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Developmental Biology

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Abstract

Los cilios primarios (PC) son orgánulos dinámicos no móviles basados en microtúbulos que sobresalen de la superficie de la mayoría de las células de mamíferos. Emergen del centriolo más antiguo durante la fase G1/G0 del ciclo celular, mientras que se desmontan a medida que las células vuelven a entrar en el ciclo celular en el límite de la fase G2/M. Funcionan como centros de señales, detectando y transduciendo señales extracelulares cruciales para muchos procesos celulares. Al igual que en la mayoría de los tipos de células, se ha demostrado que todas las células madre y progenitoras neurales neocorticales (NSPC) albergan una PC que les permite detectar y transducir señales específicas requeridas para el desarrollo cortical cerebral normal. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para generar y caracterizar modelos bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) basados en células a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) para diseccionar aún más la participación de la PC durante el desarrollo neocortical. En particular, presentamos protocolos para estudiar la biogénesis y la función de la PC en NSPC derivados de rosetas neuronales 2D, incluida la transducción de la vía Sonic Hedgehog (SHH). Para aprovechar la organización tridimensional (3D) de los organoides cerebrales, describimos un método simple para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos. Después de la limpieza óptica, la rápida adquisición de organoides completos permite la detección de centrosomas y PC en progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, detallamos el procedimiento para la inmunotinción y limpieza de gruesas secciones organoides que flotan libremente, preservando un grado significativo de información espacial 3D y permitiendo la adquisición de alta resolución requerida para el análisis cualitativo y cuantitativo detallado de la biogénesis y la función de la PC.

Introduction

Los cilios primarios (PC) son orgánulos basados en microtúbulos que detectan y transducen una gran cantidad de señales químicas y mecánicas del entorno extracelular. En particular, la PC es el orgánulo central para la transducción de la vía de señalización del erizo en vertebrados1,2. Si bien se ha demostrado durante mucho tiempo que la mayoría de las células neuronales albergan una PC, la contribución de este orgánulo en la configuración del sistema nervioso central ha sido subestimada durante mucho tiempo. Los estudios sobre el desarrollo neocortical han llevado al descubrimiento de múltiples células madre y progenitoras neurales (NSPC), todas albergando una PC, cuya ubicación se ha propuesto que es crucial para la determinación del destino de los progenitores3,4,5,6,7. La PC ha demostrado ser crucial para los mecanismos celulares que se requieren para el desarrollo cortical cerebral normal, incluida la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la polaridad apicobasal del andamio glial radial que apoya la migración neuronal13. Además, se requieren PC durante la migración tangencial de las interneuronas a la placa cortical14,15. Finalmente, se ha propuesto un papel para el PC en el establecimiento de conexiones sinápticas de neuronas en la corteza cerebral16,17. En conjunto, estos hallazgos abogan por un papel crucial de la PC en los principales pasos del desarrollo cortical cerebral18,19 y plantean la necesidad de investigar su participación en los mecanismos patológicos subyacentes a las anomalías del desarrollo cortical cerebral.

Estudios recientes han mejorado en gran medida nuestra comprensión de las importantes diferencias celulares y moleculares entre el desarrollo cortical en modelos humanos y animales, enfatizando la necesidad de desarrollar sistemas modelo humanos. Desde este punto de vista, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) representan un enfoque prometedor para estudiar la patogénesis de la enfermedad en un contexto genético y celular relevante. Los modelos adherentes bidimensionales (2D) basados en células o rosetas neuronales contienen NSPC similares a los observados en la corteza cerebral en desarrollo, que se organizan en estructuras en forma de roseta que muestran una polaridad apicobasal correcta20,21,22. Además, el sistema de cultivo tridimensional (3D) permite la generación de organoides del cerebro anterior dorsal que recapitulan muchas características del desarrollo cortical cerebral humano23,24,25,26. Esos dos enfoques complementarios de modelado basado en células ofrecen perspectivas emocionantes para diseccionar la participación de la PC durante el desarrollo normal y patológico de la corteza cerebral.

Aquí, proporcionamos protocolos detallados para la generación y caracterización de rosetas neurales y NSPC derivados, así como organoides del cerebro anterior dorsal. También proporcionamos protocolos detallados para analizar la biogénesis y la función de la PC presente en los NSPC mediante la prueba de la transducción de la vía Sonic Hedgehog y el análisis de la dinámica de moléculas cruciales involucradas en esta vía. Para aprovechar la organización 3D de los organoides cerebrales, también establecimos un método simple y rentable para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos que permiten una rápida adquisición, gracias a un microscopio de lámina de luz, de todo el organoide, con alta resolución que permite visualizar PC en todo tipo de progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, adaptamos la inmunohistoquímica en secciones de flotación libre de 150 μm con posterior limpieza y adquisición utilizando microscopio confocal de barrido resonante que permite la adquisición de imágenes de alta resolución, que se requiere para el análisis detallado de la biogénesis y la función de la PC. Específicamente, el software de imágenes 3D permite la reconstrucción 3D de PC con el análisis posterior de parámetros morfológicos que incluyen longitud, número y orientación de PC, así como la medición de la intensidad de la señal de los componentes ciliares a lo largo del axonema.

