אישית; עשוי עם מזרק 1 מ"ל עם קצה לחתוך עם אזמל.
    1. הכינו 100 מ"ל של 4% אגרוז בהמסה נמוכה בתמיסת TDE של 60% ו-aliquot ב-2 צינורות מ"ל. שמור בטמפרטורה של +4 °C (60 °F).
    2. לפני הטמעת האורגנויד, מחממים מראש צינור אחד המכיל 1.5 מ"ל של 4% מהמסה נמוכה של 60% TDE באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס.
    3. בינתיים, להכין מערכת דפוס בהתאמה אישית עשוי מזרק 1 מ"ל קצה אשר חתוך באמצעות אזמל.
    4. לשאוב את המזרק 600 μL של פתרון הג'ל באמצעות הבוכנה.
    5. מקם את המדגם באמצעות קצה פיפטה מוגדל שפתחו נחתך באמצעות מספריים סטריליים.
    6. מלא את המזרק עם 400 μL של תמיסת ג'ל, כך המדגם ממוקם בתוך השליש התחתון של המזרק.
    7. תן לג'ל פולימריזציה ולאחסן בתמיסת TDE של 80% בטמפרטורה של 4 °C °C מוגנת מפני אור עד הרכישה.
    8. לרכישת גיליון אור, השתמש במטרה 20x שקועה בפתרון TDE 80% שנוסף בתא הדגימה כדי לאפשר התאמה מדויקת לאינדקס השבירה של שיטת הסליקה.
    9. הכנס את המזרק המכיל את האורגנויד המוטבע האגרוז במחזיק המדגם הגדול ביותר שנועד להכיל מזרק 1 מ"ל הבוכנה אשר ניתן להפעיל כדי למקם את האורגנויד מול המטרה.
      הערה: רכישת גיליון אור של אורגנויד שלם אורכת כ-5 עד 10 דקות.

4. חיסון ופינוי של חלקים צפים חופשיים של אורגנוידים עוריים

  1. קיבעון, הטמעת אגרווז וחיתוך האורגנוידים
    1. לאסוף organoids לאחר 28, 42, ו 70 +/- 2 ימים של בידול בצלחת 6-well ולתקן לילה ב 4 °C (4 °F) ב 2 מ"ל של 4% PFA.
    2. יש לשטוף פעמיים ב-2 מ"ל של PBS ולחסוך ב-4 °C (4 °F) ב-2 מ"ל של PBS + 0.05% נתרן אזיד.
    3. הטמע את האורגנוידים הקבועים ב-4% אגרוזים בעלי המסה נמוכה בתבנית משובצת פלסטיק (7 x 7 מ"מ). הסר בזהירות את בלוק האגרוז מתבנית הפלסטיק והדבק אותו לשלב הרטט.
    4. חלק את האורגנוידים המוטבעים באמצעות רטט כדי להשיג 150 מיקרומטר של קטעים צפים חופשיים המועברים בבאר של צלחת 24 באר המכילה 500 μL של PBS באמצעות מברשת צבע כדי למנוע פגיעה בקטעים.
      הערה: אגרוז בהמסה נמוכה מומלץ כמו טמפרטורת ההיתוך שלה היא רק כ 60 °C (60 °F). הכן 4% נמוך נמס agarose בתמיסת PBS ולהשאיר אותו להתקרר קצת מעל 37 °C (50 °F) באמבט מים לפני הטמעת organoid.
  2. פרמביליזציה, חסימה וחיסונים
    1. דגירה את החלקים ב 500 μL של PBS המכיל 0.3% טריטון X100, ב RT, תחת תסיסה, במשך 20 דקות. תעשה את זה שלוש פעמים.
    2. לדגור על החלקים ב 500 μL של PBS המכיל 0.3% טריטון X100 ו 5% חלב דל שומן, ב RT, תחת תסיסה, במשך 2 שעות.
    3. דגירה את החלקים ב 250 μL של פתרון נוגדנים ראשוני (PBS + 0.3% טריטון X100 + 1% חלב דל שומן), תחת עצבנות, ב +4 °C (60 °F), לילה.
    4. לשטוף את החלקים ב 500 μL של PBS, ב RT, תחת תסיסה, במשך 20 דקות. תעשה את זה ארבע פעמים.
    5. דגירה את החלקים ב 250 μL של פתרון נוגדנים משני (PBS + 0.3% טריטון X100 + 1% חלב דל שומן), ב RT, תחת תסיסה, במשך 2 שעות.
    6. לשטוף את החלקים ב 500 μL של PBS, ב RT, תחת תסיסה, במשך 20 דקות. תעשה את זה ארבע פעמים.
    7. אחסן את המקטעים ב- 500 μL של PBS, ב+ 4° C עד לניקוי.
  3. סליקה ב- TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. לדגור על המקטעים ב 500 μL של 30% ו 60% TDE עבור 1 h כל אחד ב RT, ולאחר מכן ב 500 μL של 80% TDE לילה, ב RT.
    2. אחסן את החלקים המנוקים ב 500 μL של 80% TDE עד הרכישה ב +4 °C (60 °F).
  4. הרכבה של מקטעים צפים חופשיים לפני הרכישה עם קונפוקל סריקת תהודה
    1. הרכב מקטע צף חופשי בתא אטום המאפשר לשמור על המדגם בתמיסת TDE של 80% ותוכנן להסתגל לשלב XY ממונע של מיקרוסקופים קונפוקליים.
    2. שים כיסוי עגול אחד במערכת התא.
    3. העבירו בזהירות את החלק החיסוני המנוקה באמצעות מברשת צבע.
    4. מלא את התא בתמיסת TDE של 80%.
    5. הוסיפו שני כיסויים סטנדרטיים בתוספת כיסוי עגול שני וחותמת סיליקון.
    6. בורג על טבעת ההברגה של התא כדי לאטום באופן מושלם את המערכת.

