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Developmental Biology

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

Abstract

1차 섬모(PC)는 대부분의 포유류 세포의 표면에서 튀어나온 비운동적 동적 마이크로투룰계 세포기관이다. 그(것)들은 세포 주기의 G1/G0 단계 도중 오래된 중심에서 나타나고, 세포가 G2/M 상 경계에서 세포 주기를 다시 입력할 때 분해하는 동안. 그들은 많은 세포 프로세스에 중요한 세포 외 신호를 감지하고 변환하여 신호 허브로 작동합니다. 대부분의 세포 유형과 유사하게, 모든 신코르티칼 신경줄기 및 전구 세포(NSPC)는 정상 뇌피질 발달에 필요한 특정 신호를 감지하고 변환할 수 있도록 PC를 수용하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 신피성 발달 시 PC의 참여를 더욱 해부하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(hIPSC)로부터 2차원(2D) 및 3차원(3D) 세포 기반 모델을 생성하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히 소닉 고슴도치(SHH) 경로의 트랜스듀션을 포함한 2D 신경 로제트 유래 NSPC에서 PC 생체 발생 및 기능을 연구하는 프로토콜을 제시합니다. 대뇌 오르가노이드의 3차원(3D) 조직을 활용하기 위해 토토 면역스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 광학 클리어링 후, 전체 오르가노이드를 빠르게 획득하면 전체 오르가노이드의 신코르테컬 전구및 뉴런에서 센트로좀과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 3D 공간 정보의 상당한 정도를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 질적 및 정량적 분석에 필요한 고해상도 획득을 허용하는 두꺼운 자유 부동 오르가노이드 섹션의 면역 염색 및 청산 절차를 자세히 설명합니다.

Introduction

1차 섬모(PC)는 세포외 환경에서 과다한 화학 및 기계적 단서를 감지하고 트랜스포우하는 마이크로투벨계 세포기관입니다. 특히, PC는 척추동물에서 고슴도치 신호 경로의 침투를 위한 중앙 세포기관이다1,2. 대부분의 신경 세포는 오랫동안 PC를 품고 있는 것으로 나타났지만, 중추 신경계를 형성하는 이 세포기관의 기여는 오랫동안 저평가되어 왔습니다. 신구체 발달에 대한 연구는 여러 신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)의 발견으로 이어졌으며, 모두 PC를 수용하고 있으며, 그 위치는 선조 운명 결정에 매우 중요하다고 제안되었습니다3,4,5,6,7. PC는 NSPC 확장 및 약정 8,9,10,11,12뿐만 아니라 신경 마이그레이션을 지원하는 방사형 신경교질 비계의 apicobasal 극성을 포함하여 정상적인 뇌 피질 개발에 필요한 세포 메커니즘에 중요한 것으로 나타났습니다13. 또한, PC는 피질 판14,15로의 접선 간 이동 중에 요구된다. 마지막으로, 대뇌 피질16,17에 있는 뉴런의 시냅스 연결의 확립에서 PC에 대한 역할이 제안되었습니다. 전부, 이 사실 인정은 대뇌 피질 발달의 중요한 단계에서 PC의 중요한 역할을 주장하고 뇌성 피질 발달의 근본적인 병리학 기계장치에 그들의 관여를 조사할 필요를 제기합니다.

최근 연구는 인간 모델과 동물 모델의 피질 발달 사이의 중요한 세포 및 분자 차이에 대한 이해를 크게 향상시켜 인간 모델 시스템을 개발할 필요성을 강조했습니다. 이 보기에서, 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSCs)는 관련 유전 및 세포 맥락에서 질병 병발생을 연구하는 유망한 접근을 나타냅니다. 부착 된 2 차원 (2D) 세포 기반 모델 또는 신경 로제트는 개발 대뇌 피질에서 볼 수있는 것과 유사한 NSPC를 포함, 이는 올바른 apicobasal 극성을 보여주는 로제트 모양의 구조로 조직된다20,21,22. 더욱이, 3차원(3D) 배양 시스템은 인간 뇌피질 발달의 많은 특징을 재구성하는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다23,24,25,26. 이 두 가지 보완적인 세포 기반 모델링 접근법은 대뇌 피질의 정상 및 병리학 적 발달 중에 PC의 참여를 해부하는 흥미로운 관점을 제공합니다.

여기에서는 신경 로제트및 파생 된 NSPC뿐만 아니라 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성 및 특성화를위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 소닉 고슴도치 통로의 전도를 테스트하고 이 경로에 관련된 중요한 분자의 역학을 분석하여 NSPC에 존재하는 PC의 생체 발생 및 기능을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 대뇌 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해, 우리는 또한 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 빠른 취득을 허용하는 토토 면역 스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 설정, 고해상도와 전장기의 뉴런의 모든 유형에 PC를 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 150μm 자유부동 구간에 면역조직화학을 적용하여 공진스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 후속 개간 및 획득을 통해 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 분석에 필요한 고해상도 이미지 수집을 가능하게 했습니다. 구체적으로, 3D 이미징 소프트웨어는 PC의 길이, 수 및 방향을 포함한 형태학적 매개변수의 후속 분석과 함께 PC의 3D 재구성뿐만 아니라 축사메를 따라 섬모 구성 요소의 신호 강도 측정을 할 수 있습니다.

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Protocol

1. 신피성 발달의 2D hIPS 세포 기반 모델의 생성

  1. 신경 로제트 형성
    1. 큰 일반 식민지를 품고 있는 hIPSC 문화로 시작하여 10% 미만의 차별화와 80% 이상의 인플루엔자를 전시합니다.
    2. PBS2mL로 hIPSC를 헹구세요.
    3. 바위 억제제 (NIM + Y-27632의 10 μM)로 보충 된 NSPC 유도 매체2 mL을 추가합니다.
    4. 바늘을 사용하여 각 hIPSC 콜로니를 35mm 접시에서 수동으로 해부하여 각 식민지를 수평 및 수직 방향으로 정확하게 절단하여 각 식민지를 동일한 클러스터로 나누는 체커 보드 패턴을 만듭니다.
    5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 식민지를 분리하고 초저 부착 35mm 접시에 옮겨 넣습니다.
    6. 배아 체(EBs)를 형성할 수 있도록 37°C 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 떠있게 하십시오.
      참고: 배아 체(EB)는 부동 스페로이드 클러스터 또는 hIPSC의 집합체로 정의됩니다.
    7. 2mL NIM + Y-27632의 10 μM에서 폴리 L-ornithine/laminin(PO/laminin)으로 EB를 전송합니다.
    8. 매일 침고 NSPC 유도 매체 (Y-27632없이 NIM) 약 12 ~ 14 일이 걸리는 신경 로제트의 형성까지. 현미경으로 확인하십시오.
      참고: 이 단계 후에 신경 로제트는 분리된 신경 줄기 및 전구 세포 (NSPC)를 얻기 위하여 면역 염색 분석 또는 해리를 위해 확장, 분화 및 처리될 수 있습니다.
  2. 신경 장미 팽창 및 조기 분화
    1. 바늘로 격자 모양의 패턴으로 신경 로제트를 자르고 세포 스크레이퍼를 사용하여 클러스터를 제거합니다.
    2. 로제트를 NSPC 유지 보수 매체(NMM)의 0.5mL에서 PO/lam 코팅 유리 커버슬립(4-5 로제트/웰)을 포함하는 4웰 플레이트로 옮겨 넣습니다.
    3. 37°C 및 5% CO2에서 가습 된 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
    4. 20일까지 매일 NMM을 새로 고칩니다.
    5. 20일부터 0.5mL의 사이토카인의 배양 신경 로제트는 NMM을 고갈하여 분화를 허용했습니다. 매 2-3 일 마다 매체를 새로 고칩니다.
    6. 30일차와 40일(분화 10일 또는 20일)에 0.5mL의 PFA, 20분, RT로 로제트를 수정합니다.
  3. 고립된 NSPC에 대한 PC 생체 발생 및 기능 분석
    1. NSPC 해리
      1. 바늘을 가진 격자 모양의 패턴에서 1.1.8 단계에서 신경 로젯을 자르고 세포 스크레이퍼를 사용하여 클러스터를 제거합니다. 세포를 NMM 2mL로 PO/lam 코팅 35mm 요리로 옮기고 37°C 및 5% CO2에서 가습된 인큐베이터에서 인큐베이션을 합니다.
      2. NMM을 수렴할 때까지 격일로 새로 고칩니다(약 5-7일).
      3. 신경 장미를 둘러싼 크고 맑은 세포를 긁어 낸 후 수동으로 선택하고 NSPC를 풍부하게하고 비 신경 세포 유형을 고갈시키기 위해 신선한 PO / lam 코팅 35mm 접시에 옮겨 넣습니다.
      4. 모든 오염 세포 유형을 제거하는 데 필요한 하나 또는 두 개의 수동 통로(필요한 경우 반복 단계 1.3.1.3)를 한 후, 중간을 제거하고 PBS로 헹구는 다.
      5. 대부분의 세포가 분리될 때까지 300 μL00%의 트립신을 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      6. 트립신을 비활성화하려면 10% FBS(DMEM + 10% FBS)를 포함하는 매체2mL을 추가합니다. 15 mL 원상 관에서 셀 서스펜션을 수집합니다. 셀 서스펜션을 세 번 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포 덩어리를 분해합니다.
      7. 300 x g 의 원심분리기는 5분 동안.
      8. 조심스럽게 슈퍼 내를 흡인하고 NMN에서 세포를 다시 중단합니다.
      9. NMM에서 단일 세포(1 x 105 셀/cm2)로 해리된 NSPC를 PO/lam 코팅 된 접시에 시드하고 37 °C 및 5 % CO2에서 가습 된 인큐베이터에서 배양하십시오.
      10. 매일 매체를 변경하여 NMM에서 NSPC를 확장합니다.
        참고: NSPC는 차별화를 피하기 위해 고밀도로 시드됩니다.
    2. PC 생물발생 분석
      1. 종자 100,000 세포 /cm2 에서 NSPC를 해리하고 2 일 동안 NMM에서 37 °C 및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 배양합니다.
      2. 48h에 대한 세포카인 고갈 매체(NSPC 기아 매체, 보충표 1)에서 배지및 굶주린 NSPC를 흡인한다.
      3. RT에서 20분 동안 4%의 PFA로 NSPC를 수정합니다.
      4. 면역 염색 하기 전에 RT에서 5 분 동안 PBS와 함께 두 번 세척.
    3. PC 기능 분석: SHH 시그널링 경로
      1. 종자 해리 NSPC는 PO/lam 코팅 된 8 웰 챔버 슬라이드 (300 μL) 또는 T25 접시 (5 mL)에 100,000 세포 / cm2 에서 CPC를 분리하고 2 일 동안 NMM에서 37 ° C및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 배양합니다.
      2. NSPC 기아 매체(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 300 μL, T25 플라스크5mL)에서 48h에 굶주린 NSPC.
      3. SHH 통로를 유도하기 위하여는, 재조합 SHH (100 ng/mL) 또는 SAG (500 nM)로 보충된 기아 매체로 NSPC를 배양합니다; (8웰 챔버 슬라이드의 웰당 150 μL, T25 플라스크2mL).
      4. 8웰 챔버 슬라이드에서 250 μL의 250 μL에서 RT에서 20분 동안 250μL로 배양된 NSPC를 수정하고 면역 염색 분석 전에 RT에서 5분 동안 250 μL의 PBS로 두 번 세척합니다.
      5. PBS로 T25 접시에서 배양된 중간 식NSPC를 제거하고 세척합니다.
      6. 세포가 분리될 때까지 500 μL의 0.05% 트립신을 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      7. 트립신을 비활성화하고 15 mL 원추형 튜브에서 세포 현탁액을 수집하기 위해 10 % FBS (DMEM + 10 % FBS)를 포함하는 배지 2 mL을 추가합니다.
      8. 원심분리기는 300 x g 에서 5분 동안 조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인하여 RNA 추출 및 RT-PCR 분석 전에 -80°C에서 냉동보존될 수 있는 NSPC 펠릿을 획득한다.

2. 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성

  1. hIPSC의 단세포 배양
    1. 10% 미만의 차별화를 나타내는 대규모 일반 식민지를 수용하는 hIPSC 문화로 시작하여 거의 한 번 통과되었습니다. 세포가 80% 이하의 컨할 수 없는지 확인합니다.
    2. PBS의 2mL로 식민지를 씻으시다.
    3. 젠틀 셀 해리 시약 (GCDR)의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 5 ~ 7 분 동안 배양하십시오.
    4. GCDR을 흡인하고 Y-27632의 5 μM으로 보충된 mTeRS1 배지 2mL를 추가합니다.
    5. 파이펫 세포를 부드럽게 위아래로 10 번 하여 모든 식민지를 단일 세포로 해리시합니다.
    6. 비트론틴 코팅 접시에 세포를 옮기고 37°C 및 5% CO2에서 가습된 인큐베이터에서 배양한다.
      참고: hIPSC를 단일 세포 배양 조건에 적응하기 위해 분화 실험 전에 GCDR을 사용하여 hIPSC의 적어도 1개의 통과를 수행한다.
  2. 0일째에, hIPSC는 hIPSC 생존을 위해 요구되는 FGF2의 낮은 농도 및 고농도암 억제제를 포함하는 EB 매체에서 배아 체를 형성하는 것을 허용합니다. 이렇게하려면 아래 단계를 따르십시오.
    1. PBS의 2mL로 식민지를 씻으시다.
    2. 젠틀 셀 해리 시약 (GCDR)의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 5 ~ 7 분 동안 배양하십시오.
    3. GCDR을 흡인하고 Y-27632의 50 μM로 보충된 EB 배지 1mL을 추가합니다. 1mL 파이펫을 사용하여 세포를 부드럽게 분리하고 15mL 원추형 튜브로 옮겨넣습니다.
    4. Y-27632의 50 μM으로 보충된 EB 배지 2mL로 다시 한 번 헹구고, 나머지 세포를 15mL 원추형 튜브로 이송한다. 즉시 원추형 튜브에 Y-27632의 50 μM로 보충 된 EB 매체 3mL을 추가하고 부드럽게 5mL 파이펫을 사용하여 용액을 균질화합니다.
    5. 5 분 동안 100 x g 에서 해리 된 세포를 원심 분리합니다.
    6. 슈퍼나탄을 부드럽게 흡인시키고 Y-27632의 50 μM으로 보충된 EB 배지의 6mL에서 세포를 재연한다.
    7. 세포를 100 x g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    8. 슈퍼나탄을 흡인시키고 Y-27632의 50 μM으로 보충된 EB 배지의 1mL에서 세포를 재연한다. 1mL 파이펫을 사용하여 세포를 단일 셀 서스펜션으로 부드럽게 해리시합니다.
    9. 세포를 다시 중단한 직후 희석하고 계산합니다.
    10. 적절한 양의 세포 현탁액(900,000세포 함유)을 Y-27632의 50 μM 및 bFGF의 4 ng/mL로 보충한 EB 배지30mL로 희석하고 용액을 부드럽게 혼합합니다.
    11. 9,000개의 셀/웰을 초저 부착 96U 플레이트(300 μL/well)로 플레이트합니다. EB 형성을 방해하지 않으려면 중간 변화 없이 3일까지 37°C및 5% CO2 에서 가습된 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
  3. 신경 유도 (듀얼 SMAD 억제)
    1. 3일째에, EB가 300-400 μm을 측정하고 일반 테두리를 표시하도록 보장합니다. 두 기준모두에 도달하면, 배지의 절반을 이중 SMAD 억제제를 함유하는 유도 매체-1로 교체하여 6일째부터 7일까지 EB의 윤곽을 밝게 하여 신경 절제술 분화를 나타낸다(보충표 2).
    2. 4일째에, 배지(225 μL)의 3/4를 유도 중간-1로 바꿉니다.
    3. 6일째와 8일째: 유도 중간-1(150 μL)의 절반을 새로 고칩니다.
  4. 지하 막 매트릭스에 내장 된 오르간 (10 일)
    1. 10일째에, 성장인자에 EB를 포함하여 지하 막 매트릭스(BMM)를 감소시킵니다.
      참고: 이 단계에서는 항상 멸균 가위를 사용하여 파이펫 팁의 개구부를 잘라 서 반복된 파이펫팅으로 오르가노이드가 손상되지 않도록 하십시오.
    2. 원물 튜브에서 15-17 개의 오르가노이드를 처음 옮기십시오. EB가 정착하여 매체를 제거하도록 합니다. 유도 중간-2의 50 μL을 추가하고 BMM의 100 μL을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다.
    3. 매트릭스-EB 혼합물을 초저 부착 플레이트의 우물 중앙에 펴고 EB를 분리하여 융합을 방지합니다.
    4. BMM이 인큐베이터에서 37°C에서 45분 동안 고성화하게 하십시오.
    5. 각 우물에 유도 매체-2의 3mL을 추가하고 37 °C 및 5 % CO2에서 가습 된 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
      참고: BMM이 실온에서 고형화될 때 이 절차가 가능한 한 빨리 수행되는지 확인합니다.
  5. 지하 막 매트릭스에 내장 된 오르가노이드의 고정 문화
    1. 12일, 14일: 상쾌 유도 중간-2.
    2. 16일: 유도 중간-2를 새로 고치고 현미경으로 신경상피성 루프의 확장을 확인하십시오.
  6. 궤도 셰이커의 지하 멤브레인 매트릭스 해리 및 문화
    1. 17일, BMM의 오르가노이드를 5mL 파이펫으로 10회 위아래로 피펫으로 분리하여 비타민 A 없이 차별화 매체-1로 옮기습니다. 영양 흡수를 향상시키기 위해 37°C및 5% CO2 의 가습 된 인큐베이터에서 80 rpm의 궤도 셰이커에 배양하십시오.
      참고: 고정된 배양및 배양에 대해 다른 인큐베이터를 사용하여 궤도 셰이커에 부착된 hIPS 세포 성장에 해로운 진동을 방지합니다.
    2. 19일: 비리 차별화 중간-1을 새로 고칩니다.
    3. 21일: 분화 중간-1을 분화 중간-2(비타민 A)로 변경합니다.
    4. 23일부터 35일까지: 2~3일마다 차별화 매체-2로 배지를 새로 고칩니다.
    5. 35일부터 70일까지: 1%의 BMM로 차별화 중간-2를 새로 고치고 2-3일마다 새로 고칩니다.
    6. 28, 42 및 70 +/- 2일 분화 후 오르가노이드를 수집하고 15mL 원문 튜브에 5mL 4% PFA로 4°C에서 하룻밤을 고정합니다.
    7. 토토 또는 자유 부동 면역 스테인닝 분석에서 추가로 오르가노이드는 PBS에서 두 번 헹구고 PBS + 0.05 % 나트륨 아지드에서 4 °C에서 보존됩니다.
    8. 냉동 된 섹션에 면역 염색 분석을 위해, 몰입 4% PFA 고정 오르가노이드 에 10 mL 30% 자당 +4°C ON (또는 오르가노이드 가면까지). 냉동 포함 매트릭스에 포함하 고 동결 될 때까지 -80°C에 저장합니다.

3. 토토 면역 라벨링, 클리어링 및 등쪽 전뇌 오르가노이드의 광시트 획득

  1. 고정
    1. 6웰 플레이트에서 오르가노이드를 수집하고, 배지를 제거하고, 4°C에서 4%의 PFA2mL로 하룻밤 사이에 고정한다.
    2. 실온에서 PBS의 2mL에서 세 개의 세척을 수행합니다.
    3. 오가노이드를 2mL 튜브로 옮기고 PBS + 0.05% 나트륨 아지드의 2mL에 4°C로 저장합니다.
  2. 투과성
    1. 1 h에 대 한 RT에서 0.2% 트리톤 X100을 포함 하는 PBS의 1 mL에서 유기인을 배양. 두 번 이 작업을 수행합니다.
    2. PBS의 1mL에서 0.2% 트리톤 X100 및 20% DMSO를 함유하고 있으며, 37°C에서 하룻밤 사이에 배양한다.
    3. PBS의 1mL에서 0.1% Tween20, 0.1% 트리톤 X100, 0.1% 데옥시콜린, 0.1% NP40 및 20% DMSO를 함유한 PBS의 1mL에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다.
    4. 1mL의 PBS에서 0.2% 트리톤-X100을 함유하고 있으며, RT에서 1h. 두 번 이 작업을 수행합니다.
  3. 차단 및 면역 라벨링
    1. 블로킹 용액 1mL(PBS, 0.2% 트리톤 X100, 6% 당나귀 세럼, 10% DMSO)에서 37°C, ON에서 차단한다.
    2. PBS의 250 μL, 0.2% Tween20, Heparin의 0.1 μg/mL, 5% DMSO 및 3% 당나귀 세럼, 37°C에서 2일간 희석된 1차 항체를 배양한다.
    3. 헤파린의 0.2% Tween20 및 0.1 μg/mL을 함유한 PBS의 1mL에서 1시간 동안 37°C로 세척한다. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    4. 1mL의 PBS로 세척하여 0.2% Tween20 및 0.1 μg/mL의 헤파린을 함유하고 있으며, 하룻밤 사이에 37°C에서 세척한다.
    5. PBS의 250 μL에서 희석된 이차 항체를 함유한 배양은 2일 동안 37°C에서 0.2% 트웬 20, 0.1 μg/mL, 3% 당나귀 혈청을 함유한다.
    6. HEparin의 0.2% Tween 20 및 0.1 μg/mL을 포함하는 PBS의 1mL에서 1 시간 동안, 휠에, RT에서 세척하십시오. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    7. PBS의 1mL에서 0.2% Tween 20 및 0.1 μg/mL의 헤파린을 밤새 바퀴에, RT에서 세척하십시오.
    8. PBS의 1mL에서 24 시간 동안 RT에서 세척하십시오.
    9. PBS 1mL에 +4°C, 청산전까지 0.05% 아지드 나트륨으로 재고하십시오.
  4. TDE에서 클리어링 (2,2′ -티오디에탄올)
    1. RT에서 24h에 대해 30% TDE(TDE 3mL + PBS 7mL)의 1mL에서 오르가노이드를 배양합니다.
    2. 60% TDE의 1mL (TDE의 6mL + PBS4 mL)에서 24 시간, RT에서 인큐베이션하십시오.
    3. RT에서 24h에 대해 80 % TDE (TDE 8 mL + PBS 2 mL)의 1 mL에서 배양하십시오.
  5. 라이트 시트 획득 전에 오가노이드 포함
    참고: 맞춤 제작 시스템을 사용합니다. 메스로 잘라 팁1 mL 주사기로 만든.
    1. 2mL 튜브에 60% TDE 용액과 알리쿼트로 4% 저융 아가로즈 100mL를 준비합니다. +4°C에서 보존하십시오.
    2. 오르가노이드 포함이전에는 1.5mL의 4%의 저용아가로즈를 함유한 튜브 1개를 37°C의 수조에서 60%TDE로 예열하여 액화할 때까지 예열한다.
    3. 한편, 1mL 주사기로 만든 맞춤형 성형 시스템을 준비하여 메스를 사용하여 잘라냅니다.
    4. 플런저를 사용하여 젤 용액의 주사기 600 μL에 펌프.
    5. 비늘 가위를 사용하여 절단 된 개구부를 확대 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 배치합니다.
    6. 시료가 주사기의 낮은 3분의 1 내에 위치되도록 젤 용액의 400 μL로 주사기를 채웁니다.
    7. 겔을 폴리머로 하여 4°C에서 80% TDE 용액을 획득할 때까지 빛으로부터 보호합니다.
    8. 라이트 시트 획득의 경우 샘플 챔버에 추가된 80% TDE 솔루션에 침지된 20배 목표를 사용하여 클리어링 방법의 굴절률에 정확하게 적응할 수 있습니다.
    9. 1mL 주사기를 수용할 수 있도록 설계된 가장 큰 샘플 홀더에 아가로즈 임베디드 오르가노이드를 함유한 주사기를 삽입하여 목표 앞에 오르가노이드를 배치하도록 조작할 수 있다.
      참고: 전체 오르가노이드의 라이트 시트 획득에는 약 5~10분이 소요됩니다.

4. 등쪽 전뇌 오르가노이드의 자유 부동 부분의 면역 염색 및 제거

  1. 고정, 아가로즈 포함, 및 오르가노이드의 절편
    1. 28, 42 및 70 +/- 2일 후에 오가노이드를 6웰 플레이트에서 수집하고 4% PFA의 2mL에서 4°C에서 하룻밤을 고정합니다.
    2. PBS 2mL에서 두 번 헹구고 PBS + 0.05 % 나트륨 아지드의 2 mL에서 4 °C에서 보존하십시오.
    3. 고정 된 오르가노이드를 플라스틱 포함 금형 (7 x 7mm)에 4 % 저용 아가로즈에 포함시십시오. 조심스럽게 플라스틱 금형에서 아가로즈 블록을 제거하고 진동 단계에 접착제.
    4. 부속은 진동을 사용하여 임베디드 오르가노이드를 사용하여 섹션에 손상을 입히는 것을 방지하기 위해 페인트 브러시를 사용하여 PBS의 500 μL을 포함하는 24 웰 플레이트의 우물에서 전송된 150 μm 자유 부동 섹션을 얻습니다.
      참고: 녹는 온도는 약 60°C에 불과하기 때문에 저융 아가로즈가 권장됩니다. PBS 용액에 4% 저용해액을 준비하고 오르가노이드 를 내장하기 전에 수조에서 37°C 바로 위에 식힙니다.
  2. 투과, 차단 및 면역 염색
    1. 0.3% 트리톤 X100을 포함하는 PBS의 500 μL에서 섹션을 교반 하에 20분 동안 배양합니다. 세 번 이 작업을 수행합니다.
    2. 0.3% 트리톤 X100 및 5% 비지방 우유를 포함하는 PBS의 500 μL에서 섹션을 2 시간 동안 교반 하에 RT에서 배양합니다.
    3. 1 차 적인 항체 용액의 250 μL (PBS + 0.3 % 트리톤 X100 + 1 % 비지방 우유)의 섹션을 교반 하에 + 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    4. PBS의 500 μL에서 섹션을 세척, RT에서, 교반에서, 20 분 동안. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    5. 이차 항체 용액의 250 μL (PBS + 0.3 % 트리톤 X100 + 1 % 무지방 우유)의 섹션을 2 시간 동안 RT에서 배양합니다.
    6. PBS의 500 μL에서 섹션을 세척, RT에서, 교반에서, 20 분 동안. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    7. 섹션은 PBS의 500 μL에 섹션을 저장, 에서 +4° C 는 지울 때까지.
  3. TDE에서 클리어링 (2,2′ -티오디에탄올)
    1. 500 μL의 30% 및 60% TDE로 섹션을 RT에서 각각 1h에 대해 배양한 다음 RT에서 하룻밤 사이에 80% TDE의 500 μL에서 배양합니다.
    2. +4°C에서 획득할 때까지 500μL의 80% TDE로 정리된 섹션을 저장합니다.
  4. 공명 스캐닝 공초점으로 인수하기 전에 자유 부동 섹션 장착
    1. 밀봉된 챔버에 자유 부동 섹션을 장착하여 80% TDE 용액으로 샘플을 유지하고 공초점 현미경의 전동 XY 단계에 적응하도록 설계되었습니다.
    2. 챔버 시스템에 둥근 커버슬립 1개를 넣습니다.
    3. 페인트 브러시를 사용하여 지워진 면역 스테인드 섹션을 조심스럽게 전달합니다.
    4. 챔버를 80% TDE 용액으로 채웁니다.
    5. 2개의 표준 커버립과 1초 라운드 커버슬립, 실리콘 씰을 추가합니다.
    6. 완벽하게 시스템을 밀봉 챔버의 나사 링에 나사.

5. 라이트 시트 및 공명 스캐닝 공초점 분석

  1. 전체 면역스테인드 샘플의 3D 시각화 및 분석을 가능하게 하는 소프트웨어를 사용하여 라이트 시트 및 공진 스캐닝 수집을 처리합니다.
    참고: 이러한 소프트웨어를 사용하면 거대한 데이터를 빠르게 열어 스냅샷과 애니메이션을 쉽게 만들 수 있습니다. 예를 들어 다양한 방향, XY 및 YZ의 2D 슬라이서 도구 덕분에 샘플을 서로 다른 방향으로 이동하고 2D 뷰를 생성할 수 있습니다.
  2. 중추 및 기본 섬모를 자동으로 감지하려면 스팟 마법사를 사용하여 병리학적 대 제어 조건에서 해당 수를 정량화할 수 있습니다.
  3. PC의 3D 재구성을 통해 길이를 정밀하게 측정할 수 있도록 필라멘트 마법사를 사용하여 PC의 시작점을 수동으로 수정하고 소프트웨어는 형광 신호를 사용하여 PC를 정밀하게 재구성합니다.

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Representative Results

2D hIPS 세포 기반 모델은 1 차 적인 실륨 생물 발생 및 기능을 연구합니다
여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 발표된 연구에서 20,21,22로 조정되었습니다. 이 프로토콜은 개발 신피질에서 보인 것과 유사한 신피성 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 특정 제조자를 이용한 종래의 면역염색 분석에 의해 수행될 수 있다3. 예를 들어, apical 전구체(AP)는 SOX2 및 PAX6로 이중 염색되어야 하며, 중간 전구(IP)는 TBR2/EOMES 염색에 의해 드러나며, 초기 태어난 신코르티컬 뉴런은 CTIP2 염색(그림 1A-C)에 의해 드러난다. 이러한 신경 로제트 와 같은 구조는 미토틱 핵과 TPX2를 얼룩지게 하는 인-바이멘틴에 대하여 제기된 항체와 면역스테인링하여 시각화될 수 있는 AP의 간 키네틱 핵 이동(INM)을 모델링합니다. 따라서 이러한 마커는 세포 분단을 가진 INM을 포함한 AP의 여러 특성을 분석하여 중앙 루멘(도 1D,D')을 중심으로 정량적으로 수행될 뿐만 아니라 분할 평면과 정액 표면 사이의 각도를 측정하여 결정된 분할 모드를 허용한다. 마지막으로, ciliogenesis는 PC의 기저 체에 얼룩진 PCNT에 대하여 제기된 항체로 면역염색에 의해 분석될 수 있고, aRL13B는 axoneme를 얼룩지게 합니다. 이러한 로제트 구조에서 PC는 각 심실과 같은 영역의 중앙 루멘(그림 1E, E')의 중앙 루멘으로 APP의 정압 극에서 확장되며 CTIP2+ 뉴런(그림 1E')에서 돌출됩니다.

이러한 로제트 구조물의 해리는 NMM의 폴리 L-ornithine/라미닌 코팅 배양 판에서 배양된 격리된 NSPC를 고밀도로 획득하여 karyotype 이상을 축적하지 않고 최소 15개의 통로에 대해 안정적이고 확장 가능한 NSPC 집단을 유지하도록 허용합니다21,27. PC 생물 발생을 분석하기 위해 해리된 NSPC는 48시간 동안 인플루언서에 배양되고 굶주림을 가합니다. PC 마커에 대해 제기된 항체를 이용한 면역염색 분석은 그 NSPC가 PC를 항구한다는 것을 보여준다(도 2A). PC 세분화에 유용한 머신 러닝 기반 이미지 분석 도구인 Ilastik과 피지/ImageJ 플러그인 패키지29인 Ilastik을 결합하여 3D 공초점 이미지 스택에서 PC를 3D 재구성할 수 있으며, PC 수와 길이를 포함한 여러 구조적 파라미터를 쉽게 평가할 수 있습니다.

또한 고슴도치 신호 경로의 트랜스퍼링을 테스트하여 NSPC의 PC 기능을 평가할 수 있다. SHH 신호 경로의 트랜스포팅을 평가하기 위해 NSPC는 48시간 동안 굶어 24시간 동안 재조합 SHH(rSHH) 또는 부드러운 작용제(SAG)로 처리된다. GPR161, SMO 및 GLI2에 대해 제기된 항체를 사용하여 면역형광(IF) 분석을 통해 이러한 주요 SHH 신호액의 인신매매를 PC를 따라 테스트할 수 있으며, GPR161은 일반적으로 PC를 종료하는 반면 GLI2 및 SMO는 SHH 경로 활성화에 대응하여 PC 내에서 축적됩니다(그림 2C-D). CiliaQ 도구를 사용하여 3D 공초점 이미지 스택을 분석하면 SHH 경로 활성화 후 PC 내에서 GPR161 출구와 GLI2 및 SMO 축적을 정량화할 수 있습니다(그림 2F-G). 또한, rSHH-또는 SAG 처리 된 NSPC로부터 추출 된 mRNA에 대한 반정량 RT-PCR 분석은 대조군 hIPSC (도 2B)에서 파생 된 NSPC에서 정상적인 SHH 신호 변환을 테스트하는 두 가지 SHH 표적 유전자, GLI1 및 PTCH1의 유도를 나타낸다.

전반적으로, dorsal 전뇌를 개발하는 2D 세포 기지를 둔 모형은 명확하게 일반적인 뇌피질 발달의 몇몇 양상을 재현하고 뇌성 피질의 인간 발달 이상에 책임 있는 유전자에 있는 환자 hIPSCs를 항구하는 환자 hIPSCs를 사용하여 신코티컬 발달의 근본적인 이상을 해부하는 PC 관련 기계장치를 해부하는 유망한 공구를 나타냅니다.

신코르피컬 개발 중 1차 실슘 개입을 연구하는 3D hIPS 세포 기반 모델
여기에 설명된 프로토콜(그림 3A)은 이전에 게시된 프로토콜23,24,25,26,30에서 적용되었으며 5개의 고유한 제어 hIPSC 라인에서 성공적으로 테스트되었습니다. 그것은 큰 신경 상피 루프를 형성하는 동안 시간이 지남에 따라 크기가 증가하는 hIPSC 파생 등쪽 전경 오르노이드의 생성을 허용 (그림 3B). 오르가노이드 저온분면(극저온, 20 μm), 자유 부동 구간(진동, 150 μm) 또는 토토에서 의면표지 분석은 품질 관리를 위해 수행될 수 있다. 28일 ± 2일, 오르가노이드는 신경 전구 마커 SOX2와 등쪽 전뇌 마커 PAX6를 공동 발현하는 계층화된 신경상피성 루프로 구성되어 등쪽 전뇌 정체성을 증명한다. 42일 ± 2(6주 분 분)에 이러한 루프는 보다 복잡한 계층화된 조직을 표시해야 합니다. 이러한 루프 구조의 기저 표면까지, SOX2/PAX6 양성 편심 신경교선 전구(aRG)를 가진 심실 영역(VZ)과 같은 영역은 서브뿐만 아니라 묘사될 수 있습니다. TBR2 양성 중간 전구(IP) 및 CTIP2 양성 초기 출생 신코르티컬 뉴런을 포함하는 피질 플레이트(CP)와 같은 영역을 가진 심실 영역(SVZ)과 같은 영역(그림 3C, 그림 3C, E). aRG의 정황 분자 극성은 ZO-1 및 N-CADH의 심실 표면에서 정액 농축에 의해 평가될 수 있다(도 4A, 비디오 1). aRG 전구 분단 특성은 TP2X 및 P-VIM 마커를 사용하여 일반적으로 피질 루프의 심실 표면에서 aRG 미토틱 핵의 정렬로 이어지는 INM을 분석할 수 있다(도 4B, 비디오 2). 이러한 면역 라벨링은 또한 분열 각도를 측정하여 aRG의 비대칭 분할 모드와 대칭을 평가할 수 있습니다. P-Vim 양성 선조는 또한 SVZ와 같은 지역에서 관찰될 수 있으며, 외부 방사형 glia(oRG 또는 기저 방사형 glia, 도 4C, 비디오 2)를 연상시키는 기저 표면으로 확장되는 독특한 기저 과정을 수용할 수 있다. 그들은 일에서 결석 하는 동안 42 오르가노이드, SATB2 긍정적인 늦은 태어난 뉴런 일 에서 검출 해야 70 (10 분 분화의 주) (그림 3D, F), 신 피 세포 분화의 생체 같은 타이밍에 대 한 증명.

기초 체체(감마 튜불린)와 액소네메(ARL13B) 마커를 이용한 면역 라벨링 실험은 20μm 극저온 섹션에서 PC를 시각화할 수 있게 한다(도 3G, H). 등쪽 전뇌 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해 전체 마운트 면역 염색을 수행할 수 있습니다. 토토 면역스테인드 및 클리어드 오르가노이드에서 이러한 광시트 를 획득하면 모든 NSPC 유형뿐만 아니라 신피성 뉴런(Video 3)에서 중척추술과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 또한, PC 생발생의 보다 정확한 분석을 수행하기 위해, 등대 뇌 오르가노이드의 자유 부동 두꺼운 섹션(150 μm)에 대한 면역조직화학 분석을 수행할 수 있다. 개간 후, 이러한 섹션은 40x(NA 1.3) 또는 63x(NA 1.4) 오일 목표를 사용하여 공진백색광 공초점 레이저 현미경의 유전적 목적을 사용하여 획득하여 오르가노이드의 3D 공간 정보를 보존하면서 해상도를 향상시킬 수 있다. 이러한 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 간섭없이 정확하고 유연한 흥분및 감지와 함께 두꺼운 섹션을 신속하게 수집 할 수 있습니다 (비디오 4). PC의 여러 구조적 파라미터는 3D 이미징 소프트웨어를 사용하여 PC 번호, 길이 및 방향을 포함하여 평가될 수 있습니다. 피지/ImageJ29의 CiliaQ 플러그인 패키지뿐만 아니라 기계 학습 기반 이미지 분석 도구인 Ilastik28과 같은 전용 오픈 소스, 자유롭게 사용할 수 있는 도구는 자동 PC 세분화에 매우 유용하여 PC 생물 발생및 병리학 적 조건 대비 제어 기능을 제공합니다.

Figure 1
그림 1: 2D 신경 로제트의 생성 및 특성화. AP를 검출하기 위해 (A) SOX2 및 PAX6 항체를 이용한 신경 로제트 구조의 면역히토화학적 특성화, (B) TBR2/EOMES가 IP를 밝히고, (C) CTIP2는 초기 태어난 신피성 뉴런을 염색한다. 증식 AP는 인-바이멘틴 및 TPX2 항체로 검출되며 정표면(D,D')에 위치한다. PC는 PCNT 및 ARL13B 항체를 가진 이중 면역 염색에 의해 드러난다. PC는 각 AP에서 각 로제트의 중앙 루멘으로 확장되며 IP 및 조기 태어난 뉴런(E,E',E'')에서도 감지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 2D 신경 로제트에서 파생된 격리된 NSPC는 기능성 PC를 항구합니다. 2D 신경 로제트의 해리는 ARL13B 및 PCNT 면역 스테인닝 (A)에 의해 드러난 바와 같이 48 시간 동안 기아 후 PC를 항구 절연 NSPC를 발생시다. NSPC는 48h에 대한 기아 후 2개의 SHH 표적 유전자 GLI1 및 PTCH1 의 RT-PCR 정량화에 의해 밝혀진 기능성 PC를 24시간 GLI1 및 PTCH1 발현 데이터를 트리클리케이트로 수행하고 ACTB 발현 데이터로 정규화하였다. 데이터는 2-ΔΔCt 방법으로 분석되었고 SEM(Mann Whitney test)± 상대식으로 제시하였다. SHH 통로 활성화 후 PC를 축적하거나 종료하는 SHH 신호 경로, GLI2 및 GPR161의 두 가지 중요한 행위자의 역학을 테스트하기 위해 (D) 또는 (C) rSHH 처리없이 굶주린 NSPC에 대한 IF 분석. 공초점 이미지 분석을 위한 Ilastik 및 CiliaQ 도구를 결합하여 PC 내의 GPR161(F) 및 GLI2(G) 신호 강도는 +/-rSHH 처리 NSPC에서 비교되었으며, ARL13B 염색은 PC 세분화에 사용되었으며, 예상 PC 길이는 +/-rSHH 처리 NSPCs(E)에서 변경되지 않았다. 데이터는 상자 및 수염 플롯(평균 값 ± SEM)으로 요약됩니다. p < 0.0001 (만 휘트니 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성 및 특성화. (A) 등색 전뇌 오르가노이드를 생성하는 프로토콜의 회로도 개요. (B) 분화의 일 1, 3, 7, 24 및 42에서 오르가노이드의 대표적인 밝은 필드 이미지. SOX2와 면역 염색 후 42일째(C) 및 70(D)에 20μm 극저섹션의 공초점 영상, TBR2, 및 CTIP2 항체 delineating, 각각, 심실 영역 (VZ), TBR2 양성 IP를 포함하는 심실 영역 (SVZ), 및 CTIP2 양성 초기 태어난 신코르티컬 뉴런을 포함하는 전판형 형 영역 (CP). 70일째에 SATB2 양성 후기 출생 뉴런의 출현을 보여주는 PAX6, CTIP2 및 SATB2 항체와 면역 염색 한 후 42 일째 (E) 및 70 (F)에서 오르가노이드의 20 μm 극저온 섹션의 공초점 이미지. ARL13B와 PCNT 항체로 면역 염색 후 42일째에 오르간노이드의 20 μm 극저섹션의 공초점 이미지는 방사형 신경교선 전구(G)의 정압 극에서 PC를 드러내고 CTIP2 양성 뉴런(H)에도 존재한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 등쪽 전뇌 오르가노이드의 3D 이미징. (A) PAX6로 염색된 전체 등쪽 전뇌 오르간노이드(42일)의 광시트 획득, N-CADH 및 CTIP2 항체는 PAX6 양성 방사형 신경교 선조와 여러 신경 상피 루프를 나타내는 그들의 apical 측에 N-Cadherin의 축적에 의해 드러난 것과 CTIP2 양성 초기 태어난 신코르티컬 뉴런이 전판과 같은 영역을 파고들게 한다. (B) TPX2, P-Vim 및 CTIP2 항체로 염색된 전체 등쪽 전뇌 오르간노이드(Day 42)의 광시트 획득이 심실 방아신경교 선조의 상호 키네틱 핵 이동을 보여주는다. (C) TPX2 및 P-Vim 항체로 염색된 전체 등쪽 전뇌 오르간노이드(42일)의 광시트 획득을 확대하여 독특한 기저 과정을 연장하고 외부 방사형 신경교선 선조를 연상시키는 지하 구역에 국한된다. (D) 공진 스캐너는 NSPC 및 신피성 뉴런에서 PC를 보여주는 PCNT 및 ARL13B 항체로 염색된 등쪽 전경 오르가노이드(Day 42)의 150 μm 구간을 인수한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 뇌피질 이상의 병리생리학에 대한 PC 개입을 해부하기 위해 등쪽 전뇌 발달의 2D 및 3D hIPS 세포 기반 모델의 생성 및 특성화. hIPS 세포는 낮은 접착 배양 판으로 배아 체(EBs)를 형성할 수 있으며, 이어서 신경 절내체 분화를 유도하기 위해 이중 SMAD 억제제를 함유하는 유도 배지로 배양된다. PO/lam 코팅 된 요리에 EB를 접착하면 2D 신경 로제트 구조의 생성을 허용하고 BMM에 후속 포함과 EBs의 자유 부동 문화는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 허용합니다. 신봉신경 로제트 배지에서 미토겐인자의 철수는 IF 분석에 의해 시험될 수 있는 신경 발생의 개시를 촉진합니다. 부착 신경 로제트의 해리는 PC 생체 발생 및 기능 분석에 유용한 절연 NSPC 배양의 생성을 허용합니다. 등쪽 전뇌 오르가노이드는 4, 6, 또는 10주 후에 수집되며, 토토, 150 μm 두께의 섹션 또는 20 μm 저온 절제 에 대한 후속 면역 염색 분석을 위해 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: PAX6, CTIP2 및 NCADH 항체와 면역된 전체 등쪽 전뇌 오르간노이드(Day 42)의 광시트 획득. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2: TPX2, P-VIM 및 CTIP2 항체와 면역된 전체 등쪽 전뇌 오르간노이드(Day 42)의 라이트 시트 획득. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3: PCNT 및 ARL13B 항체로 면역염색된 전체 등쪽 전뇌 오르간노이드(42일)의 라이트 시트 획득. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 4: 공진 주사 공초점 은 ARL13B 및 PCNT 항체로 면역 염색 된 등쪽 전뇌 오르가노이드 (42 일)의 150 μm 섹션의 공조적 획득. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 : 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 2D 신경 로제트 및 NSPC의 생성에 사용되는 미디어의 조리법.

보충 표 2: 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성에 사용되는 미디어의 조리법.

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Discussion

PC는 이제 NSPC 확장 및 약정을 포함하여 정상 뇌 피질 발달 18,19,31 동안 중요한 단계를 조절하는 주요 세포 기관으로 간주됩니다18,9,10,11,12뿐만 아니라 뉴런 마이그레이션13,14 및 시냅토발생16,17 . 동물 모델 이나 인간 태아 뇌 조직에서 분석 뿐만 아니라, 매우 혁신적이 고 관련 된 환자 파생 hIPSC 기반 모델의 생성 은 정상 및 병리학 뇌 피 질 개발 하는 동안 PC의 역할을 해부 하는 데 필수적 이다.

여기에 자세히 설명된 2D hIPSC 기반 모델링 프로토콜은 3개의 주요 간행물20,21,22에서 채택되었습니다. 신경상피성 분화는 활성/노달(SB-431542) 및 BMP(LDN-193189) 경로의 작은 분자 억제제(SB-431542)를 사용하여 이중 SMAD 억제제에 의해 유도된다222. 세포는 분화 20 일 후에 NSPC뿐만 아니라 신피성 심층 뉴런을 포함하는 로제트 모양의 구조로 조직됩니다. 또한, 이러한 로제트와 같은 구조는 올바른 apicobasal 극성, 모든 NSPC 및 뉴런에서 확장하는 PC뿐만 아니라 apical 전조자의 간 동역학 핵 이동을 보여줍니다. 이러한 로제트 구조의 해리 후, 피질 전조자의 균일하고 안정적인 인구가 얻어진다21. 48시간 동안 결합하고 굶주리면, 피질 전구는 피지/ImageJ에 Ilastik28 및 CiliaQ28,29 플러그인 패키지를 결합하여 형태, 숫자 및 길이를 쉽게 분석할 수 있는 PC를 항구합니다. 더욱이, 사이토카인을 사용하여 SHH 시그널링 경로를 유도함으로써, PC 기능은 IF가 GLI2, SMO 및 GPR161과 같은 PC를 따라 중요한 신호 경로 행위자의 역학을 테스트하는 데사용될 수 있다. 또한, 반정성 RT-PCR 분석은 SHH 통로 활성화에 응하여 GLI1 및 PTCH1을 포함한 SHH 표적 유전자 발현의 유도 테스트를 가능하게 한다. PC 기능에 따라 다른 신호 경로 테스트 해야, WNT와 IGF 통로 포함 하 여2,32,33. 정상적인 뇌 피질 개발의 여러 측면을 명확하게 재현하는 이 2D 모델링 접근법을 결론짓기 위해, 그것은 정상적인 대 병리학 적 조건에서 PC 생체 발생 및 기능을 테스트하기위한 유용하고 관련 도구를 나타내며 신피성 발달 중에 PC의 참여에 대한 추가 통찰력을 얻는 데 기여해야합니다.

2D hIPSC 기반 모델링 접근법에 대한 보완적인 등쪽 전뇌 오르가노이드는 초기 발달 인간 대뇌 피질의 많은 특징과 특성을 재구성하면서 체외에서 정상 및 병리학 적 대뇌 발달을 조사 할 수있는 전례없는 기회를 제공합니다. 프로토콜의 두 가지 주요 유형은 현재 사용됩니다: 본질및 유도 방법. 랭커스터와 동료에 의해 개발 된 본질적인 프로토콜23 최소한의 외부 요인으로 자체 조직 하는 IPSCs의 본질적인 능력에 의존 하 고 다른 뇌 영역 간의 상호 작용을 모델링 하는 독특한 기회를 제공 하는 독특한 두뇌 영역의 기초를 포함 하는 대뇌 오르가노이드를 발생. 그러나 이러한 모델링 전략에 내재된 높은 가변성과 이질성은 재현성의 중요한 과제를 제시합니다. 유도 된 오르가노이드 분화 프로토콜은 최소한의 이질성을 가진 뇌 영역 별 오르가노이드의 생성을 허용24,25,26. 이 접근은 우리가 성공적으로 초기 인간 뇌 피질 발달의 주요 프로세스를 recapitouulate 심실 같이 구조물로 등쪽 전뇌 오르가노이드를 생성할 수 있었습니다. 첫 번째 중요한 문제는 10% 미만의 분화를 나타내는 대규모 일반 식민지를 수용하는 고품질 hIPSC 배양으로 시작하여 hIpC를 단일 세포 배양 조건에 적응시키기 위해 거의 한 번 단층으로 통과되었습니다. 실제로, 기관의 이질성을 제한하기 위해, 필드의 주요 과제 중 하나, 균일 한 크기의 EBs의 형성은 정의 된 세포 밀도에서 시드를 허용 단일 세포 현탁액으로 hIPSC 식민지의 해리의 필요성을 의미 하는 전제 조건이다. 또 다른 중요한 단계는 3D 구조와 신경 상피 확장을 지원하는 데 필요한 EB의 BMM 포함입니다. 우리는 추가 단계인 BMM 해리를 수반하더라도 개별 적인 포함을 통해 대략 15 개의 오르가노이드의 그룹 포함을 선호했습니다. BMM 해리는 배양을 흔들기 전에 오르가노이드 배치 내와 사이의 가변성을 감소시켜 더 높은 재현성을 초래하는 것으로 나타났다34. 또한, BMM로 확장되는 세포 공정을 제거할 수 있어 다음과 같은 분화 단계에 해롭지 않지만 절차의 후속 단계에서 품질 검사를 위해 오르가노이드를 관찰하기가 어렵다. 영양 흡수와 산소 교환을 개선하기 위해, 우리는 궤도 셰이커에 오르간성 성숙과 유사한 결과를 주도 회전 생물 반응기를 비교했다. 따라서 우리는 중간 부피를 크게 줄이고 따라서 실험의 총 비용을 줄일 수 있으므로 궤도 셰이커 옵션을 선택했습니다. 중요한 것은, 고정식 및 흔들리는 배양에 대해 다른 인큐베이터를 사용하여 hIPSC 성장에 해로운 진동을 피하십시오. 이 프로토콜을 5개의 고유한 제어 hIPSC lines35에 성공적으로 적용하여 이 절차의 견고성을 보장하는 동질적인 결과를 초래합니다.

이러한 오르가노이드의 특성화는 여러 가지 방법을 사용하여 달성 될 수있다. 오르가노이드 내에서 3D 공간 정보를 보존하기 위해 후속 광시트 획득을 통해 전체 마운트 면역 스테인링 및 전체 오르가노이드를 제거할 수 있는 프로토콜을 설정했습니다. 샘플 원점에서 와 두께36,37에 따라 다른 클리어링 방법이 효율로 나타났습니다. 여기에서는 이전에 마우스 뇌와 장 내장을 지우는 데 사용했던 글리콜 유도체인 TDE(2,2'-티오디에탄올)에 의존하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 클리어링 방법을 설정했습니다38,39. 면역염색 및 클리어된 오르가노이드의 취득은 80% TDE에 침지된 20배 목표를 사용하여 광시트 현미경으로 수행되었다. 다른 3D 이미징 획득 방법에 비해, 라이트 시트 현미경 검사는 빠른 획득, 좋은 침투 및 감소 된 광표백의 여러 가지 이유로 관심입니다. 투과성 화 단계의 최적화는 전체 오르가노이드의 모든 선조 및 신경 세포 유형에서 확장되는 PC의 기저 몸과 축종을 시각화할 수 있도록 효율적이고 균일한 항체 침투에 도달할 수 있게 한다. 또한, 40배(NA 1.3) 또는 63배(NA 1.4) 오일 목표를 가진 반전공진스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 150μm 두께의 면면을 획득하면 상당한 정도의 3D 공간 정보를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 허용하면서 해상도를 더욱 발전시킬 수 있습니다.

이러한 2D 및 3D 세포 기반 모델및 3D 이미징 분석(그림 5)을 결합하여 ciliopathy 환자 세포를 재프로그래밍하거나 CRISPR/CAS9 기술을 사용하여 중구 또는 모성 유전자를 구체적으로 편집함으로써 뇌피질의 정상 및 병리학 적 발달 동안 PC의 기여도에 대한 이해가 상당한 진전을 허용해야 한다. 중요한 것은, 게놈 편집 기술은 또한 질병 기계장치의 검출에 도전하는 유전 이질성을 극복하기 위하여 동소성 통제 hIPSCs를 얻기 위하여 참을성 있는 돌연변이를 구체적으로 구출할 수 있습니다. 또한, 단세포 게놈 접근법은 이제 현장 전반에 걸쳐 널리 사용되고 면역 염색 분석에 대한 관련성 있고 상호 보완적인 접근법을 나타냅니다. 따라서, 모든 신흥 기술에 내재된 몇 가지 제한과 어려움에도 불구하고, 광범위하게 해결되고 있는, 이러한 2D 및 3D hIPSC 기반 모델 및 우리가 여기에서 제시한 특성화 방법은 인간 발달 신코르티컬 이상의 근본적인 병리학 적 메커니즘에 PC 참여를 해부하는 강력하고 관련있는 도구를 제공합니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 S.T.(ANR-17-CE16-0003-01) 및 N.B.B.(ANR-16-CE16-0011 및 ANR-19-CE16-0002-01)에 대한 국가 국립 기관 드 라 레체쉬(ANR)의 보조금에 의해 지원되었습니다. LB는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01)과 베텐코트 슈엘러 (MD-PhD 프로그램)에서 ANR에 의해 지원됩니다. 이매진 연구소는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01, CrossLab 프로젝트)에 따라 ANR의 국가 자금 지원및 두 번째 인베스트먼트 d'Avenir 프로그램 (ANR-17-RHUS-0002)의 일환으로 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

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References

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발달 생물학 문제 181 1 차 질 인간 유도 만능 줄기 세포 hIPSC 신경 줄기 및 선조 세포 인간 뇌 피질 개발 신경 장미 등쪽 전뇌 오르간노이드 2D 및 3D hIPSC 기반 모델 신코르피 개발 대뇌 오르간 광학 경협 광학 고슴도치 광학 포주
2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.
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