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Protocol

1. Generación de modelos 2D basados en células hIPS de desarrollo neocortical

  1. Formación de rosetas neurales
    1. Comience con cultivos hIPSC que albergan grandes colonias regulares, que exhiben menos del 10% de diferenciación y no más del 80% de confluencia.
    2. Enjuague las hIPSC con 2 ml de PBS.
    3. Añadir 2 mL de medio de inducción NSPC suplementado con el inhibidor de Rock (NIM + 10 μM de Y-27632).
    4. Diseccionar manualmente cada colonia hIPSC de un plato de 35 mm usando una aguja para cortar cada colonia con precisión en direcciones horizontales y verticales para crear un patrón de tablero de ajedrez que divide cada colonia en grupos iguales.
    5. Separe la colonia con un raspador de células y transfiérala a un plato de 35 mm de fijación ultra baja.
    6. Déjelos flotar durante la noche (ON) en una incubadora humidificada a 37 ° C y 5% de CO2, para que puedan formar cuerpos embrionarios (EB).
      NOTA: Los cuerpos embrioides (EB) se definen como grupos de esferoides flotantes o agregados de hIPSC.
    7. Transfiera los EB a platos de 35 mm recubiertos de poli-L-ornitina/laminina (PO/lam) en 2 mL NIM + 10 μM de Y-27632.
    8. Actualización diaria del medio de inducción NSPC (NIM sin Y-27632) hasta la formación de rosetas neurales que tarda aproximadamente de 12 a 14 días. Verifique bajo el microscopio.
      NOTA: Después de este paso, las rosetas neurales se pueden expandir, diferenciar y procesar para el análisis de inmunotinción o disociarse para obtener células madre y progenitoras neurales (NSPC) aisladas.
  2. Expansión de la roseta neural y diferenciación temprana
    1. Corta rosetas neurales en un patrón en forma de cuadrícula con una aguja y desaloja los racimos usando un raspador celular.
    2. Transfiera las rosetas a una placa de 4 pocillos que contenga una cubierta de vidrio recubierta de PO/lam (4-5 rosetas/pozo) en 0,5 ml de medio de mantenimiento NSPC (NMM).
    3. Incubar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
    4. Actualice NMM cada dos días hasta el día 20.
    5. A partir del día 20, las rosetas neuronales de cultivo en 0,5 ml de citoquinas agotaron la NMM para permitir la diferenciación. Refresque el medio cada 2-3 días.
    6. En el día 30 y día 40 (10 o 20 días de diferenciación), fijar las rosetas con 0,5 mL de PFA al 4%, 20 min, RT.
  3. Biogénesis de PC y análisis de funciones en NSPC aislados
    1. Disociación NSPC
      1. Corte las rosetas neurales del paso 1.1.8 en un patrón similar a una rejilla con una aguja y desaloje los grupos con un raspador celular. Transfiera las células a platos de 35 mm recubiertos de PO/lam en 2 ml de NMM e incube en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      2. Actualice NMM cada dos días hasta la confluencia (aproximadamente 5-7 días).
      3. Después de raspar las células grandes y claras que rodean las rosetas neurales, recójalas manualmente y transfiéralas a platos frescos de 35 mm recubiertos de PO / lam para enriquecer los NSPC y agotar los tipos de células no neurales.
      4. Después de uno o dos pasajes manuales (repita el paso 1.3.1.3 si es necesario) necesarios para eliminar todos los tipos de células contaminantes, retire el medio y enjuague con PBS.
      5. Añadir 300 μL de tripsina al 0,05% e incubar durante 5 min a 37 °C hasta que la mayoría de las células se desprendan.
      6. Agregue 2 ml del medio que contenga 10% de FBS (DMEM + 10% de FBS) para inactivar la tripsina. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Pipetee suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo tres veces para romper los grupos de células.
      7. Centrifugadora a 300 x g durante 5 min.
      8. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en NMN.
      9. Sembrar los NSPC disociados como células individuales (1 x 105 células/cm2) en NMM en platos recubiertos de PO/lam e incubarlos en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      10. Expanda los NSPC en NMM cambiando el medio cada dos días.
        NOTA: Los NSPC se siembran a alta densidad para evitar la diferenciación.
    2. Análisis de biogénesis de PC
      1. Sembra NSPC disociadas a 100.000 células/cm2 y las incubamos en una incubadora humidificada a 37 °C y al 5% de CO2 en NMM durante 2 días.
      2. Aspirar el medio y morir de hambre de NSPC en medio agotado de citoquinas (medio de inanición NSPC, Tabla suplementaria 1) durante 48 h.
      3. Arregle los NSPC con 4% de PFA durante 20 minutos en RT.
      4. Lavar dos veces con PBS durante 5 min en RT antes de la inmunotinción.
    3. Análisis de la función de la PC: vía de señalización SHH
      1. Semilla disocia NSPC a 100.000 células/cm2 en toboganes de cámara de 8 pocillos recubiertos de PO/lam (300 μL) o platos T25 (5 mL) e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 en NMM durante 2 días.
      2. Privar a los NSPC en medio de inanición NSPC (300 μL por pocillo de deslizamiento de cámara de 8 pocillos y 5 ml en matraz T25) durante 48 h.
      3. Para inducir la vía SHH, incubar los NSPC con el medio de inanición suplementado con SHH recombinante (100 ng/mL) o SAG (500 nM); (150 μL por pocillo de un portaobjetos de cámara de 8 pocillos y 2 ml en matraz T25) durante 24 h.
      4. Fijar los NSPC cultivados en portaobjetos de cámara de 8 pocillos en 250 μL de PFA al 4% por pocillo durante 20 min a RT y lavarlos dos veces con 250 μL de PBS durante 5 min a RT antes del análisis de inmunotinción.
      5. Retire el medio y lave los NSPC cultivados en platos T25 con PBS.
      6. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% e incubar durante 5 min a 37 °C hasta que las células se desprendan.
      7. Añadir 2 mL de medio que contenga 10% de FBS (DMEM + 10% de FBS) para inactivar la tripsina y recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mL.
      8. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante para obtener pellets NSPC que se puedan criopreservar a -80 °C antes de la extracción de ARN y el análisis RT-PCR.