5. יריעת אור וניתוח קונפוקלי סריקת תהודה

  1. עבד רכישות של יריעות אור וסריקת תהודה באמצעות תוכנה המאפשרת הדמיה וניתוח תלת-ממדיים של המדגם החיסוני כולו.
    הערה: תוכנה כזו מאפשרת לפתוח במהירות נתונים עצומים כדי ליצור בקלות תמונות ואנימציות. זה מאפשר להזיז את המדגם בכיוון שונים וליצור תצוגות דו-ממדיות הודות לכלי כלי פריסה דו-ממדי בכיוון שונים, XY ו- YZ למשל.
  2. לזיהוי אוטומטי של צנטרוזומים וריסים ראשיים, השתמש באשף ספוט המאפשר לכמת את מספרם בתנאי פתולוגיים לעומת שליטה.
  3. לשחזור תלת-ממדי של המחשב המאפשר מדידה מדויקת של אורכם, השתמש באשף חוטים כדי לתקן באופן ידני את נקודת ההתחלה של המחשב והתוכנה משתמשת באות הפלואורסצנטיות כדי לשחזר את המחשב במדויק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודלים דו-ממדיים מבוססי תאים hIPS לחקר ביוגנזה ותפקוד ראשוניים של סיליום
הפרוטוקול המפורט כאן הותאם ממחקרים שפורסמו בעבר20,21,22. פרוטוקול זה מאפשר דור של מבני רוזטה עצביים המכילים אבות נאוקורטיים ותאי עצב דומים לאלה שנראו בניאוקורטקס המתפתח. אימות מפורט יכול להתבצע על ידי ניתוח חיסוני קונבנציונלי באמצעות יצרנים ספציפיים3. לדוגמה, אבות אפיים (AP) צריכים להיות מוכתמים פעמיים עם SOX2 ו- PAX6, אבות ביניים (IP) מתגלים על ידי כתמי TBR2/EOMES, ונוירונים ניאו-קורטיקליים שנולדו בגיל צעיר מתגלים על ידי כתמי CTIP2 (איור 1A-C). מבנים דמויי רוזט עצביים כאלה מודלים הגירה גרעינית בין-קינטית (INM) של AP שניתן לדמיין על ידי חיסון עם נוגדנים שהועלו נגד זרחן-וימנטין, אשר מכתים גרעינים מיטוטיים ו- TPX2 שמכתימים את הציר המיטוטי. סמנים אלה, אם כן, מאפשרים ניתוח של מספר מאפיינים של AP, כולל INM עם חלוקת תאים כדי להתקיים באופן חיובי סביב לומן המרכזי (איור 1D,D'), כמו גם את מצב החלוקה שנקבע על ידי מדידת הזווית בין מישור החלוקה לבין המשטח האפי. לבסוף, ciliogenesis ניתן לנתח על ידי חיסון עם נוגדנים שהועלו נגד PCNT, אשר מכתים את הגוף הבסיסי של המחשב, ו ARL13B שמכתים את האקסונם. במבני רוזט כאלה, המחשב משתרע מהקוטב האפוי של APs אל הלומן המרכזי של כל אזור דמוי חדר (איור 1E, E'), בעוד שהם בולטים גם מתאי עצב CTIP2+ (איור 1E'').

דיסוציאציה של מבני רוזט אלה מאפשרת קבלת NSPCs מבודדים בתרבית על לוחות תרבות מצופים פולי-L-ornithine /למינין ב- NMM בצפיפות גבוהה כדי לאפשר תחזוקה של אוכלוסייה יציבה וניתנת להרחבה של NSPCs עבור לפחות 15 קטעים מבלי לצבור חריגות קאריוטיפ21,27. כדי לנתח ביוגנזה PC, NSPCs מנותקים הם תרבותיים למפגש ומורעבים במשך 48 שעות. ניתוחים חיסוניים באמצעות נוגדנים שהועלו כנגד סמני מחשב מראים כי NSPCs אלה מכילים מחשב אישי (איור 2A). על ידי שילוב של שני כלים משלימים בקוד פתוח, Ilastik, כלי ניתוח תמונה מבוסס למידת מכונה שימושי עבור פילוח מחשב28 ו CiliaQ, חבילת תוסף פיג'י / ImageJ29, המאפשרים שחזור תלת-ממדי של המחשב מערימות תמונה קונפוקליות תלת-ממדיות, ניתן להעריך בקלות מספר פרמטרים מבניים, כולל מספר המחשב והאורך שלהם.

פונקציית מחשב של NSPCs ניתן גם להעריך על ידי בדיקת transduction של מסלול איתות קיפוד. כדי להעריך את ההמרה של מסלול איתות SHH, NSPCs מורעבים במשך 48 שעות ומטופלים עם SHH רקומביננטי (rSHH) או אגוניסט מוחלק (SAG) במשך 24 שעות. באמצעות נוגדנים שהועלו נגד GPR161, SMO ו- GLI2, ניתוח immunofluorescent (IF) מאפשר לבדוק את הסחר של שחקני איתות SHH מרכזיים אלה לאורך המחשב, כאשר GPR161 בדרך כלל יוצא מהמחשב ואילו GLI2 ו- SMO מצטברים בתוך המחשב בתגובה להפעלת מסלול SHH (איור 2C-D). ניתוח ערימות תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות באמצעות כלי CiliaQ מאפשר כימות יציאת GPR161 מהמחשב וכן הצטברות GLI2 ו- SMO בתוך המחשב לאחר הפעלת מסלול SHH (איור 2F-G). בנוסף, ניתוח RT-PCR חצי כמותי על mRNA המופק מ- RSHH- או SAG-treated NSPCs מראה את האינדוקציה של שני גנים של יעד SHH, GLI1 ו- PTCH1, המעידים על העברת איתות SHH רגילה ב- NSPCs הנגזרים מ- hIPSCs בקרה (איור 2B).

בסך הכל, מודלים מבוססי תאים דו-ממדיים של פיתוח המוח הקדמי הגבי משחזרים בבירור מספר היבטים של התפתחות קליפת המוח הרגילה ומייצגים כלים מבטיחים לנתח מנגנונים הקשורים למחשב העומדים בבסיס אנומליות של התפתחות ניאוקורטית באמצעות שליטה לעומת hIPSCs המטופל מחסה מוטציות בגנים האחראים על אנומליות התפתחותיות אנושיות של קליפת המוח.

מודלים תלת-ממדיים מבוססי תאים hIPS לחקר מעורבות ציליום ראשונית במהלך התפתחות ניאוקורטית
הפרוטוקול המתואר כאן (איור 3A) הותאם מפרוטוקולים שפורסמו בעבר23,24,25,25,26,30 ונבדק בהצלחה בחמישה קווי hIPSC נפרדים של בקרה. היא מאפשרת ליצור אורגנוידים עוריים שמקורם ב-HIPSC שגדלים עם הזמן תוך יצירת לולאות נוירו-אפיתל גדולות (איור 3B). ניתוח חיסונים או על קריוזקציה אורגנויד (cryostat, 20 מיקרומטר), קטעים צפים חופשיים (vibratome, 150 מיקרומטר), או טוטו, ניתן לבצע עבור בקרת איכות. ביום 28 ± 2, organoids מורכב לולאות נוירו-אפיתל מרובדות המבטאות את סמן האב העצבי SOX2 ואת סמן המוח הקדמי הגבי PAX6, המעיד על זהות המוח הקדמי הגבי. ביום 42 ± 2 (6 שבועות של בידול), לולאות אלה צריכות להציג ארגון מרובד מורכב יותר. מן האפיאל אל פני השטח הבסיסיים של מבני לולאה אלה, אזור דמוי חדר (VZ) דמוי אזור עם SOX2 / PAX6 חיובי APICAL גליה רדיאלית glial אבות (aRG) ניתן לסמן, כמו גם אזור subventricular (SVZ) דמוי אזור דמוי אזור עם אבות ביניים חיוביים TBR2 (IPs) ואזור דמוי לוח קליפת המוח (CP) המכיל CTIP2-חיובי נוירונים ניאוקורתיים מוקדמים (איור 3C, ה. הקוטביות המולקולרית האפיאלית של aRG יכולה להיות מוערכת על ידי העשרה אפולית על פני החדר של ZO-1 ו- N-CADH (איור 4A, וידאו 1). ניתן להעריך את מאפייני חלוקת האבות של ARG באמצעות סמני TP2X ו- P-VIM כדי לנתח INM שמוביל בדרך כלל ליישור של גרעינים מיטואטיים של ARG על פני החדר של לולאות קליפת המוח (איור 4B, וידאו 2). חיסון כזה מאפשר גם מדידה של זווית החלוקה כדי להעריך מצב חלוקה סימטרי לעומת אסימטרי של aRG. ניתן לראות אב-קדמונים חיוביים P-Vim גם באזור דמוי SVZ, המכילים תהליך בסיסי ייחודי המשתרע על פני השטח הבסיסיים המזכירים גליה רדיאלית חיצונית (oRG או גליה רדיאלית בסיסית, איור 4C, וידאו 2). בעוד הם נעדרים מהיום 42 organoids, SATB2 נוירונים חיוביים שנולדו לאחרונה יש לזהות מהיום 70 (10 שבועות של בידול) (איור 3D,F), המעיד על תזמון דמוי vivo של הבחנה עצבית ניאוקורטית.

ניסויי חיסון באמצעות סמני הגוף הבסיסי (גמא טובולין) ואקסונמה (ARL13B) מאפשרים הדמיה של מחשב ב-20 מיקרומטר קריוזקציה (איור 3G,H). כדי לנצל את הארגון התלת-ממדי של אורגנוידים קדמיים בגב, ניתן לבצע חיסון בהר שלם. רכישת יריעות אור של כאלה באורגנואידים מחוסנים ומנוקים טוטו מאפשרת זיהוי של שני צנטרוזומים ומחשב על כל סוגי NSPC, כמו גם על נוירונים neocortical (וידאו 3). בנוסף, כדי לבצע ניתוחים מדויקים יותר של ביוגנזה PC, ניתוח אימונוהיסטוכימיה על קטעים עבים צפים חופשיים (150 מיקרומטר) של organoids המוח הקדמי הגב עשוי להתבצע. לאחר הסליקה, ניתן לרכוש מקטעים כאלה באמצעות 40x (NA 1.3) או 63x (NA 1.4) מטרת שמן של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי אור לבן מהדהד הפוך, המאפשר לשפר את הרזולוציה תוך שמירה על המידע המרחבי התלת-ממדי של organoids. מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר כזה מאפשר רכישה מהירה של חלקים עבים, עם עירור וזיהוי מדויקים וגמישים ללא כל הפרעה (וידאו 4). ניתן להעריך מספר פרמטרים מבניים של המחשב, כולל מספר מחשב, אורך וכיוון, באמצעות תוכנת הדמיה תלת-ממדית. קוד פתוח ייעודי, כלים זמינים באופן חופשי כגון Ilastik28, כלי ניתוח תמונה מבוסס למידת מכונה, כמו גם חבילת תוסף CiliaQ על Fiji / ImageJ29 הם שימושיים מאוד עבור פילוח מחשב אוטומטי המאפשר ניתוח איכותי וכמותי הבא של ביוגנזה של המחשב ותפקוד בשליטה לעומת תנאים פתולוגיים.

Figure 1
איור 1: דור ואפיון של רוזטות עצביות דו-ממדיות. אפיון אימונוהיסטוכימי של מבני רוזטה עצביים באמצעות (A) נוגדני SOX2 ו- PAX6 כדי לזהות AP, (B) TBR2 / EOMES כדי לחשוף IP, ו- (C) CTIP2 כדי להכתים נוירונים ניאוקורטיים שנולדו בגיל צעיר. AP מתרבה מזוהים עם נוגדני זרחן-vimentin ו- TPX2 והם ממוקמים על פני השטח apical (D,D'). המחשב מתגלה על ידי חיסון כפול עם נוגדני PCNT ו- ARL13B. מחשב להאריך מכל AP לתוך לומן המרכזי של כל רוזט, בעוד הם מזוהים גם על IP נוירונים שנולדו מוקדם (E,E,E', E', E''). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: NSPCs מבודדים שמקורם ברוזטות עצביות דו-ממדיות מכילים מחשב פונקציונלי. ניתוק של רוזטות עצביות דו-ממדיות מעורר NSPCs מבודדים מחסה מחשב לאחר רעב במשך 48 שעות כפי שנחשף על ידי ARL13B ו PCNT חיסון (A). NSPCs מכילים מחשב פונקציונלי כפי שנחשף על ידי כימות RT-PCR של שני גנים יעד SHH GLI1 ו - PTCH1 לאחר רעב במשך 48 שעות ולאחר מכן הפעלה של המסלול על ידי טיפול עם SHH רקומביננטי (rSHH) עבור 24 h. GLI1 ונתוני ביטוי PTCH1 בוצעו במשולש מנורמל לנתוני ביטוי ACTB . הנתונים נותחו בשיטת 2−ΔΔCt והוצגו כביטוי יחסי ± SEM (מבחן מאן ויטני) (B). ניתוח אם על NSPCs מורעב עם (D) או בלי (C) טיפול rSHH כדי לבדוק את הדינמיקה של שני שחקנים מכריעים של מסלול איתות SHH, GLI2, ו- GPR161, אשר בהתאמה לצבור או לצאת מהמחשב לאחר הפעלת מסלול SHH. על-ידי שילוב כלים של Ilastik ו- CiliaQ לניתוח תמונות קונפוקליות, עוצמת האות GPR161 (F) ו- GLI2 (G) בתוך המחשב הושוותה ב- +/- rSHH שטופלו ב- NSPCs. כתמי ARL13B שימשו לפילוח מחשבים אישיים, וכצפוי אורך המחשב לא השתנה ב- + / - RSHH שטופלו ב- NSPCs (E). הנתונים מסוכמים בערימות קופסה ושפם (ערכים ממוצעים ± SEM). p < 0.0001 (מבחן מאן ויטני). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דור ואפיון של אורגנוידים גביים. (א) סקירה סכמטית של הפרוטוקול כדי ליצור אורגנוידים של המוח הקדמי הגבי. (B) תמונות שדה בהירות מייצגות של אורגנוידים בימים 1, 3, 7, 24 ו- 42 של בידול. תמונות קונפוקליות של 20 מיקרוגרם קריוזקציה של אורגנוידים ביום 42 (C) ו-70 (D) לאחר חיסון עם נוגדני SOX2, TBR2 ו- CTIP2 המגדירים, בהתאמה, את אזור החדר (VZ), את האזור התת-חדרי (SVZ) המכיל את ה- TBR2 IP החיובי, ואת האזור דמוי ההכנה (CP) המכיל נוירונים ניאו-קורטיים חיוביים של CTIP2. תמונות קונפוקליות של 20 מיקרוגרם קריוזקציה של אורגנוידים ביום 42 (E) ו -70 (F) לאחר חיסון עם נוגדני PAX6, CTIP2 ו- SATB2 המראים את המראה של נוירונים חיוביים של SATB2 שנולדו מאוחר ביום 70. תמונות קונפוקליות של 20 מיקרומטר קריוזקציה של אורגנויד ביום 42 לאחר אימונוסטיין עם נוגדני ARL13B ו- PCNT החושפים PC בקוטב האפוי של אבות גליה רדיאלית (G) בזמן שהם נמצאים גם על נוירונים חיוביים CTIP2 (H). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה תלת-ממדית של אורגנוידים עוריים. (A) רכישת גיליון אור של אורגנויד מוח קדמי גב שלם (יום 42) מוכתם בנוגדני PAX6, N-CADH ו- CTIP2 המציגים את הלולאות הנוירו-אפיתליות מרובות עם אבות גליה רדיאליים חיוביים של PAX6 המציגים קוטביות אפיקובסלית נכונה כפי שנחשף על ידי הצטברות של N-Cadherin בצד האפוי שלהם ונוירונים ניאו-קורטיקליים חיוביים של CTIP2 שנולדו בגיל צעיר ומתווים אזור דמוי הכנה. (B) רכישת יריעות אור של אורגנויד מוח קדמי גב שלם (יום 42) מוכתם בנוגדני TPX2, P-Vim ו- CTIP2 הממחישים הגירה גרעינית בין-קינטית של אבות גליה רדיאלית חדרית. (ג) זום על רכישת יריעות האור של אורגנואיד מוח קדמי גב שלם (יום 42) מוכתם בנוגדני TPX2 ו- P-Vim המציגים אב מרחיב תהליך בסיסי ייחודי ומקומם באזור התת-חדרי, המזכיר אב גליה רדיאלי חיצוני. (D) רכישת סורק תהודה של קטע 150 מיקרומטר של אורגנויד המוח הקדמי הגבי (יום 42) מוכתם בנוגדני PCNT ו- ARL13B המציגים מחשב ב- NSPCs ונוירונים ניאוקורטיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דור ואפיון של מודלים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המבוססים על תאי hIPS של התפתחות המוח הקדמי הגבי כדי לנתח את מעורבות המחשב לפתופיזיולוגיה של אנומליות קליפת המוח. תאי hIPS מורשים ליצור גופים עובריים (EBs) ללוחות תרבית הידבקות נמוכה, ולאחר מכן הם דגירה לתוך מדיום אינדוקציה המכיל מעכבי SMAD כפולים כדי לגרום לבידול נוירוקטודרמלי. הידבקות של EBs לתוך מנות מצופות PO / lam מאפשרת את הדור של מבני רוזטה עצבית 2D בעוד התרבות החופשית הצפה של EBs עם הטמעה הבאה לתוך BMM מאפשרת את הדור של organoids המוח הקדמי הגב. נסיגה של גורמים מיטוגניים מדיום רוזט עצבי דבק מקדם את הופעת neurogenesis שניתן לבדוק על ידי ניתוח IF. ניתוק של רוזטות עצביות דבק מאפשר את הדור של תרבויות NSPC מבודדות שימושי עבור ביוגנזה PC וניתוח פונקציות. אורגנוידים של המוח הקדמי הגב נאספים לאחר 4, 6 או 10 שבועות של בידול וקבועים לניתוח חיסוני עוקב או בטוטו, על קטעים בעובי 150 מיקרומטר, או 20 מיקרומטר קריוקציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: רכישת גיליון אור של אורגנויד מוח קדמי גב שלם (יום 42) מחוסן עם נוגדני PAX6, CTIP2 ו- NCADH. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: רכישת גיליון אור של אורגנויד מוח קדמי גב שלם (יום 42) מחוסן עם נוגדני TPX2, P-VIM ו- CTIP2. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3: רכישת גיליון אור של אורגנויד מוח קדמי גב שלם (יום 42) מחוסן עם נוגדני PCNT ו- ARL13B. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 4: רכישה קונפוקלית סריקת תהודה של קטע 150 מיקרומטר של אורגנויד מוח קדמי גב (יום 42) מחוסן עם נוגדני ARL13B ו- PCNT. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

קבצים משלימים: לחץ כאן כדי להוריד את הטבלאות.

טבלה משלימה 1: מתכון של המדיה המשמשת ליצירת רוזטות עצביות דו-ממדיות ו- NSPCs.

טבלה משלימה 2: מתכון של המדיה המשמשת לדור של organoids המוח הקדמי הגב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחשב נחשבים כיום אברונים מפתח המסדירים שלבים מכריעים במהלך התפתחות קליפת המוח המוחית נורמלית18,19,31 כולל הרחבת NSPC ומחויבות8,9,10,10,11,12, כמו גם הגירה עצבית13,14 ו synaptogenesis16,17 . בנוסף לניתוח במודלים של בעלי חיים או ברקמות מוחיות עובריות אנושיות, הדור של מודלים חדשניים ורלוונטיים ביותר המבוססים על HIPSC של התפתחות ניאוקורטית הוא חיוני כדי לנתח את תפקידו של המחשב במהלך התפתחות קליפת המוח הרגילה והפתולוגית.

פרוטוקול הדוגמנות הדו-ממדי hIPSC המפורט כאן הותאם משלושה פרסומים עיקריים20,21,22. הבחנה נוירואפיתלאלית נגרמת על ידי עיכוב SMAD כפול באמצעות מעכבי מולקולה קטנים של המסלולים activin/nodal (SB-431542) ו- BMP (LDN-193189)22. תאים מאורגנים במבנים בצורת רוזט המכילים NSPCs, כמו גם נוירונים שכבה עמוקה neocortical לאחר 20 ימים של בידול. בנוסף, מבנים דמויי רוזט אלה מראים קוטביות אפיקובסל נכונה, הגירה גרעינית בין-קינטית של אבות אפיים, כמו גם מחשב המשתרע מכל NSPCs ונוירונים. לאחר ניתוק של מבני רוזט אלה, אוכלוסייה הומוגנית ויציבה של אבות קליפת המוח מתקבלת21. כאשר מתורבתים למפגש ומורעבים במשך 48 שעות, אבות קליפת המוח האלה מכילים מחשב שעבורו ניתן לנתח בקלות את המורפולוגיה, המספר והאורך על ידי שילוב של חבילת התוסף Ilastik28 ו- CiliaQ28,29 ב- Fiji / ImageJ. יתר על כן, באמצעות ציטוקינים כדי לגרום למסלול איתות SHH, פונקציית המחשב יכולה לשמש גם על ידי IF כדי לבדוק את הדינמיקה של שחקני מסלול איתות מכריע לאורך המחשב כגון GLI2, SMO, ו- GPR161. בנוסף, בדיקות RT-PCR חצי כמותיות מאפשרות בדיקה של האינדוקציה של ביטוי גנים של יעד SHH, כולל GLI1 ו- PTCH1, בתגובה להפעלת מסלול SHH. יש לבדוק גם מסלולי איתות אחרים התלויים בתפקוד המחשב האישי, כולל מסלולי WNT ו- IGF2,32,33. לסיכום על גישת מידול דו-ממדית זו, אשר משחזרת בבירור מספר היבטים של התפתחות קליפת המוח הרגילה, היא מייצגת כלי שימושי ורלוונטי לבדיקת ביוגניזיס ותפקוד PC בתנאים נורמליים לעומת פתולוגיים וצריכה לתרום כדי לקבל תובנה נוספת על מעורבות המחשב במהלך התפתחות ניאוקורטית.

בנוסף לגישות דוגמנות מבוססות hIPSC דו-ממדיות, אורגנוידים של המוח הקדמי הגבי מציעים הזדמנויות חסרות תקדים לחקור התפתחות מוחית נורמלית ופתולוגית במבחנה כפי שהם מסכמים מחדש תכונות ומאפיינים רבים של קליפת המוח האנושית המתפתחת המוקדמת. שני סוגים עיקריים של פרוטוקולים משמשים כיום: השיטות המהותיות והמודרכות. הפרוטוקול המהותי שפותח על ידי לנקסטר ועמיתיו23 מסתמך על היכולת הפנימית של IPSCs להתארגן באופן עצמי עם גורמים חיצוניים מינימליים ומעורר אורגנוידים מוחיים המכילים יסודות של אזורי מוח שונים המציעים הזדמנות ייחודית לדגמן את האינטראקציות בין אזורי מוח שונים. עם זאת, השונות הגבוהה וההטרוגניות הטמונה באסטרטגיית מידול כזו מציבות אתגרים משמעותיים של רבייה. פרוטוקולי בידול אורגנויד מודרך מאפשרים יצירת אורגנוידים ספציפיים לאזור המוח עם הטרוגניות מינימלית24,25,26. גישה זו אפשרה לנו ליצור בהצלחה אורגנוידים עוריים עם מבנים דמויי חדרים המסכמת תהליכים מרכזיים של התפתחות קליפת המוח האנושית המוקדמת. הבעיה הקריטית הראשונה היא להתחיל עם תרבויות hIPSC באיכות גבוהה מחסה מושבות רגילות גדולות המציגות פחות מ -10% בידול ואשר עברו כמעט פעם אחת כמונוlayer כדי להתאים את hIPCs לתנאי תרבית תא יחיד. ואכן, כדי להגביל הטרוגניות אורגנויד, אחד האתגרים העיקריים בתחום, היווצרות של EBs עם גודל הומוגני הוא תנאי מוקדם המרמז על הצורך בדיסוציאציה של מושבות hIPSC לתוך השעיה חד-תאית המאפשרת זריעה בצפיפות התא המוגדרת. צעד קריטי נוסף הוא הכללת BMM של EBs, הדרוש כדי לתמוך במבנה 3D והתרחבות neuroepithelial. העדפנו את ההכללה הקבוצתית של כחמש עשרה אורגנוידים על פני הכללה אישית גם אם זה כרוך בצעד נוסף, פירוק BMM. דיסוציאציה BMM לפני תרבות רועד הוכח להפחית את השונות בתוך ובין אצוות organoid, ובכך וכתוצאה מכך רבייה גבוהה יותר34. בנוסף, הוא מאפשר להיפטר מתהליכי תאים המשתרעים לתוך ה- BMM שאינם מזיקים לשלבי הבידול הבאים, אך מקשים על התבוננות באורגנוידים לבדיקת איכות בשלבים הבאים של ההליך. כדי לשפר את הספיגה התזונתית ואת חילופי החמצן, השווינו התבגרות אורגנויד על שייקרים מסלולית ו bioreactors ספינינג שהוביל לתוצאות דומות. לכן בחרנו באפשרות שייקר מסלולית, שכן היא מאפשרת להפחית באופן משמעותי את הנפחים הבינוניים ולכן את העלות הכוללת של הניסויים. חשוב לציין, להשתמש בחממה שונה עבור תרבות נייחת ומטלטלת על שייקר מסלולית, כדי למנוע כל תנודות מזיקות לצמיחת hIPSC דבק. יישמנו בהצלחה פרוטוקול זה על חמישה קווי hIPSC שליטה ברורה35 המביאים לתוצאות הומוגניות המבטיחות את החוסן של הליך זה.

אפיון של organoids כאלה ניתן להשיג באמצעות מספר שיטות. כדי לשמר את המידע המרחבי התלת-ממדי בתוך organoids, הקמנו פרוטוקול המאפשר חיסון של הרכבה שלמה וניקוי של אורגנוידים שלמים עם רכישת יריעות אור עוקבות. שיטות סליקה שונות הופיעו עם יעילות בהתאם למקור המדגם ועובי36,37. כאן, הקמנו שיטת סליקה פשוטה, מהירה וחסכונית המסתמכת על TDE (2,2'-thiodiethanol), נגזרת גליקול ששימשה בעבר לניקוי מוח העכבר ואורגנוידים במעיים38,39. רכישת אורגנואידים מחוסנים ומנוקים בוצעה על מיקרוסקופ יריעות אור באמצעות מטרה של פי 20 שקועה ב-80% TDE. בהשוואה לשיטות אחרות לרכישת הדמיה תלת-ממדית, מיקרוסקופיה של יריעות אור מעניינת מכמה סיבות: רכישה מהירה, חדירה טובה והלבנת פוטו מופחתת. אופטימיזציה של שלב חדירות מאפשר להגיע לחדירת נוגדנים יעילה והומוגנית המאפשרת לדמיין גופים בסיסיים ואקסונמים של מחשב המשתרעים מכל סוגי התאים האבותיים והנוירונים של האורגנויד כולו. יתר על כן, רכישת מקטעים בעובי 150 מיקרומטר צפים חופשיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת תהודה הפוכה עם מטרות שמן 40x (NA 1.3) או 63x (NA 1.4) מאפשרת להשיג עוד יותר רזולוציה, תוך שמירה על מידה משמעותית של מידע מרחבי תלת-ממדי, ומאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של ביוגנזה ותפקוד PC.

שילוב מודלים מבוססי תאים דו-ממדיים ותלת-ממדיים כאלה וניתוח הדמיה תלת-ממדית (איור 5) ב- hIPSCs הנוצרים על-ידי תכנות מחדש של תאי חולי ciliopathy או באמצעות טכנולוגיית CRISPR/CAS9 לעריכה ספציפית של גנים צנטרוסומאליים או ciliary אמור לאפשר התקדמות משמעותית בהבנת תרומת המחשב במהלך התפתחות תקינה ופתולוגית של קליפת המוח. חשוב לציין, טכנולוגיית עריכת הגנום מאפשרת גם להציל באופן ספציפי מוטציות של מטופלים כדי להשיג hIPSCs בקרה איזוגנית כדי להתגבר על הטרוגניות גנטית המאתגרת את גילוי מנגנוני המחלה. בנוסף, גישות גנומיות חד-תאיות נמצאות כיום בשימוש נרחב בכל התחום ומייצגות גישות רלוונטיות ומשלימות לניתוח חיסוני. לכן, למרות כמה מגבלות וקשיים הטמונים בכל הטכנולוגיות המתעוררות, ואשר מטופלים בהרחבה, מודלים מבוססי hIPSC דו-ממדיים ותלת-ממדיים כאלה ושיטות האפיון שהצגנו כאן מציעים כלים רבי עוצמה ורלוונטיים לניתוח מעורבות המחשב במנגנונים הפתולוגיים שבבסיס אנומליות ניאוקורטיות התפתחותיות אנושיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן האגנס הלאומי דה לה Recherche (ANR) כדי S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) ו N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 ו ANR-19-CE16-0002-01). LB נתמך על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) ו- Fondation Bettencourt Schueller (תוכנית MD-PhD). מכון Imagine נתמך על ידי מימון המדינה מ-ANR במסגרת תוכנית Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, CrossLab פרויקטים) וכחלק מתוכנית Investissements d'Avenir השנייה (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 181 ציליום ראשוני תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם hIPSCs תאי גזע עצביים ותאי אב התפתחות קליפת המוח האנושית רוזטות עצביות אורגנוידים של המוח הקדמי הגבי מודלים מבוססי hIPSC דו-ממדיים ותלת-ממדיים של hIPSC של התפתחות ניאוקורטית אורגנוידים מוחיים קיפוד קולי חיסון בהר שלם ניקוי אופטי מיקרוסקופ יריעות אור
מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter