Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/62667
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1, 1,5, 1,6, 2, 1
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Abstract

Cilia primária (PC) são organelas dinâmicas de microtúbulos não motil que se projetam da superfície da maioria das células mamíferas. Eles emergem do centríclulo mais antigo durante a fase G1/G0 do ciclo celular, enquanto desmontam à medida que as células reentram no ciclo celular no limite da fase G2/M. Eles funcionam como hubs de sinal, detectando e transduzindo sinais extracelulares cruciais para muitos processos celulares. Semelhante à maioria dos tipos de células, todas as células-tronco neurais neocorticais e progenitoras (NSPCs) têm sido mostradas abrigando um PC permitindo-lhes sentir e transduzir sinais específicos necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para gerar e caracterizar modelos bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) baseados em células-tronco de células-tronco induzidas por humanos (hIPSCs) para dissecar ainda mais o envolvimento do PC durante o desenvolvimento neocortical. Em particular, apresentamos protocolos para estudar a biogênese do PC e funcionar em NSPCs derivados de roseta neural 2D, incluindo a transdução da via Sonic Hedgehog (SHH). Para aproveitar a organização tridimensional (3D) de organoides cerebrais, descrevemos um método simples para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos. Após a limpeza óptica, a rápida aquisição de organoides inteiros permite a detecção de centrossomos e PC em progenitores neocorticais e neurônios de todo o organoide. Por fim, detalhamos o procedimento de imunostenção e compensação de seções organoides de flutuação livre espessa preservando um grau significativo de informações espaciais 3D e permitindo a aquisição de alta resolução necessária para a análise qualitativa e quantitativa detalhada da biogênese e função do PC.

Introduction

Cílios primários (PC) são organelas à base de microtúbulos que sentem e transduzem uma infinidade de pistas químicas e mecânicas do ambiente extracelular. Em particular, pc é a organela central para a transdução da via de sinalização hedgehog em vertebrados1,2. Embora a maioria das células neurais tenham sido mostradas há muito tempo abrigando um PC, a contribuição desta organela na formação do sistema nervoso central tem sido há muito desvalorizada. Estudos sobre desenvolvimento neocortical levaram à descoberta de múltiplas células-tronco neurais e progenitoras (NSPCs), todas abrigando um PC, local que foi proposto para ser crucial para a determinação do destino progenitora3,4,5,6,7. O PC tem sido mostrado crucial para os mecanismos celulares necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal, incluindo a expansão do NSPC e o compromisso de 8,9,10,11,12, bem como a polaridade apicobasal do andaime glial radial que suporta a migração neuronal13. Além disso, pc são necessários durante a migração tangencial de interneurons para a placa cortical14,15. Finalmente, foi proposto um papel para o PC no estabelecimento de conexões sinápticas de neurônios no córtex cerebral16,17. Ao todo, esses achados defendem um papel crucial do PC nas principais etapas do desenvolvimento cortical cerebral18,19 e levantam a necessidade de investigar seu envolvimento nos mecanismos patológicos subjacentes às anomalias do desenvolvimento cortical cerebral.

Estudos recentes melhoraram em grande parte nossa compreensão de importantes diferenças celulares e moleculares entre o desenvolvimento cortical em modelos humanos e animais, enfatizando a necessidade de desenvolver sistemas de modelos humanos. Nessa visão, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hIPSCs) representam uma abordagem promissora para estudar a patogênese da doença em um contexto genético e celular relevante. Modelos bidimensionais aderentes (2D) ou rosetas neurais contêm NSPCs semelhantes aos vistos no córtex cerebral em desenvolvimento, que se organizam em estruturas em forma de roseta mostrando polaridade apicobasal correta20,21,22. Além disso, o sistema de cultura tridimensional (3D) permite a geração de organoides forebraínicos dorsais que recapitulam muitas características do desenvolvimento cortical cerebral humano23,24,25,26. Essas duas abordagens complementares de modelagem baseada em células oferecem perspectivas interessantes para dissecar o envolvimento do PC durante o desenvolvimento normal e patológico do córtex cerebral.

Aqui, fornecemos protocolos detalhados para a geração e caracterização de rosetas neurais e NSPCs derivadas, bem como organoides forebraínicos dorsais. Também fornecemos protocolos detalhados para analisar a biogênese e a função do PC presente nos NSPCs, testando a transdução da via Sonic Hedgehog e analisando a dinâmica das moléculas cruciais envolvidas nesse caminho. Para aproveitar a organização 3D dos organoides cerebrais, também criamos um método simples e econômico para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos permitindo a rápida aquisição, graças a um microscópio de folha de luz, de todo o organoide, com alta resolução permitindo visualizar PC em todos os tipos de progenitores neocorticais e neurônios de todo o órgãoide. Finalmente, adaptamos a imunohistoquímica em seções flutuantes livres de 150 μm com compensação e aquisição subsequentes usando microscópio confocal de varredura ressonante permitindo a aquisição de imagens de alta resolução, o que é necessário para a análise detalhada da biogênese e função do PC. Especificamente, o software de imagem 3D permite a reconstrução 3D do PC com análise subsequente de parâmetros morfológicos, incluindo comprimento, número e orientação do PC, bem como medição da intensidade do sinal de componentes ciliares ao longo do axoneme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Geração de modelos baseados em células 2D hIPS de desenvolvimento neocortical

  1. Formação de roseta neural
    1. Comece com as culturas do HIPSC abrigando grandes colônias regulares, exibindo menos de 10% de diferenciação e não mais de 80% de confluência.
    2. Enxágüe os hIPSCs com 2 mL de PBS.
    3. Adicione 2 mL de meio de indução NSPC complementado com o inibidor de rocha (NIM + 10 μM de Y-27632).
    4. Dissecar manualmente cada colônia hIPSC de um prato de 35 mm usando uma agulha para cortar cada colônia precisamente em direções horizontais e verticais para criar um padrão de tabuleiro de verificador dividindo cada colônia em aglomerados iguais.
    5. Retire a colônia usando um raspador de células e transfira-os para um prato de 35 mm de ultra-baixo.
    6. Deixe-os flutuar durante a noite (ON) em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2, para que possam formar corpos embrionários (EBs).
      NOTA: Os corpos embrióides (EBs) são definidos como aglomerados esferoides flutuantes ou agregados de hIPSCs.
    7. Transfira os EBs para pratos poli-L-ornithine/laminin (PO/lam)-coated 35 mm em 2 mL NIM + 10 μM de Y-27632.
    8. Atualização diária Meio de indução NSPC (NIM sem Y-27632) até a formação de rosetas neurais que leva aproximadamente 12 a 14 dias. Verifique sob o microscópio.
      NOTA: Após esta etapa, as rosetas neurais podem ser expandidas, diferenciadas e processadas para análise de imunosstaining ou dissociadas para obter células neurais e progenitoras isoladas (NSPCs).
  2. Expansão de roseta neural e diferenciação precoce
    1. Corte as rosetas neurais em um padrão de grade com uma agulha e desaloja os aglomerados usando um raspador de células.
    2. Transfira as rosetas para uma placa de 4 poços contendo tampas de vidro revestidas de PO/lam (4-5 rosetas/bem) em 0,5 mL de meio de manutenção NSPC (NMM).
    3. Incubar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
    4. Atualize nmm a cada dois dias até o dia 20.
    5. A partir do dia 20, as rosetas neurais da cultura em 0,5 mL de citocina esgotadas NMM para permitir a diferenciação. Atualize o meio a cada 2-3 dias.
    6. Nos dias 30 e dia 40 (10 ou 20 dias de diferenciação), fixe as rosetas com 0,5 mL de 4% PFA, 20 min, RT.
  3. Biogênese do PC e análise de funções em NSPCs isolados
    1. Dissociação do NSPC
      1. Corte as rosetas neurais do passo 1.1.8 em um padrão de grade com uma agulha e desaloja os clusters usando um raspador de células. Transfira as células para pratos de 35 mm revestidos de PO/lam em 2 mL de NMM e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
      2. Atualize nmm a cada dois dias até a confluência (aproximadamente 5-7 dias).
      3. Depois de raspar as células grandes e claras ao redor das rosetas neurais, escolha-as manualmente e transfira-as para pratos frescos revestidos de PO/lam de 35 mm para enriquecer para NSPCs e esgotar tipos de células não neurais.
      4. Após uma ou duas passagens manuais (repetir a etapa 1.3.1.3, se necessário) necessárias para remover todos os tipos de células contaminantes, remova o meio e enxágue com PBS.
      5. Adicione 300 μL de trippsina de 0,05% e incubar por 5 min a 37 °C até que a maioria das células se desprendem.
      6. Adicione 2 mL do meio contendo 10% de FBS (DMEM + 10% FBS) para inativar a trippsina. Colete a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL. Pipete suavemente a suspensão da célula para cima e para baixo três vezes para quebrar os aglomerados celulares.
      7. Centrifugar a 300 x g por 5 min.
      8. Aspire cuidadosamente o supernatante e resuspense as células em NMN.
      9. Semear os NSPCs dissociados como células únicas (1 x 105 células/cm2) em NMM em pratos revestidos de PO/lam e incuba-los em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
      10. Expanda os NSPCs em NMM alterando o meio a cada dois dias.
        NOTA: Os NSPCs são semeados em alta densidade para evitar diferenciação.
    2. Análise de biogênese do PC
      1. As sementes dissociaram os NSPCs a 100.000 células/cm2 e incubam-nas em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 em NMM por 2 dias.
      2. Aspire os NSPCs médios e famintos em meio empobrecido de citocina (meio de fome NSPC, Tabela Suplementar 1) por 48 h.
      3. Corrigir NSPCs com 4% de PFA por 20 min na RT.
      4. Lave duas vezes com PBS por 5 minutos no RT antes de imunossuagem.
    3. Análise da função do PC: caminho de sinalização SHH
      1. As NSPCs dissociadas por 100.000 células/cm2 em lâminas de câmara de 8 poços revestidas de PO/lam (300 μL) ou T25 (5 mL) e incubam em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 em NMM por 2 dias.
      2. Starve NSPCs em NSPC meio de fome (300 μL por poço de 8-well slide de câmara e 5 mL em frasco T25) por 48 h.
      3. Para induzir a via SHH, incubar os NSPCs com o meio de fome suplementado com SHH recombinante (100 ng/mL) ou SAG (500 nM); (150 μL por poço de um escorregador de câmara de 8 poços e 2 mL em frasco T25) por 24 h.
      4. Corrija NSPCs cultivados em slides de câmara de 8 poços em 250 μL de 4% pfa por poço por 20 min em RT e lave-os duas vezes com 250 μL de PBS por 5 min na RT antes da análise imunosstaining.
      5. Remova os NSPCs médios e lavem cultivados em pratos T25 com PBS.
      6. Adicione 500 μL de 0,05% de trippsina e incubar por 5 min a 37 °C até que as células se desprendem.
      7. Adicione 2 mL de meio contendo 10% de FBS (DMEM + 10% FBS) para inativar a trippsina e coletar a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL.
      8. Centrifugar a 300 x g por 5 min e aspirar cuidadosamente o supernante para obter pelotas NSPC que podem ser criopreservadas a -80 °C antes da extração de RNA e análise RT-PCR.