2. Generación de organoides del cerebro anterior dorsal

  1. Cultivo unicelular de hIPSCs
    1. Comience con las culturas hIPSC que albergan grandes colonias regulares que exhiben menos del 10% de diferenciación y que se han pasado casi una vez. Asegúrese de que las células no sean más del 80% confluentes.
    2. Lavar las colonias con 2 ml de PBS.
    3. Añadir 500 μL de reactivo de disociación celular suave (GCDR) e incubar durante 5 a 7 min a 37 °C.
    4. Aspirar el GCDR y añadir 2 mL de medio mTeRS1 suplementado con 5 μM de Y-27632.
    5. Pipetear las células suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para disociar todas las colonias en células individuales.
    6. Transfiera las células en platos recubiertos de vitronectina e incube en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      NOTA: Realizar al menos 1 paso de las hIPSCs usando GCDR antes del experimento de diferenciación para adaptar las hIPSCs a condiciones de cultivo unicelular.
  2. En el día 0, permita que las hIPSC formen cuerpos embrionarios en medio EB que contengan una baja concentración de FGF2 y una alta concentración de inhibidor de roca requerida para la supervivencia de hIPSC. Para hacerlo, siga los pasos a continuación.
    1. Lavar las colonias con 2 ml de PBS.
    2. Añadir 500 μL de reactivo de disociación celular suave (GCDR) e incubar durante 5 a 7 min a 37 °C.
    3. Aspirar el GCDR y añadir 1 mL de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632; Use una pipeta de 1 ml para separar suavemente las células y transferirlas a un tubo cónico de 15 ml.
    4. Enjuague una vez más con 2 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632, transfiera las células restantes al tubo cónico de 15 ml. Agregue inmediatamente 3 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632 al tubo cónico y homogeneice suavemente la solución utilizando una pipeta de 5 ml.
    5. Centrifugar las células disociadas a 100 x g durante 5 min.
    6. Aspire suavemente el sobrenadante y resuspenda las células en 6 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632.
    7. Centrifugar las células a 100 x g durante 5 min.
    8. Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 1 mL de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632. Use una pipeta de 1 ml para disociar suavemente las células en una suspensión de una sola célula.
    9. Inmediatamente después de resuspender las células, diluirlas y contarlas.
    10. Diluya el volumen adecuado de suspensión celular (que contiene 900,000 células) en 30 ml de medio EB suplementado con 50 μM de Y-27632 y 4 ng / ml de bFGF y mezcle suavemente la solución.
    11. Placa 9.000 células/pozo en una placa 96U de fijación ultra baja (300 μL/pocillo). Para evitar perturbar la formación de EB, incube la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 hasta el día 3 sin cambio medio.
  3. Inducción neural (inhibición dual de SMAD)
    1. El día 3, asegúrese de que los EB midan 300-400 μm y muestren bordes regulares. Si se alcanzan ambos criterios, reemplace la mitad del medio (150 μL) con el medio de inducción-1 que contiene inhibidores duales de SMAD, lo que lleva a un brillo del contorno de los EB en el día 6 al día 7, lo que indica diferenciación neuroectodérmica (Tabla suplementaria 2).
    2. En el día 4, reemplace 3/4 del medio (225 μL) por medio de inducción-1.
    3. En el día 6 y día 8: Refrescar la mitad del medio de inducción-1 (150 μL).
  4. Incrustación de organoides en la matriz de la membrana basal (Día 10)
    1. El día 10, incruste EB en la matriz de membrana basal reducida (BMM) del factor de crecimiento.
      NOTA: A partir de este paso, utilice siempre tijeras estériles para cortar la abertura de las puntas de la pipeta para evitar dañar los organoides por pipeteo repetido.
    2. Primera transferencia alrededor de 15-17 organoides en tubos cónicos. Deje que los EB se asienten y retire el medio. Añadir 50 μL de medio de inducción-2 y transferirlos a un tubo de microcentrífuga que contenga 100 μL de BMM.
    3. Extienda la mezcla de matriz y EB en el centro de un pozo de una placa de fijación ultra baja y separe los EB para evitar que se fusionen.
    4. Deje que el BMM se solidifique en la incubadora a 37 °C durante 45 min.
    5. Añadir 3 mL del medio de inducción-2 en cada pocillo y colocar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2.
      NOTA: Asegúrese de que este procedimiento se realice lo más rápido posible, ya que BMM se solidifica a temperatura ambiente.
  5. Cultivo estacionario de organoides incrustados en la matriz de la membrana basal
    1. Día 12, 14: Actualizar la inducción media-2.
    2. Día 16: Refrescar el medio de inducción-2 y comprobar bajo un microscopio la expansión de las asas neuroepiteliales.
  6. Disociación y cultivo de la matriz de la membrana basal en un agitador orbital
    1. El día 17, disociar los organoides de BMM mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 5 ml y transferirlos a la diferenciación media-1 (sin vitamina A). Incubar en un agitador orbital a 80 rpm en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 para mejorar la absorción nutricional.
      NOTA: Use una incubadora diferente para el cultivo estacionario y el cultivo en un agitador orbital para evitar cualquier vibración perjudicial para el crecimiento de células hIPS adherentes.
    2. Día 19: Refrescar la diferenciación media-1.
    3. Día 21: Cambiar diferenciación media-1 a diferenciación media-2 (con vitamina A).
    4. Del día 23 al día 35: Refrescar el medio con diferenciación media-2 cada 2-3 días.
    5. Del día 35 al día 70: Refrescar la diferenciación media-2 con un 1% de BMM y actualizar cada 2-3 días.
    6. Recoger los organoides después de 28, 42 y 70 +/- 2 días de diferenciación y fijarlos durante la noche a 4 °C, en 5 mL 4% PFA en un tubo cónico de 15 mL.
    7. Para un análisis de inmunotinción adicional en toto o flotante, los organoides se enjuagan dos veces en PBS y se conservan a 4 ° C en PBS + azida de sodio al 0,05%.
    8. Para el análisis de inmunotinción en secciones congeladas, sumerja los organoides fijos de PFA al 4% en sacarosa al 30% al 10 ml a +4 °C ON (o hasta que los organoides se hundan). Intértelos en una matriz de incrustación congelada y guárdelos a -80 ° C hasta la crioseccionación.

3. In toto inmunoetiquetado, limpieza y adquisición de láminas de luz de organoides del cerebro anterior dorsal

  1. Fijación
    1. Recoja los organoides en placas de 6 pocillos, retire el medio y fíjelos con 2 ml de PFA al 4%, a 4 ° C, durante la noche.
    2. Realizar tres lavados en 2 mL de PBS a temperatura ambiente.
    3. Transfiera los organoides en tubos de 2 ml y guárdelos a 4 °C en 2 ml de PBS + azida de sodio al 0,05%.
  2. Permeabilización
    1. Incubar organoides en 1 ml de PBS que contenga 0,2% de Tritón X100 en RT durante 1 h. Haga esto dos veces.
    2. Incubar en 1 mL de PBS que contenga 0,2% tritón X100 y 20% DMSO, a 37 °C, durante la noche.
    3. Incubar en 1 mL de PBS que contenga 0.1% Tween20, 0.1% Triton X100, 0.1% Desoxicolato, 0.1% NP40 y 20% DMSO, a 37 °C, durante la noche.
    4. Incubar en 1 mL de PBS que contenga 0,2% Triton-X100, en RT, durante 1 h. Haga esto dos veces.
  3. Bloqueo e inmunoetiquetado
    1. Bloqueo en 1 mL de solución bloqueadora (PBS, 0.2% Triton X100, 6% Donkey Serum, 10% DMSO), a 37 °C, ON.
    2. Incubar con anticuerpos primarios diluidos en 250 μL de PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/mL de heparina, 5% DMSO y 3% Donkey Serum, a 37 °C, durante 2 días.
    3. Lavar en 1 ml de PBS que contenga Tween20 al 0,2% y 0,1 μg/ml de heparina, durante 1 h, a 37 °C. Haz esto cuatro veces.
    4. Lavar en 1 ml de PBS que contenga Tween20 al 0,2% y 0,1 μg/ml de heparina, durante la noche, a 37 °C.
    5. Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en 250 μL de PBS que contengan 0,2% Tween 20, 0,1 μg/mL de heparina y 3% de suero de burro, a 37 °C, durante 2 días.
    6. Lavar en 1 ml de PBS que contenga 0,2% Tween 20 y 0,1 μg/ml de heparina, durante 1 h, en una rueda, en RT. Haz esto cuatro veces.
    7. Lavar en 1 ml de PBS que contenga 0,2% Tween 20 y 0,1 μg/ml de heparina, durante la noche, en una rueda, en RT.
    8. Lavar en 1 ml de PBS, durante 24 h, en RT.
    9. Stock a +4 °C en 1 mL de PBS y azida de sodio al 0,05% hasta la liquidación.
  4. Limpieza en TDE (2,2′ -Tiodietanol)
    1. Incubar los organoides en 1 mL de TDE al 30% (3 mL de TDE + 7 mL de PBS), durante 24 h, a RT.
    2. Incubar en 1 mL de TDE al 60% (6 mL de TDE + 4 mL de PBS), durante 24 h, a RT.
    3. Incubar en 1 mL de TDE al 80% (8 mL de TDE + 2 mL de PBS), durante 24 h, a RT.
  5. Incrustación de organoides antes de la adquisición de la hoja de luz
    NOTA: Utilice un sistema personalizado; hecho con una jeringa de 1 ml con la punta cortada con un bisturí.
    1. Preparar 100 mL de Agarosa de Baja Fusión al 4% en solución de TDE al 60% y alícuota en tubos de 2 mL. Conservar a +4 °C.
    2. Antes de la incrustación de organoides, precaliente un tubo que contenga 1,5 ml de agarosa de baja fusión al 4% en TDE al 60% en un baño de agua a 37 °C hasta que se licúe.
    3. Mientras tanto, prepare un sistema de moldeo a medida hecho de una jeringa de 1 ml cuya punta se corta con un bisturí.
    4. Bombee en la jeringa 600 μL de la solución de gel con el émbolo.
    5. Coloque la muestra con una punta de pipeta agrandada cuya abertura se haya cortado con tijeras estériles.
    6. Rellene la jeringa con 400 μL de solución de gel para que la muestra se coloque dentro del tercio inferior de la jeringa.
    7. Deje polimerizar el gel y almacene en una solución de TDE al 80% a 4 °C protegida de la luz hasta su adquisición.
    8. Para la adquisición de láminas ligeras, utilice un objetivo 20x inmerso en una solución de TDE al 80% agregada en la cámara de muestra para permitir ajustar con precisión al índice de refracción del método de limpieza.
    9. Inserte la jeringa que contiene el organoide incrustado de agarosa en el soporte de muestra más grande diseñado para acomodar una jeringa de 1 ml cuyo émbolo se puede operar para colocar el organoide frente al objetivo.
      NOTA: La adquisición de láminas ligeras de un organoide completo toma aproximadamente de 5 a 10 minutos.

4. Inmunotinción y limpieza de secciones flotantes de organoides dorsales del cerebro anterior

  1. Fijación, incrustación de agarosa y seccionamiento de los organoides
    1. Recolectar organoides después de 28, 42 y 70 +/- 2 días de diferenciación en una placa de 6 pocillos y fijarlos durante la noche a 4 °C en 2 mL de PFA al 4%.
    2. Enjuague dos veces en 2 ml de PBS y conserve a 4 °C en 2 ml de PBS + azida de sodio al 0,05%.
    3. Incruste los organoides fijos en agarosa de baja fusión al 4% en un molde de incrustación de plástico (7 x 7 mm). Retire con cuidado el bloque de agarosa del molde de plástico y péguelo a la etapa de vibratomo.
    4. Seccionar los organoides incrustados utilizando un vibratomo para obtener secciones de flotación libre de 150 μm transferidas en un pozo de una placa de 24 pocillos que contiene 500 μL de PBS utilizando un pincel para evitar dañar las secciones.
      NOTA: Se recomienda la agarosa de baja fusión ya que su temperatura de fusión es de solo aproximadamente 60 ° C. Prepare agarosa de baja fusión al 4% en solución de PBS y déjela enfriar justo por encima de 37 ° C en un baño de agua antes de la incrustación de organoides.
  2. Permeabilización, bloqueo e inmunotinción
    1. Incubar las secciones en 500 μL de PBS que contengan 0,3% tritón X100, en RT, bajo agitación, durante 20 min. Haz esto tres veces.
    2. Incubar las secciones en 500 μL de PBS que contengan 0,3% de Tritón X100 y 5% de Leche descremada, en RT, bajo agitación, durante 2 h.
    3. Incubar las secciones en 250 μL de solución primaria de anticuerpos (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% leche descremada), bajo agitación, a +4 °C, durante la noche.
    4. Lavar las secciones en 500 μL de PBS, en RT, bajo agitación, durante 20 min. Haz esto cuatro veces.
    5. Incubar las secciones en 250 μL de solución secundaria de anticuerpos (PBS + Tritón X100 al 0,3% + leche descremada al 1%), a RT, bajo agitación, durante 2 h.
    6. Lavar las secciones en 500 μL de PBS, en RT, bajo agitación, durante 20 min. Haz esto cuatro veces.
    7. Almacene las secciones en 500 μL de PBS, a +4 ° C hasta la limpieza.
  3. Limpieza en TDE (2,2′ -Tiodietanol)
    1. Incubar las secciones en 500 μL de 30% y 60% TDE durante 1 h cada una en RT, y luego en 500 μL de TDE al 80% durante la noche, en RT.
    2. Almacene las secciones despejadas en 500 μL de TDE al 80% hasta la adquisición a +4 °C.
  4. Montaje de secciones de flotación libre antes de la adquisición con escaneo resonante confocal
    1. Monte una sección de flotación libre en una cámara sellada que permita mantener la muestra en una solución de TDE al 80% y diseñada para adaptarse a una etapa XY motorizada de microscopios confocales.
    2. Coloque una cubierta redonda en el sistema de cámara.
    3. Transfiera cuidadosamente la sección inmunoteñida despejada con un pincel.
    4. Llene la cámara con una solución de TDE al 80%.
    5. Agregue dos fundas estándar más una segunda funda redonda y un sello de silicona.
    6. Atornille el anillo de atornillado de la cámara para sellar perfectamente el sistema.

5. Hoja de luz y análisis confocal de escaneo resonante

  1. Procese las adquisiciones de hojas de luz y escaneo resonante utilizando un software que permite la visualización y el análisis en 3D de toda la muestra inmunoteñida.
    NOTA: Dicho software permite abrir rápidamente datos enormes para hacer fácilmente instantáneas y animaciones. Permite mover la muestra en diferentes orientaciones y generar vistas 2D gracias a una herramienta de segmentación de datos 2D en diferentes orientaciones, XY y YZ por ejemplo.
  2. Para la detección automática tanto de centrosomas como de cilios primarios, utilice un asistente de manchas que permita cuantificar su número en condiciones patológicas frente a condiciones de control.
  3. Para la reconstrucción 3D de PC que permite una medición precisa de su longitud, use un asistente de filamento para fijar manualmente el punto de partida de la PC y el software utiliza la señal de fluorescencia para reconstruir la PC con precisión.

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Representative Results

Modelos 2D basados en células hIPS para estudiar la biogénesis y la función del cilio primario
El protocolo aquí detallado ha sido adaptado de estudios publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite la generación de estructuras de rosetas neurales que contienen progenitores neocorticales y neuronas similares a las observadas en el neocórtex en desarrollo. La validación detallada se puede realizar mediante análisis de inmunotinción convencional utilizando fabricantes específicos3. Por ejemplo, los progenitores apicales (AP) deben teñirse dos veces con SOX2 y PAX6, los progenitores intermedios (IP) se revelan por tinción TBR2 / EOMES, y las neuronas neocorticales nacidas temprano se revelan por tinción CTIP2 (Figura 1A-C). Tales estructuras neuronales similares a rosetas modelan la migración nuclear intercinética (INM) de AP que se puede visualizar mediante inmunotinción con anticuerpos levantados contra la fosfo-vimentina, que tiñe los núcleos mitóticos y TPX2 que tiñe el huso mitótico. Estos marcadores, por lo tanto, permiten el análisis de varias características de AP, incluyendo el INM con división celular para tener lugar apicalmente alrededor de la luz central (Figura 1D, D'), así como el modo de división determinado midiendo el ángulo entre el plano de división y la superficie apical. Finalmente, la ciliogénesis se puede analizar mediante inmunotinción con anticuerpos elevados contra PCNT, que tiñe el cuerpo basal de PC, y ARL13B que tiñe el axonema. En tales estructuras de roseta, la PC se extiende desde el polo apical de los AP hasta la luz central de cada región similar a un ventrículo (Figura 1E, E'), mientras que también sobresalen de las neuronas CTIP2+ (Figura 1E'').

La disociación de estas estructuras de roseta permite obtener NSPC aislados cultivados en placas de cultivo recubiertas de poli-L-ornitina/laminina en NMM a alta densidad para permitir el mantenimiento de una población estable y expandible de NSPC durante al menos 15 pasajes sin acumular anomalías cariotipos21,27. Para analizar la biogénesis de la PC, los NSPC disociados se cultivan hasta la confluencia y se mueren de hambre durante 48 h. Los análisis de inmunotinción utilizando anticuerpos levantados contra marcadores de PC muestran que esos NSPC albergan PC (Figura 2A). Al combinar dos herramientas complementarias de código abierto, Ilastik, una herramienta de análisis de imágenes basada en el aprendizaje automático útil para la segmentación de PC28 y CiliaQ, un paquete de complementos Fiji/ImageJ29, que permite la reconstrucción 3D de PC a partir de pilas de imágenes confocales 3D, se pueden evaluar fácilmente varios parámetros estructurales, incluido el número de PC y su longitud.

La función de PC de los NSPC también se puede evaluar probando la transducción de la vía de señalización de Hedgehog. Para evaluar la transducción de la vía de señalización de SHH, los NSPC se mueren de hambre durante 48 h y se tratan con SHH recombinante (rSHH) o un agonista suavizado (SAG) durante 24 h. Utilizando anticuerpos levantados contra GPR161, SMO y GLI2, el análisis inmunofluorescente (IF) permite probar el tráfico de estos actores clave de señalización SHH a lo largo de la PC, con GPR161 normalmente saliendo de la PC mientras gli2 y SMO se acumulan dentro de la PC en respuesta a la activación de la vía SHH (Figura 2C-D). El análisis de pilas de imágenes confocales 3D utilizando herramientas CiliaQ permite cuantificar la salida gpR161 del PC, así como la acumulación de GLI2 y SMO dentro del PC después de la activación de la vía SHH (Figura 2F-G). Además, el análisis semicuantitativo de RT-PCR en ARNm extraído de NSPC tratados con rSHH o SAG muestra la inducción de dos genes diana de SHH, GLI1 y PTCH1, que atestiguan la transducción normal de señalización de SHH en NSPC derivada de hIPSC de control (Figura 2B).

En general, los modelos basados en células 2D del cerebro anterior dorsal en desarrollo reproducen claramente varios aspectos del desarrollo normal de la corteza cerebral y representan herramientas prometedoras para diseccionar los mecanismos asociados a LA PC que subyacen a las anomalías del desarrollo neocortical utilizando hIPSC de control versus paciente que albergan mutaciones en genes responsables de anomalías del desarrollo humano de la corteza cerebral.

Modelos 3D basados en células hIPS para estudiar la afectación primaria del cilio durante el desarrollo neocortical
El protocolo descrito aquí (Figura 3A) ha sido adaptado de protocolos publicados anteriormente23,24,25,26,30 y probado con éxito en cinco líneas de control hIPSC distintas. Permite la generación de organoides del cerebro anterior dorsal derivados de hIPSC que aumentan de tamaño con el tiempo mientras forman grandes asas neuroepiteliales (Figura 3B). El análisis de inmunoetiquetado, ya sea en criosecciones organoides (criostato, 20 μm), secciones de flotación libre (vibratome, 150 μm) o in toto, se puede realizar para controles de calidad. En el día 28 ± 2, los organoides consisten en asas neuroepiteliales estratificadas que coexpresan el marcador del progenitor neural SOX2 y el marcador del cerebro anterior dorsal PAX6, que atestigua la identidad del cerebro anterior dorsal. En el día 42 ± 2 (6 semanas de diferenciación), esos bucles deberían mostrar una organización estratificada más compleja. Desde la superficie apical hasta la basal de estas estructuras de asa, se puede delinear una región similar a la zona ventricular (VZ) con progenitores gliales radiales apicales (aRG) SOX2/PAX6 positivos, así como una región similar a la zona subventricular (SVZ) con progenitores intermedios (IP) positivos para TBR2 y una región similar a la placa cortical (CP) que contiene neuronas neocorticales de nacimiento temprano positivas para CTIP2 (Figura 3C, E). La polaridad molecular apical de aRG puede ser evaluada por el enriquecimiento apical en la superficie ventricular de ZO-1 y N-CADH (Figura 4A, Video 1). Las propiedades de división progenitora de aRG se pueden evaluar utilizando marcadores TP2X y P-VIM para analizar inM que normalmente conduce a la alineación de núcleos mitóticos aRG en la superficie ventricular de los bucles corticales (Figura 4B, Video 2). Dicho inmunoetiquetado también permite la medición del ángulo de división para evaluar el modo de división simétrica versus asimétrica de aRG. Los progenitores positivos de P-Vim también se pueden observar en la región similar a SVZ, albergando un proceso basal único que se extiende a la superficie basal que recuerda a la glía radial externa (oRG o glía radial basal, Figura 4C, Video 2). Si bien están ausentes de los organoides del día 42, las neuronas tardías positivas para SATB2 deben detectarse a partir del día 70 (10 semanas de diferenciación) (Figura 3D, F), lo que atestigua el momento in vivo de la diferenciación neuronal neocortical.

Los experimentos de inmunoetiquetado utilizando los marcadores de cuerpo basal (gamma Tubulina) y axonema (ARL13B) permiten la visualización de PC en criosecciones de 20 μm (Figura 3G,H). Para aprovechar la organización 3D de los organoides del cerebro anterior dorsal, se puede realizar inmunotinción de montaje completo. La adquisición de láminas de luz de tales organoides inmunoteñidos y eliminados permite la detección de centrosomas y PC en todos los tipos de NSPC, así como en neuronas neocorticales (Video 3). Además, para realizar análisis más precisos de la biogénesis de la PC, se puede realizar un análisis inmunohistoquímico en secciones gruesas flotantes (150 μm) de organoides del cerebro anterior dorsal. Después de la limpieza, dichas secciones se pueden adquirir utilizando un objetivo de aceite de 40x (NA 1.3) o 63x (NA 1.4) de un microscopio láser confocal de luz blanca resonante invertido, lo que permite mejorar la resolución al tiempo que preserva la información espacial 3D de los organoides. Este microscopio confocal de barrido láser permite la adquisición rápida de secciones gruesas, con una excitación y detección precisas y flexibles sin ninguna interferencia (Video 4). Se pueden evaluar varios parámetros estructurales de la PC, incluido el número de PC, la longitud y la orientación, utilizando un software de imágenes 3D. Las herramientas dedicadas de código abierto y disponibles gratuitamente como Ilastik28, una herramienta de análisis de imágenes basada en el aprendizaje automático, así como el paquete de complementos CiliaQ en Fiji / ImageJ29 son muy útiles para la segmentación automática de PC que permite el análisis cualitativo y cuantitativo posterior de la biogénesis y la función de la PC en el control frente a las condiciones patológicas.

Figure 1
Figura 1: Generación y caracterización de rosetas neuronales 2D. Caracterización inmunohistoquímica de estructuras de roseta neural utilizando (A) anticuerpos SOX2 y PAX6 para detectar AP, (B) TBR2/EOMES para revelar IP, y (C) CTIP2 para teñir neuronas neocorticales de nacimiento temprano. Los AP proliferantes se detectan con anticuerpos fosfo-vimentina y TPX2 y se localizan en la superficie apical (D,D'). Los PC se revelan por doble inmunotinción con anticuerpos PCNT y ARL13B. Los PC se extienden desde cada AP hasta el lumen central de cada roseta, mientras que también se detectan en las neuronas IP y de nacimiento temprano (E, E', E''). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los NSPC aislados derivados de rosetas neuronales 2D albergan PC funcional. La disociación de rosetas neuronales 2D da lugar a NSPC aislados que albergan PC después de la inanición durante 48 h, según lo revelado por la inmunotinción (A) ARL13B y PCNT. Los NSPC albergan PC funcional como lo revela la cuantificación rt-PCR de dos genes diana SHH GLI1 y PTCH1 después de la inanición durante 48 h y la posterior activación de la vía mediante el tratamiento con SHH recombinante (rSHH) durante 24 h. Los datos de expresión de GLI1 y PTCH1 se realizaron por triplicado y se normalizaron a datos de expresión de ACTB . Los datos fueron analizados con el método 2−ΔΔCt y presentados como expresión relativa ± SEM (test de Mann Whitney) (B). Análisis de FI en NSPC hambrientos con (D) o sin (C) tratamiento con rSHH para probar la dinámica de dos actores cruciales de la vía de señalización de SHH, GLI2 y GPR161, que respectivamente acumulan o salen de la PC después de la activación de la vía SHH. Mediante la combinación de las herramientas Ilastik y CiliaQ para el análisis de imágenes confocales, se comparó la intensidad de la señal GPR161 (F) y GLI2 (G) dentro de la PC en los NSPC tratados con +/- rSHH. Se utilizó la tinción ARL13B para la segmentación del PC y, como se esperaba, la longitud del PC no se modificó en los NSPC tratados con +/- rSHH (E). Los datos se resumen en gráficos de caja y bigotes (valores medios ± SEM). p < 0,0001 (prueba de Mann Whitney). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Generación y caracterización de organoides del prosencéfalo dorsal. (A) Visión general esquemática del protocolo para generar organoides del cerebro anterior dorsal. (B) Imágenes representativas de campo brillante de organoides en los días 1, 3, 7, 24 y 42 de diferenciación. Imágenes confocales de criosecciones de 20 μm de organoides en los días 42 (C) y 70 (D) después de la inmunotinción con anticuerpos SOX2, TBR2 y CTIP2 delineando, respectivamente, la zona ventricular (VZ), la zona subventricular (SVZ) que contiene IP positiva de TBR2 y la región similar a una preplatriz (CP) que contiene neuronas neocorticales de nacimiento temprano positivas de CTIP2. Imágenes confocales de criosecciones de 20 μm de organoides en los días 42 (E) y 70 (F) después de la inmunotinción con anticuerpos PAX6, CTIP2 y SATB2 que muestran la aparición de neuronas SATB2 positivas para el nacimiento tardío en el día 70. Imágenes confocales de criosecciones de 20 μm de un organoide en el día 42 después de la inmunotinción con anticuerpos ARL13B y PCNT que revelan PC en el polo apical de los progenitores gliales radiales (G) mientras que también están presentes en las neuronas CTIP2 positivas (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes en 3D de organoides del cerebro anterior dorsal. (A) Adquisición en hoja de luz de un organoide del prosencéfalo dorsal completo (Día 42) teñido con anticuerpos PAX6, N-CADH y CTIP2 que muestran los múltiples asas neuroepiteliales con progenitores gliales radiales PAX6 positivos que exhiben una polaridad apicobasal correcta como lo revela la acumulación de N-cadherina en su lado apical y neuronas neocorticales tempranas CTIP2 positivas que delinean una región similar a la prepolada. (B) Adquisición en lámina de luz de un organoide entero del prosencéfalo dorsal (Día 42) teñido con anticuerpos TPX2, P-Vim y CTIP2 que ilustran la migración nuclear intercinética de progenitores gliales radiales ventriculares. (C) Zoom en la adquisición de la lámina de luz de un organoide entero del cerebro anterior dorsal (Día 42) teñido con anticuerpos TPX2 y P-Vim que muestra un progenitor que extiende un proceso basal único y localizado en la zona subventricular, que recuerda a un progenitor glial radial externo. (D) Adquisición por escáner resonante de una sección de 150 μm de un organoide del prosencéfalo dorsal (día 42) teñido con anticuerpos PCNT y ARL13B que muestra PC en NSPC y neuronas neocorticales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Generación y caracterización de modelos basados en células hIPS 2D y 3D del desarrollo del cerebro anterior dorsal para diseccionar la participación de PC en la fisiopatología de las anomalías corticales cerebrales. Se permite que las células hIPS formen cuerpos embrioides (EB) en placas de cultivo de baja adhesión, y luego se incuban en un medio de inducción que contiene inhibidores duales de SMAD para inducir la diferenciación neuroectodérmica. La adhesión de los EB en platos recubiertos de PO / lam permite la generación de estructuras de roseta neural 2D, mientras que el cultivo de flotación libre de ebs con la posterior incrustación en BMM permite la generación de organoides del cerebro anterior dorsal. La retirada de los factores mitogénicos del medio de roseta neural adherente promueve el inicio de la neurogénesis que puede ser probada por el análisis de IF. La disociación de rosetas neurales adherentes permite la generación de cultivos NSPC aislados útiles para la biogénesis de PC y el análisis de funciones. Los organoides del cerebro anterior dorsal se recogen después de 4, 6 o 10 semanas de diferenciación y se fijan para su posterior análisis de inmunotinción, ya sea en toto, en secciones de 150 μm de espesor o criosecciones de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Adquisición en hoja de luz de un organoide del prosencéfalo dorsal completo (Día 42) inmunoteñido con anticuerpos PAX6, CTIP2 y NCADH. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Adquisición de láminas de luz de un organoide del cerebro anterior dorsal completo (Día 42) inmunoteñido con anticuerpos TPX2, P-VIM y CTIP2. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 3: Adquisición en hoja de luz de un organoide entero del prosencéfalo dorsal (Día 42) inmunoteñido con anticuerpos PCNT y ARL13B. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 4: Adquisición confocal de exploración resonante de una sección de 150 μm de un organoide del prosencéfalo dorsal (Día 42) inmunoteñido con anticuerpos ARL13B y PCNT. Haga clic aquí para descargar este video.

ARCHIVOS COMPLEMENTARIOS: Haga clic aquí para descargar las Tablas.

Tabla complementaria 1: Receta de los medios utilizados para la generación de rosetas neuronales 2D y NSPC.

Tabla complementaria 2: Receta de los medios utilizados para la generación de organoides del cerebro anterior dorsal.

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Discussion

En la actualidad, los PC se consideran orgánulos clave que regulan pasos cruciales durante el desarrollo cortical cerebral normal18,19,31 incluyendo la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la migración neuronal13,14 y la sinaptogénesis16,17 . Además del análisis en modelos animales o tejidos cerebrales fetales humanos, la generación de modelos altamente innovadores y relevantes basados en hIPSC derivados del paciente del desarrollo neocortical es esencial para diseccionar el papel de la PC durante el desarrollo cortical cerebral normal y patológico.

El protocolo de modelado basado en hIPSC 2D que se detalla aquí fue adaptado de tres publicaciones principales20,21,22. La diferenciación neuroepitelial es inducida por la inhibición dual de SMAD utilizando inhibidores de moléculas pequeñas de las vías activina/ganglionar (SB-431542) y BMP (LDN-193189)22. Las células se organizan en estructuras en forma de roseta que contienen NSPC, así como neuronas de capa profunda neocortical después de 20 días de diferenciación. Además, estas estructuras en forma de roseta muestran una polaridad apicobasal correcta, migración nuclear intercinética de progenitores apicales, así como PC que se extiende desde todos los NSPC y neuronas. Tras la disociación de estas estructuras de roseta, se obtiene una población homogénea y estable de progenitores corticales21. Cuando se cultivan hasta la confluencia y se mueren de hambre durante 48 h, esos progenitores corticales albergan PC para el cual la morfología, el número y la longitud se pueden analizar fácilmente combinando el paquete de complementos Ilastik28 y CiliaQ28,29 en Fiji / ImageJ. Además, mediante el uso de citoquinas para inducir la vía de señalización SHH, la función PC también puede ser utilizada por IF para probar la dinámica de actores cruciales de la vía de señalización a lo largo de la PC, como GLI2, SMO y GPR161. Además, los ensayos semicuantitativos de RT-PCR permiten probar la inducción de la expresión génica objetivo de SHH, incluidos GLI1 y PTCH1, en respuesta a la activación de la vía SHH. También se deben probar otras vías de señalización dependientes de la función de PC, incluidas las vías WNT e IGF2,32,33. Para concluir sobre este enfoque de modelado 2D, que reproduce claramente varios aspectos del desarrollo normal de la corteza cerebral, representa una herramienta útil y relevante para probar la biogénesis y la función de la PC en condiciones normales frente a patológicas y debería contribuir a obtener más información sobre la participación de la PC durante el desarrollo neocortical.

Complementarios a los enfoques de modelado basados en hIPSC 2D, los organoides del cerebro anterior dorsal ofrecen oportunidades sin precedentes para investigar el desarrollo cerebral normal y patológico in vitro, ya que recapitulan muchas características y características de la corteza cerebral humana en desarrollo temprano. Actualmente se utilizan dos tipos principales de protocolos: el intrínseco y el método guiado. El protocolo intrínseco desarrollado por Lancaster y sus colegas23 se basa en la capacidad intrínseca de las IPSC para autoorganizarse con factores externos mínimos y da lugar a organoides cerebrales que contienen rudimentos de distintas regiones cerebrales que ofrecen una oportunidad única para modelar las interacciones entre diferentes regiones cerebrales. Sin embargo, la alta variabilidad y heterogeneidad inherentes a dicha estrategia de modelado presentan desafíos significativos de reproducibilidad. Los protocolos guiados de diferenciación organoide permiten la generación de organoides específicos de la región cerebral con una heterogeneidad mínima24,25,26. Este enfoque nos permitió generar con éxito organoides del cerebro anterior dorsal con estructuras similares a ventrículos que recapitulan los principales procesos del desarrollo cortical cerebral humano temprano. El primer problema crítico es comenzar con cultivos hIPSC de alta calidad que albergan grandes colonias regulares que exhiben menos del 10% de diferenciación y que se han pasado casi una vez como monocapa para adaptar los hIPC a las condiciones de cultivo unicelular. De hecho, para limitar la heterogeneidad organoide, uno de los principales desafíos en el campo, la formación de EB con un tamaño homogéneo es un requisito previo que implica la necesidad de disociación de las colonias de hIPSC en suspensión unicelular que permita la siembra a la densidad celular definida. Otro paso crítico es la inclusión BMM de EB, necesarios para soportar la estructura 3D y la expansión neuroepitelial. Favorecimos la inclusión grupal de unos quince organoides sobre la inclusión individual aunque implique un paso adicional, la disociación BMM. Se ha demostrado que la disociación de BMM antes del cultivo de agitación reduce la variabilidad dentro y entre lotes de organoides, lo que resulta en una mayor reproducibilidad34. Además, permite deshacerse de los procesos celulares que se extienden hacia el BMM que no son perjudiciales para los siguientes pasos de diferenciación, pero que dificultan la observación de organoides para la inspección de calidad durante los pasos posteriores del procedimiento. Para mejorar la absorción nutricional y el intercambio de oxígeno, comparamos la maduración de los organoides en agitadores orbitarios y biorreactores giratorios que condujeron a resultados similares. Por lo tanto, elegimos la opción de agitador orbital, ya que permite reducir significativamente los volúmenes medios y, por lo tanto, el costo total de los experimentos. Es importante destacar que use una incubadora diferente para el cultivo estacionario y de agitación en un agitador orbital para evitar cualquier vibración perjudicial para el crecimiento adherente de hIPSC. Aplicamos con éxito este protocolo en cinco líneas de control hIPSC distintas35 que dan lugar a resultados homogéneos asegurando la robustez de este procedimiento.

La caracterización de tales organoides se puede lograr utilizando varios métodos. Para preservar la información espacial 3D dentro de los organoides, establecimos un protocolo que permite la inmunotinción de montaje completo y la limpieza de organoides completos con la posterior adquisición de láminas de luz. Han surgido diferentes métodos de desbroce con eficiencia en función del origen y espesor de la muestra36,37. Aquí, establecimos un método de limpieza simple, rápido y rentable que se basa en TDE (2,2'-tiodietanol), un derivado del glicol utilizado anteriormente para eliminar el cerebro del ratón y los organoides intestinales38,39. La adquisición de organoides inmunoteñidos y eliminados se realizó en un microscopio de lámina de luz utilizando un objetivo 20x inmerso en 80% de TDE. En comparación con otros métodos de adquisición de imágenes 3D, la microscopía de láminas de luz es de interés por varias razones: adquisición rápida, buena penetración y fotoblanqueo reducido. La optimización del paso de permeabilización permite alcanzar una penetración de anticuerpos eficiente y homogénea, lo que permite visualizar cuerpos basales y axonemas de PC que se extienden desde todos los tipos de células progenitoras y neuronales de todo el organoide. Además, la adquisición de secciones de 150 μm de espesor que flotan libremente utilizando un microscopio confocal de barrido resonante invertido con objetivos de aceite de 40x (NA 1.3) o 63x (NA 1.4) permite obtener más resolución, al tiempo que conserva un grado significativo de información espacial 3D y permite el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y la función de la PC.

La combinación de tales modelos basados en células 2D y 3D y el análisis de imágenes 3D (Figura 5) en hIPSC generadas ya sea mediante la reprogramación de células de pacientes con ciliopatía o mediante el uso de la tecnología CRISPR / CAS9 para editar específicamente genes centrosómicos o ciliares debería permitir un progreso significativo en la comprensión de la contribución de la PC durante el desarrollo normal y patológico de la corteza cerebral. Es importante destacar que la tecnología de edición del genoma también permite rescatar específicamente las mutaciones de los pacientes para obtener hIPSC de control isogénico para superar la heterogeneidad genética que desafía la detección de los mecanismos de la enfermedad. Además, los enfoques genómicos unicelulares se utilizan ahora ampliamente en todo el campo y representan enfoques relevantes y complementarios para el análisis de inmunotinción. Por lo tanto, a pesar de algunas limitaciones y dificultades inherentes a todas las tecnologías emergentes, y que se están abordando ampliamente, tales modelos basados en hIPSC 2D y 3D y los métodos de caracterización que presentamos aquí ofrecen herramientas poderosas y relevantes para diseccionar la participación de la PC en los mecanismos patológicos subyacentes a las anomalías neocorticales del desarrollo humano.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) y N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 y ANR-19-CE16-0002-01). LB cuenta con el apoyo de la ANR en el marco del programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) y la Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). El Imagine Institute cuenta con el apoyo de fondos estatales de la ANR en el marco del programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, proyectos CrossLab) y como parte del segundo programa Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

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References

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Biología del desarrollo Número 181 cilio primario células madre pluripotentes inducidas por humanos hIPSC células madre y progenitoras neurales desarrollo cortical cerebral humano rosetas neurales organoides del cerebro anterior dorsal modelos de desarrollo neocortical basados en hIPSC 2D y 3D organoides cerebrales erizo sónico inmunotinción de montura completa limpieza óptica microscopio de hoja de luz
Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical
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