2. Geração de organoides de forebraína dorsal

  1. Cultura unicelular de hIPSCs
    1. Comece com as culturas do HIPSC que abrigam grandes colônias regulares que exibem menos de 10% de diferenciação e que foram passagemdas quase uma vez. Certifique-se de que as células não são mais do que 80% confluentes.
    2. Lave as colônias com 2 mL de PBS.
    3. Adicione 500 μL de Reagente de Dissociação Celular Suave (GCDR) e incubar por 5 a 7 min a 37 °C.
    4. Aspire o GCDR e adicione 2 mL de mTeRS1 médio suplementado com 5 μM de Y-27632.
    5. Pipeta as células suavemente para cima e para baixo 10 vezes para dissociar todas as colônias em células únicas.
    6. Transfira as células em pratos revestidos de vitronectina e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
      NOTA: Realize pelo menos 1 passagem dos hIPSCs usando GCDR antes do experimento de diferenciação para adaptar os hIPSCs às condições de cultura unicelular.
  2. No dia 0, permitam que os hIPSCs formem corpos embrionários em meio EB contendo uma baixa concentração de FGF2 e uma alta concentração de inibidor de rochas necessária para a sobrevivência do HIPSC. Para isso, siga os passos abaixo.
    1. Lave as colônias com 2 mL de PBS.
    2. Adicione 500 μL de Reagente de Dissociação Celular Suave (GCDR) e incubar por 5 a 7 min a 37 °C.
    3. Aspire o GCDR e adicione 1 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632; Use uma pipeta de 1 mL para desprender suavemente as células e transferi-las para um tubo cônico de 15 mL.
    4. Enxágüe mais uma vez com 2 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632, transfira as células restantes para o tubo cônico de 15 mL. Adicione imediatamente 3 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632 ao tubo cônico e homogeneize suavemente a solução usando uma pipeta de 5 mL.
    5. Centrifugar as células dissociadas a 100 x g por 5 min.
    6. Aspire suavemente o supernasce e resuspenque as células em 6 mL de meio EB suplementado com 50 μM de Y-27632.
    7. Centrifugar as células a 100 x g por 5 min.
    8. Aspire o supernasal e resuspense as células em 1 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632. Use uma pipeta de 1 mL para dissociar suavemente as células em uma suspensão de célula única.
    9. Imediatamente após resususuco as células, diluir e contá-las.
    10. Diluir o volume adequado de suspensão celular (contendo 900.000 células) em 30 mL de meio EB complementado com 50 μM de Y-27632 e 4 ng/mL de bFGF e misturar suavemente a solução.
    11. Placa 9.000 células/bem em uma placa de fixação ultra-baixa 96U (300 μL/well). Para evitar perturbações na formação do EB, incubar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 até o dia 3 sem alteração média.
  3. Indução neural (inibição dual SMAD)
    1. No dia 3, assegure-se de que os EBs medem 300-400 μm e mostram fronteiras regulares. Se ambos os critérios forem alcançados, substitua metade do meio (150 μL) por indução média-1 contendo inibidores dual SMAD, levando ao brilho do contorno dos EBs pelo dia 6 ao dia 7 indicando diferenciação neuroectodérmica (Tabela Suplementar 2).
    2. No dia 4, substitua 3/4 do médio (225 μL) por meio de indução-1.
    3. Nos dias 6 e 8: Refresque metade do meio de indução-1 (150 μL).
  4. Organoide incorporando em matriz de membrana do porão (Dia 10)
    1. No dia 10, incorporar EBs no fator de crescimento reduziu a matriz de membrana do porão (BMM).
      NOTA: A partir desta etapa, use sempre uma tesoura estéril para cortar a abertura das pontas da pipeta para evitar danificar os organoides por meio de tubulações repetidas.
    2. Primeira transferência em torno de 15-17 organoides em tubos cônicos. Deixe os EBs se acomodarem e removam o meio. Adicione 50 μL de indução média-2 e transfira-os para um tubo de microcentrifusagem contendo 100 μL de BMM.
    3. Espalhe a mistura matriz-EB no centro de um poço de uma placa de ultra-baixa fixação e separe os EBs para evitar que eles se fundam.
    4. Deixe o BMM solidificar na incubadora a 37 °C por 45 min.
    5. Adicione 3 mL do meio-2 de indução em cada poço e coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
      NOTA: Certifique-se de que este procedimento seja feito o mais rápido possível, pois o BMM se solidifica à temperatura ambiente.
  5. Cultura estacionária de organoides incorporados na matriz da membrana do porão
    1. Dia 12, 14: Atualizar a indução média-2.
    2. Dia 16: Refrescar a indução média-2 e verificar sob um microscópio a expansão de laços neuroepiteliois.
  6. Dissociação da matriz da membrana do porão e cultura em um agitador orbital
    1. No dia 17, dissociar organoides da BMM por pipetar para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 5 mL e transferi-los para a diferenciação média-1 (sem vitamina A). Incubar em um agitador orbital a 80 rpm em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 para melhorar a absorção nutricional.
      NOTA: Use uma incubadora diferente para cultura estacionária e cultura em um agitador orbital para evitar vibrações prejudiciais ao crescimento de células hIPS aderentes.
    2. Dia 19: Atualizar a diferenciação média-1.
    3. Dia 21: Alterar a diferenciação média-1 para diferenciar o médio-2 (com vitamina A).
    4. Do dia 23 ao dia 35: Atualizar o meio com diferenciação média-2 a cada 2-3 dias.
    5. Do dia 35 ao dia 70: Atualize a diferenciação média-2 com 1% de BMM e atualize a cada 2-3 dias.
    6. Colete os organoides após 28, 42 e 70 +/- 2 dias de diferenciação e fixe-os durante a noite a 4 °C, em 5 mL 4% PFA em um tubo cônico de 15 mL.
    7. Para análise suplementar ou de imunostaining flutuante livre, os organoides são então enxaguados duas vezes em PBS e conservados a 4 °C em PBS + 0,05% de azida de sódio.
    8. Para análise de imunossuagem em seções congeladas, mergulhe 4% de organoides fixos PFA em 10 mL 30% de sacarose a +4 °C ON (ou até que os organoides afundem). Incorpore-os em uma matriz de incorporação congelada e armazene a -80°C até que se cryosectioning.

3. Na aquisição de imunolabeling, compensação e folha de luz de organoides forebraínticos dorsais

  1. Fixação
    1. Colete os organoides em placas de 6 poços, remova o meio e fixe-os com 2 mL de 4% PFA, a 4 °C, durante a noite.
    2. Realizar três lavagens em 2 mL de PBS em temperatura ambiente.
    3. Transfira os organoides em tubos de 2 mL e armazene a 4 °C em 2 mL de PBS + 0,05% de azida de sódio.
  2. Permeabilização
    1. Incubar organoides em 1 mL de PBS contendo 0,2% Triton X100 em RT por 1 h. Faça isso duas vezes.
    2. Incubar em 1 mL de PBS contendo 0,2% Triton X100 e 20% DMSO, a 37 °C, durante a noite.
    3. Incubar em 1 mL de PBS contendo 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Desoxicolado, 0,1% NP40 e 20% DMSO, a 37 °C, durante a noite.
    4. Incubar em 1 mL de PBS contendo 0,2% Triton-X100, na RT, por 1h. Faça isso duas vezes.
  3. Bloqueio e imunolabelamento
    1. Bloco em 1 mL de solução de bloqueio (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Donkey Serum,10% DMSO), a 37 °C, ON.
    2. Incubar com anticorpos primários diluídos em 250 μL de PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/mL de Heparina, 5% DMSO e 3% De Soro de Burro, a 37 °C, por 2 dias.
    3. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween20 e 0,1 μg/mL de Heparina, por 1h, a 37 °C. Faça isso quatro vezes.
    4. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween20 e 0,1 μg/mL de Heparina, durante a noite, a 37 °C.
    5. Incubar com anticorpos secundários diluídos em 250 μL de PBS contendo 0,2% Tween 20, 0,1 μg/mL de Heparina e 3% De Soro de Burro, a 37 °C, durante 2 dias.
    6. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween 20 e 0,1 μg/mL de Heparina, por 1h, em uma roda, na RT. Faça isso quatro vezes.
    7. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween 20 e 0,1 μg/mL de Heparina, durante a noite, em uma roda, na RT.
    8. Lave em 1 mL de PBS, por 24 h, na RT.
    9. Estoque a +4 °C em 1 mL de PBS e 0,05% azida de sódio até a compensação.
  4. Limpeza em TDE (2,2′ -Thiodietanol)
    1. Incubar os organoides em 1 mL de 30% TDE (3 mL de TDE + 7 mL de PBS), por 24 h, na RT.
    2. Incubar em 1 mL de 60% TDE (6 mL de TDE + 4 mL de PBS), por 24 h, na RT.
    3. Incubar em 1 mL de 80% TDE (8 mL de TDE + 2 mL de PBS), por 24 h, na RT.
  5. Incorporação organoide antes da aquisição de folha de luz
    NOTA: Use um sistema personalizado; feito com uma seringa de 1 mL com a ponta cortada com um bisturi.
    1. Prepare 100 mL de 4% de Agarose de Baixo Derretimento em solução TDE de 60% e alíquota em tubos de 2 mL. Conservar a +4 °C.
    2. Antes da incorporação organoide, pré-aqueça um tubo contendo 1,5 mL de 4% de baixa fusão em 60% de TDE em um banho de água a 37 °C até que liquefaça.
    3. Enquanto isso, prepare um sistema de moldagem feito sob medida feito a partir de uma seringa de 1 mL da qual a ponta é cortada usando um bisturi.
    4. Bombeie na seringa 600 μL da solução gel usando o êmbolo.
    5. Posicione a amostra usando uma ponta de pipeta ampliada, a abertura da qual foi cortada usando uma tesoura estéril.
    6. Preencha a seringa com 400 μL de solução de gel para que a amostra esteja posicionada dentro do terço inferior da seringa.
    7. Deixe o gel polimerizar e armazenar em solução 80% TDE a 4 °C protegido da luz até a aquisição.
    8. Para aquisição de folha light, use um objetivo de 20x imerso em 80% de solução TDE adicionada na câmara de amostra para permitir ajustar com precisão o índice de refração do método de compensação.
    9. Insira a seringa contendo o organoide incorporado agarose no maior suporte de amostra projetado para acomodar uma seringa de 1 mL do qual o êmbolo pode ser operado para posicionar o organoide na frente do objetivo.
      NOTA: A aquisição de uma folha de luz de um organoide inteiro leva aproximadamente 5 a 10 minutos.

4. Imunostaining e limpeza de seções flutuantes livres de organoides forebraínticos dorsais

  1. Fixação, incorporação de ágaroses e secção dos organoides
    1. Coletar organoides após 28, 42 e 70 +/- 2 dias de diferenciação em uma placa de 6 poços e fixar durante a noite a 4 °C em 2 mL de 4% PFA.
    2. Enxágüe duas vezes em 2 mL de PBS e conservar a 4 °C em 2 mL de PBS + 0,05% de azida de sódio.
    3. Incorporar os organoides fixos em 4% de baixa derretimento surgiu em um molde de incorporação de plástico (7 x 7 mm). Remova cuidadosamente o bloco de agarose do molde plástico e cole-o ao estágio vibratome.
    4. Se se se section os organoides incorporados usando um vibratome para obter seções flutuantes livres de 150 μm transferidas em um poço de uma placa de 24 poços contendo 500 μL de PBS usando uma escova de tinta para evitar danificar as seções.
      NOTA: Recomenda-se a agarose de baixo derretimento, pois sua temperatura de fusão é de apenas aproximadamente 60 °C. Prepare 4% de baixa derretimento na solução PBS e deixe esfriar um pouco acima de 37 °C em um banho de água antes da incorporação organoide.
  2. Permeabilização, bloqueio e imunossaturação
    1. Incubar as seções em 500 μL de PBS contendo 0,3% Triton X100, na RT, sob agitação, por 20 min. Faça isso três vezes.
    2. Incubar as seções em 500 μL de PBS contendo 0,3% Triton X100 e 5% leite sem gordura, em RT, sob agitação, por 2h.
    3. Incubar as seções em 250 μL de solução de anticorpos primários (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de leite sem gordura), sob agitação, a +4 °C, durante a noite.
    4. Lave as seções em 500 μL de PBS, na RT, sob agitação, por 20 minutos. Faça isso quatro vezes.
    5. Incubar as seções em 250 μL de solução secundária de anticorpos (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de leite sem gordura), na RT, sob agitação, por 2h.
    6. Lave as seções em 500 μL de PBS, na RT, sob agitação, por 20 minutos. Faça isso quatro vezes.
    7. Armazene as seções em 500 μL de PBS, a +4° C até a limpeza.
  3. Limpeza em TDE (2,2′ -Thiodietanol)
    1. Incubar as seções em 500 μL de 30% e 60% de TDE para 1h cada na RT e, em seguida, em 500 μL de 80% TDE durante a noite, na RT.
    2. Armazene as seções desmatadas em 500 μL de 80% de TDE até a aquisição a +4 °C.
  4. Montagem de seções flutuantes livres antes da aquisição com confocal de varredura ressonante
    1. Monte uma seção flutuante em uma câmara selada permitindo manter a amostra em solução TDE de 80% e projetada para se adaptar em um estágio XY motorizado de microscópios confocal.
    2. Coloque uma tampa redonda no sistema de câmara.
    3. Transfira cuidadosamente a seção imunossuada limpa usando um pincel.
    4. Encha a câmara com 80% de solução TDE.
    5. Adicione duas tampas padrão mais uma tampa redonda de segunda e uma vedação de silicone.
    6. Enrosque o anel de parafuso da câmara para selar perfeitamente o sistema.

5. Folha de luz e análise confocal de varredura ressonante

  1. Folha de luz de processo e aquisições de varredura ressonante usando software que permitem visualização e análise 3D de toda a amostra imunostained.
    NOTA: Esse software permite abrir rapidamente dados enormes para fazer facilmente instantâneos e animações. Ele permite mover a amostra em diferentes orientações e gerar visualizações 2D graças a uma ferramenta fatiadora 2D em diferentes orientações, XY e YZ, por exemplo.
  2. Para detecção automática de centrosmosos e cilias primárias, use um assistente de ponto que permita quantificar seu número em condições patológicas versus de controle.
  3. Para a reconstrução 3D do PC permitindo uma medição precisa de seu comprimento, use um assistente de filamento para corrigir manualmente o ponto de partida do PC e o software usa o sinal de fluorescência para reconstruir o PC com precisão.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Modelos baseados em células 2D hIPS para estudar biogênese e função do círio primário
O protocolo aqui detalhado foi adaptado de estudos publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite a geração de estruturas de roseta neural que contêm progenitores neocorticais e neurônios semelhantes aos vistos no neocórtex em desenvolvimento. A validação detalhada pode ser realizada por meio de análises convencionais de imunostaining utilizando fabricantes específicos3. Por exemplo, os progenitores apical (AP) devem ser duplamente manchados com SOX2 e PAX6, progenitores intermediários (IP) são revelados pela coloração de TBR2/EOMES, e neurônios neocorticais de nascimento precoce são revelados pela coloração CTIP2 (Figura 1A-C). Tais estruturas neurais semelhantes a rosetas modelam migração nuclear intercinética (INM) de AP que pode ser visualizada por imunosmunhagem com anticorpos levantados contra fosfo-vimentina, que mancha núcleos mitotéticos e TPX2 que mancha o fuso mitotístico. Esses marcadores, portanto, permitem que a análise de várias características de AP, incluindo o INM com divisão celular ocorra apicamente em torno do lúmen central (Figura 1D,D'), bem como o modo de divisão determinado pela medição do ângulo entre o plano de divisão e a superfície apical. Por fim, a ciliogênese pode ser analisada por imunossuagem com anticorpos levantados contra PCNT, que mancha o corpo basal do PC, e ARL13B que mancha o axoneme. Em tais estruturas de roseta, o PC estende-se do polo apical de APs para o lúmen central de cada região semelhante ao ventrículo (Figura 1E,E'), enquanto eles também estão salientes dos neurônios CTIP2+ (Figura 1E'').

A dissociação dessas estruturas de roseta permite a obtenção de NSPCs isolados cultivados em placas de cultura revestidas de poli-L-ornithine/laminina em NMM em alta densidade para permitir a manutenção de uma população estável e expansível de NSPCs por pelo menos 15 passagens sem acumular anormalidades karyótipo21,27. Para analisar a biogênese do PC, os NSPCs dissociados são cultivados à confluência e famintos por 48 h. Análises imunossundo usando anticorpos levantados contra marcadores de PC mostram que esses NSPCs abrigam PC (Figura 2A). Combinando duas ferramentas complementares de código aberto, o Ilastik, uma ferramenta de análise de imagem baseada em aprendizado de máquina útil para segmentação de PC28 e CiliaQ, um pacote de plugin Fiji/ImageJ29, que permite a reconstrução 3D do PC a partir de pilhas de imagens confocal 3D, vários parâmetros estruturais podem ser facilmente avaliados, incluindo o número de PC e seu comprimento.

A função do PC dos NSPCs também pode ser avaliada testando a transdução da via de sinalização de Ouriço. Para avaliar a transdução da via de sinalização SHH, os NSPCs passam fome por 48 h e são tratados com SHH recombinante (rSHH) ou um agonista suavizada (SAG) por 24 horas. Usando anticorpos levantados contra GPR161, SMO e GLI2, a análise imunofluorescente (IF) permite testar o tráfico desses principais atores de sinalização SHH ao longo do PC, com o GPR161 normalmente saindo do PC enquanto GLI2 e SMO se acumulam dentro do PC em resposta à ativação da via SHH (Figura 2C-D). A análise das pilhas de imagens confocal 3D usando ferramentas CiliaQ permite quantificar a saída gpr161 do PC, bem como o acúmulo de GLI2 e SMO dentro do PC após a ativação da via SHH (Figura 2F-G). Além disso, a análise de RT-PCR semi-quantitativo sobre mRNA extraído de NSPCs tratados com rSHH ou SAG mostra a indução de dois genes-alvo SHH, GLI1 e PTCH1, atestando a transdução normal de sinalização de SHH em NSPCs derivados de hIPSCs de controle (Figura 2B).

No geral, modelos baseados em células 2D de desenvolvimento do cérebro dorsal reproduzem claramente vários aspectos do desenvolvimento normal do córtex cerebral e representam ferramentas promissoras para dissecar mecanismos associados ao PC que indiquem anomalias subjacentes ao desenvolvimento neocortical usando o controle versus os hIPSCs do paciente que abrigam mutações em genes responsáveis pelas anomalias do desenvolvimento humano do córtex cerebral.

Modelos baseados em células hIPS 3D para estudar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical
O protocolo aqui descrito (Figura 3A) foi adaptado de protocolos publicados anteriormente23,24,25,26,30 e testado com sucesso em cinco linhas de controle distintas do HIPSC. Permite a geração de organoides de cérebro dorsal derivados do hIPSC que aumentam de tamanho ao longo do tempo, formando grandes laços neuroepiteeliais (Figura 3B). A análise de imunolabeling, seja em crioseções organoides (criostat, 20 μm), seções flutuantes livres (vibratome, 150 μm) ou em toto, podem ser realizadas para controles de qualidade. No dia 28 ± 2, os organoides consistem em loops neuroepiteliois estratificados co-expressando o marcador progenitor neural SOX2 e o marcador de prepórias dorsal PAX6, atestando a identidade do prep combran dorso. No dia 42 ± 2 (6 semanas de diferenciação), esses loops devem exibir uma organização estratificada mais complexa. Do apical à superfície basal dessas estruturas de loop, uma região ventricular (VZ) com progenitores gliais radiais aical positivas SOX2/PAX6 (aRG) podem ser delineados, bem como uma região subventricular (SVZ) com progenitores intermediários TBR2 positivos (IPs) e uma região semelhante a placa cortical (CP) contendo neurônios neocortical ctip2 positivos (Figura 3C, E). A polaridade molecular apical do aRG pode ser avaliada pelo enriquecimento apical na superfície ventricular do ZO-1 e N-CADH (Figura 4A, Vídeo 1). As propriedades da divisão progenitora aRG podem ser avaliadas usando marcadores TP2X e P-VIM para analisar o INM que normalmente leva ao alinhamento de núcleos mitotísticos aRG na superfície ventricular dos laços cortical (Figura 4B, Vídeo 2). Tal imunolabeling também permite a medição do ângulo de divisão para avaliar o modo de divisão simétrica versus assimétrica de aRG. Progenitores positivos P-Vim também podem ser observados na região semelhante ao SVZ, abrigando um processo basal único que se estende até a superfície basal que lembra a glia radial externa (oRG ou glia radial basal, Figura 4C, Vídeo 2). Enquanto eles estão ausentes desde o dia 42 organoides, os neurônios de nascimento tardio positivo satb2 devem ser detectados a partir do dia 70 (10 semanas de diferenciação) (Figura 3D,F), atestando o tempo in vivo de diferenciação neuronal neocortical.

Experimentos de imunolabeling usando o corpo basal (gama Tubulin) e marcadores de axoneme (ARL13B) permitem visualização de PC em 20 μm cryosections (Figura 3G,H). Para aproveitar a organização 3D de organoides de antebraína dorsal, a imunostaining de montagem inteira pode ser realizada. A aquisição de folhas leves de tais organoides imunossutives e limpos permite a detecção tanto de centrossósmos quanto de PC em todos os tipos de NSPC, bem como em neurônios neocorticais (Vídeo 3). Além disso, para realizar análises mais precisas da biogênese do PC, pode-se realizar análises imunohistoquímicas em seções grossas flutuantes (150 μm) de organoides de forebraína dorsal. Após a compensação, tais seções podem ser adquiridas utilizando um objetivo de óleo de 40x (NA 1.3) ou 63x (NA 1.4) de um microscópio laser confocal de luz branca ressonante invertido, permitindo melhorar a resolução, preservando as informações espaciais 3D dos organoides. Esse microscópio confocal de varredura a laser permite a aquisição rápida de seções grossas, com uma excitação e detecção precisas e flexíveis sem qualquer interferência (Vídeo 4). Vários parâmetros estruturais do PC podem ser avaliados, incluindo número de PC, comprimento e orientação, usando software de imagem 3D. Ferramentas de código aberto dedicadas e livremente disponíveis, como o Ilastik28, uma ferramenta de análise de imagem baseada em aprendizado de máquina, bem como o pacote de plugin CiliaQ em Fiji/ImageJ29 são altamente úteis para a segmentação automática de PC, permitindo análises qualitativas e quantitativas subsequentes da biogênese do PC e função no controle versus condições patológicas.

Figure 1
Figura 1: Geração e caracterização de rosetas neurais 2D. Caracterização imunohistoquímica de estruturas de roseta neural usando (A) anticorpos SOX2 e PAX6 para detectar AP, (B) TBR2/EOMES para revelar IP, e (C) CTIP2 para manchar neurônios neocorticais de nascimento precoce. A AP que prolifera a proliferação é detectada com anticorpos fosfo-vimentina e TPX2 e estão localizadas na superfície apical (D,D'). O PC é revelado por imunostaining duplo com anticorpos PCNT e ARL13B. O PC estende-se de cada AP para o lúmen central de cada roseta, enquanto eles também são detectados em IP e neurônios de nascimento precoce (E,E',E''). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: NSPCs isolados derivados de rosetas neurais 2D abrigam PC funcional. A dissociação de rosetas neurais 2D dá origem a NSPCs isolados que abrigam PC após a fome por 48 h, como revelado por ARL13B e PCNT imunostaining (A). Os NSPCs abrigam pc funcional, conforme revelado pela quantificação RT-PCR de dois genes alvo SHH GLI1 e PTCH1 após a fome por 48 h e posterior ativação da via por tratamento com SHH recombinante (rSHH) por 24 h. Os dados de expressão GLI1 e PTCH1 foram realizados em triplicado e normalizados para dados de expressão ACTB . Os dados foram analisados com o método 2−ΔΔCt e apresentados como expressão relativa ± SEM (teste de Mann Whitney) (B). Análise if em NSPCs famintos com (D) ou sem (C) tratamento rSHH para testar a dinâmica de dois atores cruciais da via de sinalização SHH, GLI2 e GPR161, que respectivamente acumulam ou saem do PC após a ativação da via SHH. Combinando ferramentas Ilastik e CiliaQ para a análise de imagens confocal, a intensidade do sinal GPR161 (F) e GLI2 (G) dentro do PC foi comparada em NSPCs tratados +/rSHH. A coloração ARL13B foi utilizada para segmentação de PC, e como o comprimento esperado do PC foi inalterado em NSPCs tratados +/rSHH (E). Os dados são resumidos em parcelas de caixa e whisker (valores médios ± SEM). p < 0,0001 (teste de Mann Whitney). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Geração e caracterização de organoides forebraína dorsais. (A) Visão geral esquemática do protocolo para gerar organoides de cérebro dorsal. (B) Imagens representativas de campo brilhante de organoides nos dias 1, 3, 7, 24 e 42 de diferenciação. Imagens confocal de 20 μm criosections de organoides nos dias 42 (C) e 70 (D) após imunosmunagem com SOX2, Anticorpos TBR2 e CTIP2 delineando, respectivamente, a zona ventricular (VZ), a zona subventricular (SVZ) contendo IP positivo TBR2 e a região semelhante ao preplate (CP) contendo neurônios neocortical positivos CTIP2. Imagens confocal de 20 μm criosections de organoides nos dias 42 (E) e 70 (F) após imunosmunhagem com anticorpos PAX6, CTIP2 e SATB2 mostrando o aparecimento de neurônios satb2 positivos no final do dia 70. Imagens confocal de 20 μm criosections de um organoide no dia 42 após imunosmunhagem com anticorpos ARL13B e PCNT revelando PC no polo apical de progenitores gliais radiais (G) enquanto eles também estão presentes em neurônios positivos CTIP2 (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem 3D de organoides de prepúdio dorsal. (A) Aquisição de folha de luz de um organoide de cérebro dorsal inteiro (Dia 42) manchado com PAX6, N-CADH, e anticorpos CTIP2 mostrando os múltiplos loops neuroepitelianos com progenitores gliais gliais gliais positivos PAX6 exibindo polaridade apicobasal correta, como revelado pelo acúmulo de N-Cadherin em seu lado apical e neurônios neocorticais de néclica positivos CTIP2 delineando uma região semelhante ao prepolato. (B) Aquisição de folha de luz de um organoide de cérebro dorsal inteiro (Dia 42) manchado com anticorpos TPX2, P-Vim e CTIP2 ilustrando a migração nuclear intercinética de progenitores gliais radiais ventriculares. (C) Zoom na aquisição de folha de luz de um organoide de cérebro dorsal inteiro (Dia 42) manchado com anticorpos TPX2 e P-Vim mostrando um progenitor estendendo um processo basal único e localizado na zona subventricular, que lembra um progenitor glial radial externo. (D) Aquisição do Scanner Ressonante de uma seção de 150 μm de um organoide de antebraína dorsal (Dia 42) manchado com anticorpos PCNT e ARL13B que mostram PC em NSPCs e neurônios neocorticais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Geração e caracterização de modelos baseados em células 2D e 3D hIPS do desenvolvimento do cérebro dorsal para dissecar o envolvimento do PC à fisiopatologia de anomalias corticais cerebrais. as células hIPS são autorizadas a formar corpos embrionários (EBs) em placas de cultura de baixa adesão, e são então incubadas em um meio de indução contendo inibidores duplos SMAD para induzir a diferenciação neuroetodérmica. A adesão de EBs em pratos revestidos de PO/lam permite a geração de estruturas de roseta neural 2D, enquanto a cultura flutuante livre de EBs com posterior incorporação em BMM permite a geração de organoides de forebraína dorsal. A retirada de fatores mitogênicos do meio de roseta neural aderente promove o aparecimento de neurogênese que pode ser testada pela análise IF. A dissociação de rosetas neurais aderentes permite a geração de culturas isoladas de NSPC úteis para biogênese de PC e análise de funções. Os organoides de forebraína dorsal são coletados após 4, 6 ou 10 semanas de diferenciação e fixados para análises imunostainantes subsequentes, seja em toto, em seções de 150 μm de espessura, ou 20 crioseções de μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Aquisição de folha de luz de um organoide de cérebro dorsal inteiro (Dia 42) imunossumado com anticorpos PAX6, CTIP2 e NCADH. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Aquisição de folha de luz de um órgão de cérebro dorsal inteiro (Dia 42) imunossumado com anticorpos TPX2, P-VIM e CTIP2. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Aquisição de folha de luz de um organoide de cérebro dorsal inteiro (Dia 42) imunossumado com anticorpos PCNT e ARL13B. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Aquisição confocal de varredura ressonante de uma seção de 150 μm de um organoide de cérebro dorsal (Dia 42) imunossumítida com anticorpos ARL13B e PCNT. Clique aqui para baixar este vídeo.

ARQUIVOS SUPLEMENTARES: Clique aqui para baixar as Tabelas.

Tabela suplementar 1: Receita das mídias utilizadas para a geração de rosetas 2D-neurais e NSPCs.

Tabela suplementar 2: Receita dos meios utilizados para a geração de organoides forebraína dorsal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O PC é agora considerado como organelas-chave que regulam etapas cruciais durante o desenvolvimento cortical cerebral normal18,19,31, incluindo a expansão e o compromisso do NSPC 8,9,10,11,12, bem como migração neuronal13,14 e sinaptogênese16,17 . Além da análise em modelos animais ou tecidos cerebrais fetais humanos, a geração de modelos de desenvolvimento neocortical altamente inovadores e relevantes do hIPSC derivados do paciente é essencial para dissecar o papel do PC durante o desenvolvimento cortical cerebral normal e patológico.

O protocolo de modelagem baseado em hIPSC 2D detalhado aqui foi adaptado de três grandes publicações20,21,22. A diferenciação neuroepitenelial é induzida pela inibição dupla de SMAD usando inibidores de pequenas moléculas das vias activin/nodal (SB-431542) e BMP (LDN-193189). As células são organizadas em estruturas em forma de roseta contendo NSPCs, bem como neurônios de camada profunda neocortical após 20 dias de diferenciação. Além disso, essas estruturas semelhantes a rosetas mostram polaridade apicobasal correta, migração nuclear intercinética de progenitores apical, bem como PC que se estende de todos os NSPCs e neurônios. Após a dissociação dessas estruturas de roseta, obtém-se uma população homogênea e estável de progenitores corticais21. Quando cultivados à confluência e famintos por 48 h, esses progenitores corticais abrigam PC para o qual a morfologia, número e comprimento podem ser facilmente analisados combinando ilastik28 e pacote de plugin CiliaQ28,29 em Fiji/ImageJ. Além disso, usando citocinas para induzir a via de sinalização SHH, a função do PC também pode ser usada pelo IF para testar a dinâmica de atores cruciais de via de sinalização ao longo do PC, como GLI2, SMO e GPR161. Além disso, ensaios rt-PCR semi-quantitativos permitem o teste da indução da expressão genética alvo shh, incluindo GLI1 e PTCH1, em resposta à ativação da via SHH. Outras vias de sinalização dependentes da função do PC também devem ser testadas, incluindo as vias WNT e IGF2,32,33. Para concluir essa abordagem de modelagem 2D, que reproduz claramente vários aspectos do desenvolvimento normal do córtex cerebral, representa uma ferramenta útil e relevante para testar a biogênese do PC e funcionar em condições normais versus patológicas e deve contribuir para obter mais informações sobre o envolvimento do PC durante o desenvolvimento neocortical.

Complementares às abordagens de modelagem baseadas em hIPSC em 2D, os organoides forebraína dorsal oferecem oportunidades sem precedentes para investigar o desenvolvimento cerebral normal e patológico in vitro, pois recapitulam muitas características e características do córtex cerebral humano em desenvolvimento precoce. Atualmente, são utilizados dois tipos principais de protocolos: os métodos intrínsecos e guiados. O protocolo intrínseco desenvolvido por Lancaster e seus colegas23 conta com a capacidade intrínseca dos IPSCs para auto-organizados com fatores externos mínimos e dá origem a organoides cerebrais contendo rudimentos de regiões cerebrais distintas oferecendo uma oportunidade única para modelar as interações entre diferentes regiões cerebrais. No entanto, a alta variabilidade e heterogeneidade inerentes a essa estratégia de modelagem apresentam desafios significativos de reprodutibilidade. Protocolos de diferenciação organoide guiados permitem a geração de organoides específicos da região cerebral com heterogeneidade mínima24,25,26. Essa abordagem nos permitiu gerar com sucesso organoides de forebraína dorsal com estruturas semelhantes a ventrículos que recapitulam os principais processos do desenvolvimento cortical cerebral humano precoce. A primeira questão crítica é começar com culturas hIPSC de alta qualidade que abrigam grandes colônias regulares que exibem menos de 10% de diferenciação e que foram passagemdas quase uma vez como uma monocamada para adaptar os hIPCs às condições de cultura unicelular. De fato, para limitar a heterogeneidade organoide, um dos maiores desafios no campo, a formação de EBs com tamanho homogêneo é um pré-requisito que implica a necessidade de dissociação das colônias de hIPSC em suspensão unicelular permitindo a semeadura na densidade celular definida. Outro passo crítico é a inclusão de EBs, necessária para suportar estrutura 3D e expansão neuroepitenelial. Favorecemos a inclusão do grupo de cerca de quinze organoides sobre a inclusão individual, mesmo que envolva um passo adicional, a dissociação do BMM. A dissociação de BMM antes da cultura de agitação tem sido demonstrada para reduzir a variabilidade dentro e entre lotes organoides, resultando em maior reprodutibilidade34. Além disso, permite livrar-se de processos celulares que se estendem para o BMM que não são prejudiciais para as seguintes etapas de diferenciação, mas que dificultam a observação de organoides para inspeção de qualidade durante as etapas subsequentes do procedimento. Para melhorar a absorção nutricional e a troca de oxigênio, comparamos a maturação organoide em shakers orbitais e bioreatores giratórios que levaram a resultados semelhantes. Escolhemos, portanto, a opção de agitador orbital, pois permite reduzir significativamente os volumes médios e, portanto, o custo total dos experimentos. É importante ressaltar que use uma incubadora diferente para cultura estacionária e agitada em um agitador orbital para evitar vibrações prejudiciais ao crescimento do HIPSC aderente. Aplicamos com sucesso este protocolo em cinco linhas de controle distintas do HIPSC35 que dão origem a resultados homogêneos garantindo a robustez deste procedimento.

A caracterização desses organoides pode ser alcançada utilizando vários métodos. Para preservar as informações espaciais 3D dentro dos organoides, estabelecemos um protocolo que permite imunossuagem e limpeza de organoides inteiros com posterior aquisição de folhas de luz. Diferentes métodos de compensação surgiram com eficiência dependendo da origem da amostra e espessura36,37. Aqui, criamos um método de compensação simples, rápido e econômico que conta com TDE (2,2'-thiodietanol), um derivado glicol usado anteriormente para limpar cérebro de camundongos e organoides intestinais38,39. A aquisição de organoides imunossutives e liberados foi realizada em um microscópio de folha de luz utilizando um objetivo de 20x imerso em 80% de TDE. Em comparação com outros métodos de aquisição de imagens 3D, a microscopia de folha de luz é de interesse por várias razões: aquisição rápida, boa penetração e fotobleaching reduzido. A otimização da etapa de permeabilização permite alcançar uma penetração eficiente e homogênea de anticorpos, permitindo visualizar corpos basais e axonemes de PC que se estendem de todos os tipos progenitores e células neuronais de todo o organoide. Além disso, a aquisição de seções de óleo de 150 μm de espessura de flutuação livre usando um microscópio confocal de varredura ressonante invertido com 40x (NA 1.3) ou 63x (NA 1.4) objetivos de óleo permite ganhar ainda mais em resolução, preservando um grau significativo de informações espaciais 3D, permitindo análises qualitativas e quantitativas de biogênese e função do PC.

A combinação desses modelos 2D e 3D baseados em células e análise de imagem 3D (Figura 5) em hIPSCs gerados pela reprogramação das células do paciente ciliopatia ou pelo uso da tecnologia CRISPR/CAS9 para editar especificamente genes centrosomais ou ciliares deve permitir progressos significativos na compreensão da contribuição do PC durante o desenvolvimento normal e patológico do córtex cerebral. É importante ressaltar que a tecnologia de edição de genomas também permite resgatar especificamente mutações de pacientes para obter hIPSCs de controle isogênico para superar a heterogeneidade genética que desafia a detecção de mecanismos de doença. Além disso, abordagens genômicas unicelulares são agora amplamente utilizadas em todo o campo e representam abordagens relevantes e complementares à análise imunossulínica. Assim, apesar de algumas limitações e dificuldades inerentes a todas as tecnologias emergentes, e que estão sendo extensivamente abordadas, tais modelos baseados em hIPSC 2D e 3D e os métodos de caracterização que apresentamos aqui oferecem ferramentas poderosas e relevantes para dissecar o envolvimento do PC nos mecanismos patológicos subjacentes às anomalias neocorticais do desenvolvimento humano.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subvenções da Agence Nationale de la Recherche (ANR) para S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). A LB é apoiada pelo programa AnR under Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) e pelo Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). O Instituto Imagine é apoiado pelo financiamento estatal da ANR no âmbito do programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, projetos CrossLab) e como parte do segundo programa Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM) ThermoFisher Scientific 31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), serum free ThermoFisher Scientific 17504044
CellAdhere Dilution Buffer StemCell Technologies 7183
DMEM/F-12, Glutamax ThermoFisher Scientific 31331028
DMSO ATCC 4-X
Dorsomorphin StemCell Technologies 72102
Easy Grip 35 10mm Falcon 353001
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020
EGF , 25µg Thermofischer PHG0315
FGF2 , 25µg Thermofischer PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent StemCell Technologies 7174
Insulin ThermoFisher Scientific 12585014
KnockOut Serum ThermoFisher Scientific 10828028
Laminin (1mg) Thermofischer 23017015
LDN193189 StemCell Technologies 72147
Matrigel Growth Factor Reduced Corning 354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
Mowiol 4-88 Sigma Aldrich 81381-250G
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
Neural Basal Medium Thermofischer 21103049
Orbital shaker Dutscher 995002
PBS ThermoFisher Scientific 14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PFA 32% Electron Microscopy Sciences 15714
Poly-L-Ornithine (PO) Sigma P4957
Recombinant human BDNF 10 µg Stem Cell Technologies 78005
Recombinant Human FGF-basic Peprotech 100-18B
rSHH R&D Systems 8908-SH
SAG Santa Cruz Sc-202814
SB431542 StemCell Technologies 72232
Stembeads FGF2 StemCulture SB500
Sucrose Sigma Aldrich S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Supplément N2- (100X) ThermoFisher Scientific 17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol Sigma Aldrich 166782-500G
Vitronectin StemCell Technologies 7180
Y-27632 StemCell Technologies 72304
Primary Antibodies
ARL13B Abcam Ab136648 1/200e
ARL13B Proteintech 17711-1-AP 1/500e
CTIP2 Abcam Ab18465 1/500e
GLI2 R&D Systems AF3526 1/100
GPR161 Proteintech 13398-1-AP 1/100
N-Cadherin BD Transduction Lab 610921 1/500e
P-Vimentin MBL D076-3 1/500e
PAX6 Biolegend PRB-278P 1/200e
PCNT Abcam Ab4448 1/1000e
S0X2 R&D Systems MAB2018 1/200e
SATB2 Abcam Ab51502 1/200e
TBR2 Abcam Ab216870 1/400e
TPX2 NovusBio NB500-179 1/500e
γTUBULIN Sigma Aldrich T6557 1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher Scientific A21206 1/500e
Goat anti-mouse AF555 ThermoFisher Scientific A21422 1/500e
Goat anti-mouse AF647 ThermoFisher Scientific A21236 1/500e
Goat anti-rat AF555 ThermoFisher Scientific A21434 1/500e

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Tags

Biologia do Desenvolvimento Questão 181 cílio primário células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem hIPSCs células neurais e progenitoras desenvolvimento cortical cerebral humano rosetas neurais organoides de cérebro dorsal modelos baseados em 2D e hIPSC de desenvolvimento neocortical organoides cerebrais ouriço sônico imunostensão integral limpeza óptica microscópio
Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., … More

Boutaud, L., Michael, M., Banal, C., Calderon, D., Farcy, S., Pernelle, J., Goudin, N., Maillard, C., Dimartino, C., Deleschaux, C., Dupichaud, S., Lebreton, C., Saunier, S., Attié-Bitach, T., Bahi-Buisson, N., Lefort, N., Thomas, S. 2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development. J. Vis. Exp. (181), e62667, doi:10.3791/62667 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter